ROCHA, F. R. Análise molecular da prevalência dos genes beta-lactamases blaCTX-M, blaSHV e blaTEM em Klebsiella pneumoniae isoladas de pacientes com diagnóstico de infecção hospitalar na Santa Casa de Misericórdia de Sobral, Ceará. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2015. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T12:47:17Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_frrocha.pdf: 1459850 bytes, checksum: 6a734a21f99b3793158529da7ea38c47 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T12:49:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_frrocha.pdf: 1459850 bytes, checksum: 6a734a21f99b3793158529da7ea38c47 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_frrocha.pdf: 1459850 bytes, checksum: 6a734a21f99b3793158529da7ea38c47 (MD5) Previous issue date: 2015 / Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative bacillus responsible for a significant portion of urinary tract infections, respiratory, and bloodstream of adults in hospitals, besides infections in neonates in intensive care units. Its importance has increased due the emergence of extended-spectrum beta-lactamase-producing strains (ESBLs). These enzymes mediate resistance to oxyimino-β-lactams. In K. pneumoniae, most of the identified ESBLs are of the TEM, SHV, and CTX-M types. In addition, carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases of KPC and GES types has been detected in these isolates. Outbreaks of nosocomial infections caused by multidrug-resistant K. pneumoniae clones have been described in various regions of the country. However, this is the first report of the genetic characterization of ESBL-producing K. pneumoniae in the state of Ceará, Brazil. This study aimed firstly to detect the main genes responsible for ESBL production in K. pneumoniae strains obtained from patients who developed nosocomial infections in a tertiary support hospital in the northern region of the Ceará state, from November 2013 to August 2014 and, secondly, to analyze the genetic similarity of these isolates. Thirty-six clinical isolates of ESBL-producing K. pneumoniae were evaluated. The detection of blaCTX-M groups 1 and 2, blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-like, and blaGES-like genes was performed by PCR. Molecular typing of isolates was performed by pulsed-field gel electrophoresis PFGE. Groups 1 or 2 blaCTX-M and blaSHV-like genes were detected in 100% of the isolates and blaTEM-like genes in 55.6%. In addition, 55.6% of CTX-M-producers also produced SHV and TEM. No blaKPC-like and blaGES-like genes were detected. Molecular typing by PFGE showed great diversity between the isolates, although two isolates collected in different wards showed the same banding profile and had the same bla genes and so were considered to belong to a single strain. Detection of blaCTX-M genes in 100% of the isolates suggests that CTX-M enzymes are the major ESBLs responsible for the beta-lactam resistance phenotypes of the studied isolates. Data presented in this study call attention to an endemic resistance problem caused by multiclonal strains of multidrug-resistant K. pneumoniae whose control passes essentially the improvement of antimicrobial prescription policies and the implementation of prevention and control programs the spread of these pathogens in the studied hospital. / Klebsiella pneumoniae é um bacilo gram-negativo responsável por uma parcela significativa de infecções do trato urinário, respiratório e corrente sanguínea de adultos em hospitais, além de infecções em recém-nascidos em unidades de terapia intensiva. Sua importância tem aumentado devido ao surgimento de cepas produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL). Estas enzimas medeiam resistência aos oxyimino-β-lactâmicos. Em K. pneumoniae, a maioria das ESBL identificadas são dos tipos TEM, SHV e CTX-M. Em adição, β-lactamases que hidrolisam carbapenêmicos dos tipos KPC e GES tem sido detectadas nestes isolados. Surtos de infecção hospitalar causados por clones de K. pneumoniae multiressistentes tem sido descritos em várias regiões do país. No entanto, este é o primeiro relato de caracterização genética de isolados de K. pneumoniae produtores de ESBL no estado do Ceará, Brasil. Este estudo teve como objetivo, em primeiro lugar, detectar os principais genes responsáveis pela produção de ESBL em cepas de K. pneumoniae obtidas a partir de pacientes que desenvolveram infecções hospitalares em um hospital de cuidados terciários na região norte do estado do Ceará, de novembro de 2013 a agosto de 2014 e, em segundo lugar, analisar a similaridade genética destes isolados. Trinta e seis isolados clínicos de K. pneumoniae produtores de ESBL foram avaliados. A detecção dos genes blaCTX-M dos grupos 1 e 2, blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-like e blaGES-like foi realizada por PCR. A tipagem molecular dos isolados foi realizada por Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). Os genes blaCTX-M dos grupos 1 ou 2 e blaSHV-like foram detectados em 100% dos isolados e os genes blaTEM-like em 55,6%. Em adição, 55,6% dos produtores de CTX-M também produziram SHV e TEM. Nenhum gene blaKPC-like e blaGES-like foi detectado. A tipagem molecular por PFGE mostrou grande diversidade entre os isolados, contudo dois isolados coletados em diferentes clínicas mostraram o mesmo perfil de bandas e tinham os mesmos genes bla e, então, foram considerados como pertencentes a uma única cepa. A detecção dos genes blaCTX-M em 100% dos isolados sugere que as enzimas CTX-M são as principais ESBL responsáveis pelo fenótipo de resistência aos beta-lactâmicos nos isolados estudados. Dados apresentados neste estudo chamam atenção para um problema de resistência endêmico causado por cepas multiclonais de K. pneumoniae multirresistentes cujo controle passa essencialmente pelo aprimoramento das políticas de prescrição de antimicrobianos e pela implantação de programas de prevenção e controle da disseminação destes patógenos no hospital pesquisado.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4868_1.pdf: 953580 bytes, checksum: 30f8d7e6ee8c034d2c9fd4e760ecf3e3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / As beta-lactamases de espectro estendido estão em expansão mundial, conferindo em isolados clínicos importantes fenótipos de multi-resistencia em bactérias que abrigam estas enzimas. Pacientes com infecção urinária (ITU) são principalmente infetados pelas E. coli e K. pneumoniae, que são as principais produtoras das ESBLs (beta-lactamases de espectro estendido). Neste trabalho, nós analisamos a presença de ESBL produzidas pela E. coli e K. pneumoniae em isolados de ITU de origem nosocomial e em comunidade. Padrões de suscetibilidade e a presença de genes de ESBL para SHV, TEM e CTX foram estudados em amostras de ESBL positivas. Os resultados mostraram que as cepas produtoras de ESBL estavam presentes em 25% das amostras de ITU nosocomiais e 9.3% nas de comunidade. As ESBLs esteve presente em 12.2 e 18.2% dos isolados de E. coli e de K.pneumoniae, respectivamente. Foram descobertos genes de ESBL em isolados de origem nosocomial e em comunidade. Todos os isolados que carregam os genes de ESBL apresentaram fenótipos de multi-resistência que alertam à necessidade de vigilância contínua nas ITU

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo998_1.pdf: 1609980 bytes, checksum: 24a98edce3674f14a6034cad4970277e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal de Pernambuco / Klebsiella pneumoniae é uma enterobactéria associada a infecções hospitalares graves que acomete principalmente, o trato urinário e respiratório, causando também meningite e septicemia, particularmente, em pacientes imunocomprometidos. O objetivo desse trabalho foi caracterizar geneticamente isolados clínicos de K. pneumoniae através da investigação dos genes de resistência a β-lactâmicos blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaKPC, blaVIM, blaIMP e blaSPM, do perfil plasmidial e da ERIC-PCR. Foram analisados 24 isolados clínicos de K. pneumoniae provenientes de hospital público e de um hospital particular nos anos de 2007 e 2008, respectivamente, da cidade de Recife-PE. O Teste de sinergia de disco duplo, o Teste de Hodge Modificado e o E-Test MBL foram aplicados para detecção fenotípica de ESBLs, KPC e MBL, respectivamente. Todos os isolados apresentaram o gene blaSHV, 62,5% blaCTX-M, 29% blaTEM. Dentre os isolados do Hospital particular 71% apresentaram blaKPC e 50% blaVIM. Este é o primeiro relato do gene blaVIM em K. pneumoniae em Recife-PE, Brasil. Os genes blaIMP e blaSPM não foram detectados. O achado de 14 isolados (58%) carreando no mínimo 3 dentre os 7 genes de β-lactamases pesquisados é preocupante, uma vez que não é frequentemente relatado. O perfil plasmidial, agrupou os isolados em 17 grupos e 3 subgrupos. A ERIC-PCR classificou os isolados em 19 perfis distintos com 6 isolados apresentando o mesmo perfil, mostrando relação clonal. Podemos concluir que os isolados estudados acumularam determinantes de resistência que, consequentemente, impõem uma limitação nas opções terapêuticas disponíveis, podendo explicar muitos episódios de insucesso na tentativa de controle das infecções hospitalares

Le biofilm est défini comme une communauté microbienne adhérant à une surface biotique ou abiotique, et engluée dans une matrice extracellulaire auto-produite. Les biofilms naturels sont composés de plusieurs espèces microbiennes et leurs interactions, qu'elles soient synergiques ou antagonistes, jouent un rôle important dans le développement, la composition et le fonctionnement des consortia impliqués. De plus, ces relations impliquent souvent la production de molécules antagonistes limitant la croissance ou l'adhésion bactérienne. Enfin la composition de la matrice extracellulaire joue un rôle important dans la robustesse du biofilm. Au cours de ce travail, l'étude des interactions au sein de biofilms mixtes constitués par K. pneumoniae et S. epidermidis a permis d'isoler un polysaccharide produit par K. pneumoniae, capable d'inhiber l'adhésion aux surfaces abiotiques de plusieurs autres espèces bactériennes à Gram-négatif et à Gram-positif. La caractérisation physico-chimique de cette molécules de haut poids moléculaire a permis de mettre en évidence qu'elle était composée de galactose, glucose, rhamnose et d'acide glucuronique. Par ailleurs, l'analyse d'extraits de mutants déficients pour la production de capsule a montré que ce polysaccharide correspondait à la capsule de K. pneumoniae. Son mode d'action consisterait à inhiber les interactions initiales entre bactéries et surface. Le suivi dans le temps de la formation de biofilm monospecies par K. pneumoniae avec la technique Biofilm Ring Test® a également permis de mettre en évidence un phénotype original. En effet, la détection initiale d'agrégats bactériens est suivie par une modification apparente de leur structure, qui serait liée à des changements de leur robustesse face aux forces d'aimantation magnétique. La présence d'ADN extracellulaire au sein de la matrice du biofilm pourrait jouer un rôle dans la survenue de ce phénotype comme l'indique les mesures effectuées en présence de l'enzyme DNAse I. En parallèle, l'observation de biofilm formés par K. pneumoniae dans des modèles expérimentaux cinétiques a mis en évidence des décrochements massifs de biomasse au cours de la maturation du biofilm, qui pourraient être corrélées aux modifications internes de robustesse de la matrice. L'ensemble de ces données permet de mieux caractériser les interactions intimes survenant à l'intérieur de biofilms constitués par K. pneumoniae et à terme de mieux caractériser et donc prévenir leur formation et dissémination. / Biofilms are defined as microbial communities adhering to biotic or abiotic surfaces and embedded in a self-produced extracellular matrix. Natural biofilms are composed of several microbial species and their interactions, synergistic or antagonistic, play important roles in development, composition and functioning of the consortia. Furthermore, the relationships often involve the production of antagonist molecules that impair competitors' growth or adhesion. The composition and evolution of the extracellular matrix plays also an important role in the biofilms' robustness. In this work, study of the interactions within biofilms formed by K. pneumoniae and S. epidermidis led to the isolation of a polysaccharide produced by K. pneumoniae able to inhibit the adherence to abiotic surfaces of several Gram-negative and Gram-positive bacterial species. The physico-chemical characterization of this high molecular weight molecule showed it was composed of galactose, glucose, rhamnose and glucuronic acid. This data, together with the analysis of extracts from capsule-deficient mutants, indicated that the capsule of K. pneumoniae was responsible for the biofilm inhibition phenotype, probably by inhibiting the initial interactions between bacteria and surface. By monitoring the formation of monospecies biofilm by K. pneumoniae with the Biofilm Ring Test® technique, we were able to detect an original phenotype. Indeed, detection of bacterial aggregates still occurred after a few hours of incubation but in a different way, probably related to changes of the biofilm robustness towards magnetic forces. The presence of extracellular DNA in the matrix of the biofilm is likely to play a role in the occurrence of this phenotype, as indicated by the assays performed in presence of the enzyme DNase I. At the same time, observations of biofilm formed by K. pneumoniae in kinetic experimental models showed massive detachment events during biofilm maturation, which could be correlated to changes in internal strength of the matrix. All these dtat contribute to a better characterization of the intimate interactions occuring within biofilms formed by K. pneumoniae and will ultimately lead to the development of efficient anti-biofilm strategies.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Klebsiella pneumoniae à um bacilo gram-negativo responsÃvel por uma parcela significativa de infecÃÃes do trato urinÃrio, respiratÃrio e corrente sanguÃnea de adultos em hospitais, alÃm de infecÃÃes em recÃm-nascidos em unidades de terapia intensiva. Sua importÃncia tem aumentado devido ao surgimento de cepas produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL). Estas enzimas medeiam resistÃncia aos oxyimino-β-lactÃmicos. Em K. pneumoniae, a maioria das ESBL identificadas sÃo dos tipos TEM, SHV e CTX-M. Em adiÃÃo, β-lactamases que hidrolisam carbapenÃmicos dos tipos KPC e GES tem sido detectadas nestes isolados. Surtos de infecÃÃo hospitalar causados por clones de K. pneumoniae multiressistentes tem sido descritos em vÃrias regiÃes do paÃs. No entanto, este à o primeiro relato de caracterizaÃÃo genÃtica de isolados de K. pneumoniae produtores de ESBL no estado do CearÃ, Brasil. Este estudo teve como objetivo, em primeiro lugar, detectar os principais genes responsÃveis pela produÃÃo de ESBL em cepas de K. pneumoniae obtidas a partir de pacientes que desenvolveram infecÃÃes hospitalares em um hospital de cuidados terciÃrios na regiÃo norte do estado do CearÃ, de novembro de 2013 a agosto de 2014 e, em segundo lugar, analisar a similaridade genÃtica destes isolados. Trinta e seis isolados clÃnicos de K. pneumoniae produtores de ESBL foram avaliados. A detecÃÃo dos genes blaCTX-M dos grupos 1 e 2, blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-like e blaGES-like foi realizada por PCR. A tipagem molecular dos isolados foi realizada por Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE). Os genes blaCTX-M dos grupos 1 ou 2 e blaSHV-like foram detectados em 100% dos isolados e os genes blaTEM-like em 55,6%. Em adiÃÃo, 55,6% dos produtores de CTX-M tambÃm produziram SHV e TEM. Nenhum gene blaKPC-like e blaGES-like foi detectado. A tipagem molecular por PFGE mostrou grande diversidade entre os isolados, contudo dois isolados coletados em diferentes clÃnicas mostraram o mesmo perfil de bandas e tinham os mesmos genes bla e, entÃo, foram considerados como pertencentes a uma Ãnica cepa. A detecÃÃo dos genes blaCTX-M em 100% dos isolados sugere que as enzimas CTX-M sÃo as principais ESBL responsÃveis pelo fenÃtipo de resistÃncia aos beta-lactÃmicos nos isolados estudados. Dados apresentados neste estudo chamam atenÃÃo para um problema de resistÃncia endÃmico causado por cepas multiclonais de K. pneumoniae multirresistentes cujo controle passa essencialmente pelo aprimoramento das polÃticas de prescriÃÃo de antimicrobianos e pela implantaÃÃo de programas de prevenÃÃo e controle da disseminaÃÃo destes patÃgenos no hospital pesquisado. / Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative bacillus responsible for a significant portion of urinary tract infections, respiratory, and bloodstream of adults in hospitals, besides infections in neonates in intensive care units. Its importance has increased due the emergence of extended-spectrum beta-lactamase-producing strains (ESBLs). These enzymes mediate resistance to oxyimino-β-lactams. In K. pneumoniae, most of the identified ESBLs are of the TEM, SHV, and CTX-M types. In addition, carbapenem-hydrolyzing beta-lactamases of KPC and GES types has been detected in these isolates. Outbreaks of nosocomial infections caused by multidrug-resistant K. pneumoniae clones have been described in various regions of the country. However, this is the first report of the genetic characterization of ESBL-producing K. pneumoniae in the state of CearÃ, Brazil. This study aimed firstly to detect the main genes responsible for ESBL production in K. pneumoniae strains obtained from patients who developed nosocomial infections in a tertiary support hospital in the northern region of the Cearà state, from November 2013 to August 2014 and, secondly, to analyze the genetic similarity of these isolates. Thirty-six clinical isolates of ESBL-producing K. pneumoniae were evaluated. The detection of blaCTX-M groups 1 and 2, blaSHV-like, blaTEM-like, blaKPC-like, and blaGES-like genes was performed by PCR. Molecular typing of isolates was performed by pulsed-field gel electrophoresis PFGE. Groups 1 or 2 blaCTX-M and blaSHV-like genes were detected in 100% of the isolates and blaTEM-like genes in 55.6%. In addition, 55.6% of CTX-M-producers also produced SHV and TEM. No blaKPC-like and blaGES-like genes were detected. Molecular typing by PFGE showed great diversity between the isolates, although two isolates collected in different wards showed the same banding profile and had the same bla genes and so were considered to belong to a single strain. Detection of blaCTX-M genes in 100% of the isolates suggests that CTX-M enzymes are the major ESBLs responsible for the beta-lactam resistance phenotypes of the studied isolates. Data presented in this study call attention to an endemic resistance problem caused by multiclonal strains of multidrug-resistant K. pneumoniae whose control passes essentially the improvement of antimicrobial prescription policies and the implementation of prevention and control programs the spread of these pathogens in the studied hospital.

Introducción: El aumento progresivo de las tasas de resistencia en bacterias uropatógenas, así como su propagación se ha convertido en un gran problema a nivel mundial, cobrando mayor importancia la diseminación de aislamientos resistentes productores de ß-lactamasas de espectro extendido, por lo que son útiles la caracterización molecular de plásmidos y otros elementos genéticos de las bacterias para establecer la relación genética que existe entre ellas y tener datos epidemiológicos relevantes que nos puedan sugerir la dirección de propagación de este tipo de resistencia. Objetivo: Describir los perfiles plasmídicos en aislamientos de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae productoras de ß-lactamasas de espectro extendido recuperados de urocultivos en el servicio de Microbiología del Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN). Diseño: Estudio descriptivo, observacional de corte transversal. Institución: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición CIBN-UNMSM; Instituto Nacional de Salud del Niño Participantes: Aislamientos de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae durante Noviembre y Diciembre del 2012 en el servicio de Microbiología del Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN). Intervenciones: Extracción de ADN plasmídico de E. coli y de K. pneumoniae, detección de perfiles plasmídicos mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y tinción con bromuro de etidio. Principales medidas de resultados: Análisis de los patrones de huella de los perfiles plasmídicos obtenidos usando el programa NTSYSpc 2.1 y el algoritmo de agrupamiento UPGMA. Resultados. En las muestras analizadas se detectaron diferentes patrones electroforéticos obteniéndose de 1 hasta 7 bandas por muestra y en total 15 bandas de distinto tamaño, las cuales variaron desde 1.5 kb hasta más de 20 kb. Teniendo en cuenta los patrones de similitud, los aislamientos estudiados se distribuyeron en diferentes agrupamientos o ramas. Conclusión: No se encontró una similitud genética marcada entre los aislamientos de origen comunitario y de origen hospitalario, por lo que no se podría establecer una relación significativa y determinar un origen común entre los mismos. / --- Background: The progressive increase in resistance rates in uropathogenic bacteria and their spread have become in a significant worldwide public health, becoming more important the spread of resistant isolates producing of extended spectrum ß-lactamases, which are useful the molecular characterization of plasmids and other genetic elements of the bacteria to establish the genetic relationship between them, to have relevant epidemiological data that we can suggest the direction of propagation of this type of resistance. Objetive: Determine the plasmid profiles in isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing of extended spectrum ß-lactamases recovered from urine cultures in the service of Microbiology of National Institute of Child Health (NICH). Design: Descriptive, observational cross-sectional study. Institution: Biochemestry and Nutrition Investigation Center CIBN-UNMSM; National Institute of Child Health. Participants: Isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae during November and December of 2012 in the service of Microbiology of National Institute of Child Health. Interventions: Extraction of plasmid DNA from E. coli and K. pneumoniae, detection of plasmid profiles by electrophoresis gel of 0.8% agarose and staining of DNA fragments was carried out using ethidium bromide and they were visualized by UV-Trans illumination, the analysis of fingerprint patterns of plasmid profiles obtained using the NTSYSpc 2.1 program and the UPGMA clustering algorithm. Results: Were detected different electrophoretic patternsin the samples, obtained from 1-7 bands per sample and a total of 15 bands of different sizes, which varied from 1.5 kb to more than 20 kb. Considering the patterns of similarity, the isolates analyzed were distributed into different clusters or branches. Conclusion: The determination of plasmid profiles proved to be a sensitive and reliable technique for the analysis of genetic diversity isolates of E. coli and K. pneumoniae from the National Institute of Child Health. Key words: Plasmid profiles, E. coli, K. pneumoniae, extended spectrum ß- lactamases.

Les carbapénèmes, β-lactamines possédant le spectre d’activité le plus large, sont souvent la dernière option thérapeutique des infections sévères dues à des germes multi-résistants. Les entérobactéries résistantes aux carbapénèmes, bien que rares en France, sont épidémiques voir même endémiques dans de nombreux pays. Cette résistance est principalement due à la production d’enzymes, les carbapénèmases, comme les enzymes de type KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) dont il existe plusieurs variants. Les souches produisant ces enzymes ont rapidement disséminé dans de nombreuses régions du monde. Les objectifs de ce travail étaient de comprendre les mécanismes moléculaires de la multi-résistance aux antibiotiques des souches productrices de KPC et de déterminer lesfacteurs génétiques responsables de leur diffusion. Nous avons montré que le gène blaKPC est associé à un transposon de type Tn3, le transposon Tn4401, dont il existe trois isoformes.Nous avons aussi montré que Tn4401 est un transposon actif, capable de mobiliser le gèneblaKPC, et qui participe également à l’expression de ce gène par apport de séquencespromotrices. Puis, nous avons étudié une collection de souches de Klebsiella pneumoniae et de Pseudomonas aeruginosa exprimant le gène blaKPC. Nous avons ainsi montré que plusieurs clones de K. pneumoniae diffusent actuellement dans différentes régions du monde, avec unclone majoritaire, le clone ST258. Ces clones se caractérisent par des plasmides différents etpar la présence constante de Tn4401. Nous avons montré que plusieurs clones de P.aeruginosa disséminent dans les hôpitaux de Colombie et sont associés à des structuresgénétiques variables encadrant le gène blaKPC. Enfin, nous avons évalué une nouvelle méthode de détection des souches productrices de BLSE et de carbapénèmases, basée sur une puce à ADN. Cet outil s’est révélé rapide, sensible et spécifique pour tous les gènes recherchés. / Carbapenems are β-lactams with the broadest spectrum of activity and are often the last therapeutic option for treating severe infections due to multi-resistant organisms.Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae remain rare in France, but are endemic in someareas. Carbapenem-resistance is mainly due to the production of carbapenemases, such as KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase). Several variants of KPC enzymes have beenidentified and KPC-producers are increasingly isolated worldwide. The aim of this study wasto determine the molecular mechanisms involved in multi-resistance of KPC-producers and tocharacterize the genetic elements involved in blaKPC gene mobilization and diffusion. Wehave described a new Tn3-based transposon, Tn4401, and characterized three isoforms. We have demonstrated that Tn4401 is an active transposon, capable of mobilizing blaKPC, and isinvolved in blaKPC gene expression. We have analysed several Klebsiella pneumoniae andPseudomonas aeruginosa isolates harboring the blaKPC-2 gene. We have assessed the spread ofseveral clones of K. pneumoniae isolates, including a major clone, ST258. These clones arecharacterized by different plasmids but an identical genetic structure, Tn4401. We havedemonstrated that several clones of P . aeruginosa are disseminating in Colombia, differingby MLST type, genetic support of blaKPC-2 and Tn4401-like structures. Finally, we have evaluated a new commercial system, based on microarray and dedicated to the identification of ESBL- and carbapenemase-producers. We found this method fast, sensitive and specific.

KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) são -lactamases da classe A de Ambler globalmente disseminadas, com 10 variantes, sendo predominates KPC-2 e KPC-3. O objetivo deste trabalho foi estudar a genética e epidemiologia molecular de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos isoladas no Brasil. Sessenta e quatro enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram analisadas: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) e 1 Citrobacter freundii (Cf), de diferentes pacientes, em seis hospitais e em duas distintas regiões do Brasil. Identificação e testes de sensibilidade antimicrobiana foram realizados por sistemas semi-automáticos e métodos padronizados. A relação clonal foi estabelecido por Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e também por tipagem por sequenciamento de multilocus no caso de K. pneumoniae. A presença de genes que codificam carbapenemases e -lactamases de espectro estendido foi pesquisada. A caracterização de blaKPC-2, do ambiente genético e de plasmídeos incluiu PCR e sequenciamento, análises de RFLP, S1-PFGE e hibridação. Os isolados Kp corresponderam a 5 pulsotipos, por PFGE, ligados a 6 tipos de sequência (ST): KPA-ST258 (n = 51 com 6 subtipos), KpA6-ST11 (n = 1), KPB-ST327 (n = 1), KPC-ST44 (n = 2), KPD-ST437 (n = 1) e KPE-ST48 (n = 1). Ecl foram agrupados em clones e e, Sm e Cf representam um clone cada. Todos os isolados foram resistentes aos -lactâmicos, sensíveis à colistina e tigeciclina e mostraram fenótipos variáveis contra aminoglicosídeos, quinolonas, nitrofurantoína e sulfametoxazol-trimetoprim. Heterorresistência a carbapenêmicos foi observada para isolados de Kp e Cf, conforme relatado anteriormente com produtores de KPC-2 e VIM. Esse estudo relata a disseminação do gene blaKPC-2 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro facilitada por clones de K. pneumoniae pertencentes ao globalmente disseminado Complexo Clonal CC258 (ST258, ST437 e ST11) e uma diversidade de plasmídeos (IncFII-KpA, IncN-Kp e Ecl, IncL/M-Sm e Cf e, dois plasmídeos não-tipáveis carreando Tn4401a ou Tn4401b) disseminados com sucesso entre as enterobactérias. Constitui também a primeira descrição do ST258 no Brasil associada a um surto em um hospital universitário da cidade de Ribeirao Preto. Este trabalho apontou a alta diversidade de elementos genéticos disponíveis abrigando blaKPC-2. Isso poderia ampliar enormemente a disseminação desse gene no Brasil como também no continente. / KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) are globally spread -lactamases of the Ambler class A comprising 10 variants, KPC-2 and KPC-3 being predominant. The objective of this work was study the genetic and molecular epidemiology of carbapenem resistant-enterobacterial isolates in Brazil. Sixty-four carbapenem resistant isolates were analyzed: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) and 1 Citrobacter freundii (Cf) from different patients at six hospitals in two different Brazilian regions. Identification and antimicrobial susceptibility testing were accomplished by using semiautomatic systems and standard methods. Clonal relatedness was established by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) and also by multilocus sequence typing in the case K. pneumoniae isolates. The presence of genes encoding carbapenemases and extended spectrum -lactamases was searched. Characterization of blaKPC-2, genetic environment and plasmids included PCR and further sequencing, RFLP analyses, S1-PFGE and hybridization. The Kp isolates corresponded to 5 PFGE types linked to 6 sequence types (ST): KpA-ST258 (n=51 comprising 6 subtypes), KpA6-ST11 (n=1), KpB-ST327 (n=1), KpC-ST44 (n=2), KpD-ST437 (n=1) and KpE-ST48 (n=1). Ecl isolates were grouped in and clones and, Sm and Cf represent one clone each. All isolates were resistant to -lactams, susceptible to colistin and tigecycline and showed variable phenotype against aminoglycosides, quinolones, nitrofurantoin and trimethoprim-sulfamethoxazole. Heteroresistance to carbapenems was observed for Kp and Cf isolates, as previously reported to KPC-2 and VIM producers. This study reports the spread of blaKPC-2 in Sao Paulo and Rio de Janeiro states facilitated by globally spread CC258-K. pneumoniae clones (ST258, ST11, ST437) and a diversity of plasmids (IncFII-KpA, IncN-Kp and Ecl, IncL/M-Sm and Cf and, two untypeable plasmids carrying Tn4401a or Tn4401b) successfully disseminated among Enterobacteriaceae species. It also constitutes the first description of ST258 in Brazil which was associated with a hospital outbreak in Ribeirao Preto city. This work pointed out the high diversity of available genetic elements harboring blaKPC-2. This might greatly amplify the dissemination of KPC genetic in Brazil and within of the South America continent.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Plasmídios são DNA extracromossômicos, com capacidade de se duplicarem de forma independente das células que os albergam, e são responsáveis pela expressão de uma variedade de características, como fatores de virulência. O material do presente estudo se constituiu da cepa receptora E. coli K12-R23, e de cepas de Klebsiella pneumoniae e de Escherichia coli, doadoras de plasmídios R e transconjugantes. O objetivo do presente estudo foi analisar os fenótipos conferidos em cepas transconjugantes de ambas bactérias pela transferência de plasmídios R de cepas doadoras para a receptora. Para a análise dos fenótipos, utilizaram-se, nas cepas do estudo, algumas variáveis: sensibilidade a antimicrobianos e a ERO, aderência a células HEp-2, e formação de slime e de biofilme. O marcador da presença de plasmídio, neste trabalho, foi a presença de resistênca à gentamicina nas cepas doadoras. Os resultados indicaram que houve transferência de plasmídio, pois as cepas transconjugantes de K. pneumoniae e de E. coli apesentaram este marcador (foram resistentes à gentamicina); além disso, as cepas transconjugantes mostraram perfis distintos da receptora em relação à sensibilidade aos antimicrobianos, às ERO, aos padrões de aderência às células HEp-2 e à formação de slime, apesar de a formação de biofilme nestas cepas não ter sofrido modificações. Observou-se, contudo, que várias características das cepas doadoras não foram encontradas nas cepas transconjugantes de E. coli e de K. pneumoniae. / Plasmids are extrachromosomal DNA that have the ability to duplicate independently of the host cells. Plasmids are responsible for the expression of a variety of characteristics of the cells, such as virulence factors. The present study utilized a receptor strain of E. Coli K12-R23 and strains of Klebsiella pneumoniae and E. coli which were R plasmids donor strains and transconjugant ones. The objective of this study was to analyze the attributed phenotypes of transconjugant strains in both bacteria caused by transference of R plasmids from the donor strains to the receptor ones. In order to analyze these phenotypes, the following variables were selected: sensitivity to antimicrobials and ROS, adherence to HEp-2 cells, and slime and biofilm structures. The marker of the presence of plasmids was gentamycin resistance in the donor strains. The observed results indicated that there was plasmid transfer; given that Klebsiella pneumoniae and E. coli strains presented the marker (e.g. they became resistant to gentamycin). Moreover, transconjugant strains have showed distinct profiles from the receptor strain concerning sensitivity to antimicrobials, ROS, adherence patterns to HEp-2 cells and slime structure. On the other hand, the biofilm structure of these strains did not present modifications. Yet, it was observed that several characteristics of the donor strains were not found in the transconjugant strains of E. coli and K. pneumoniae.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Plasmídios são DNA extracromossômicos, com capacidade de se duplicarem de forma independente das células que os albergam, e são responsáveis pela expressão de uma variedade de características, como fatores de virulência. O material do presente estudo se constituiu da cepa receptora E. coli K12-R23, e de cepas de Klebsiella pneumoniae e de Escherichia coli, doadoras de plasmídios R e transconjugantes. O objetivo do presente estudo foi analisar os fenótipos conferidos em cepas transconjugantes de ambas bactérias pela transferência de plasmídios R de cepas doadoras para a receptora. Para a análise dos fenótipos, utilizaram-se, nas cepas do estudo, algumas variáveis: sensibilidade a antimicrobianos e a ERO, aderência a células HEp-2, e formação de slime e de biofilme. O marcador da presença de plasmídio, neste trabalho, foi a presença de resistênca à gentamicina nas cepas doadoras. Os resultados indicaram que houve transferência de plasmídio, pois as cepas transconjugantes de K. pneumoniae e de E. coli apesentaram este marcador (foram resistentes à gentamicina); além disso, as cepas transconjugantes mostraram perfis distintos da receptora em relação à sensibilidade aos antimicrobianos, às ERO, aos padrões de aderência às células HEp-2 e à formação de slime, apesar de a formação de biofilme nestas cepas não ter sofrido modificações. Observou-se, contudo, que várias características das cepas doadoras não foram encontradas nas cepas transconjugantes de E. coli e de K. pneumoniae. / Plasmids are extrachromosomal DNA that have the ability to duplicate independently of the host cells. Plasmids are responsible for the expression of a variety of characteristics of the cells, such as virulence factors. The present study utilized a receptor strain of E. Coli K12-R23 and strains of Klebsiella pneumoniae and E. coli which were R plasmids donor strains and transconjugant ones. The objective of this study was to analyze the attributed phenotypes of transconjugant strains in both bacteria caused by transference of R plasmids from the donor strains to the receptor ones. In order to analyze these phenotypes, the following variables were selected: sensitivity to antimicrobials and ROS, adherence to HEp-2 cells, and slime and biofilm structures. The marker of the presence of plasmids was gentamycin resistance in the donor strains. The observed results indicated that there was plasmid transfer; given that Klebsiella pneumoniae and E. coli strains presented the marker (e.g. they became resistant to gentamycin). Moreover, transconjugant strains have showed distinct profiles from the receptor strain concerning sensitivity to antimicrobials, ROS, adherence patterns to HEp-2 cells and slime structure. On the other hand, the biofilm structure of these strains did not present modifications. Yet, it was observed that several characteristics of the donor strains were not found in the transconjugant strains of E. coli and K. pneumoniae.