Les carbapénèmes, β-lactamines possédant le spectre d’activité le plus large, sont souvent la dernière option thérapeutique des infections sévères dues à des germes multi-résistants. Les entérobactéries résistantes aux carbapénèmes, bien que rares en France, sont épidémiques voir même endémiques dans de nombreux pays. Cette résistance est principalement due à la production d’enzymes, les carbapénèmases, comme les enzymes de type KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase) dont il existe plusieurs variants. Les souches produisant ces enzymes ont rapidement disséminé dans de nombreuses régions du monde. Les objectifs de ce travail étaient de comprendre les mécanismes moléculaires de la multi-résistance aux antibiotiques des souches productrices de KPC et de déterminer lesfacteurs génétiques responsables de leur diffusion. Nous avons montré que le gène blaKPC est associé à un transposon de type Tn3, le transposon Tn4401, dont il existe trois isoformes.Nous avons aussi montré que Tn4401 est un transposon actif, capable de mobiliser le gèneblaKPC, et qui participe également à l’expression de ce gène par apport de séquencespromotrices. Puis, nous avons étudié une collection de souches de Klebsiella pneumoniae et de Pseudomonas aeruginosa exprimant le gène blaKPC. Nous avons ainsi montré que plusieurs clones de K. pneumoniae diffusent actuellement dans différentes régions du monde, avec unclone majoritaire, le clone ST258. Ces clones se caractérisent par des plasmides différents etpar la présence constante de Tn4401. Nous avons montré que plusieurs clones de P.aeruginosa disséminent dans les hôpitaux de Colombie et sont associés à des structuresgénétiques variables encadrant le gène blaKPC. Enfin, nous avons évalué une nouvelle méthode de détection des souches productrices de BLSE et de carbapénèmases, basée sur une puce à ADN. Cet outil s’est révélé rapide, sensible et spécifique pour tous les gènes recherchés. / Carbapenems are β-lactams with the broadest spectrum of activity and are often the last therapeutic option for treating severe infections due to multi-resistant organisms.Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae remain rare in France, but are endemic in someareas. Carbapenem-resistance is mainly due to the production of carbapenemases, such as KPC (Klebsiella pneumoniae Carbapenemase). Several variants of KPC enzymes have beenidentified and KPC-producers are increasingly isolated worldwide. The aim of this study wasto determine the molecular mechanisms involved in multi-resistance of KPC-producers and tocharacterize the genetic elements involved in blaKPC gene mobilization and diffusion. Wehave described a new Tn3-based transposon, Tn4401, and characterized three isoforms. We have demonstrated that Tn4401 is an active transposon, capable of mobilizing blaKPC, and isinvolved in blaKPC gene expression. We have analysed several Klebsiella pneumoniae andPseudomonas aeruginosa isolates harboring the blaKPC-2 gene. We have assessed the spread ofseveral clones of K. pneumoniae isolates, including a major clone, ST258. These clones arecharacterized by different plasmids but an identical genetic structure, Tn4401. We havedemonstrated that several clones of P . aeruginosa are disseminating in Colombia, differingby MLST type, genetic support of blaKPC-2 and Tn4401-like structures. Finally, we have evaluated a new commercial system, based on microarray and dedicated to the identification of ESBL- and carbapenemase-producers. We found this method fast, sensitive and specific.

Le combat contre les infections bactériennes reste un enjeu majeur de santé publique notamment avec la dissémination des Entérobactéries productrices de carbapénèmases, capables d’hydrolyser l’ensemble des β-lactamines. On assiste à l’émergence de certains clones épidémiques, se distinguant par leur distribution mondiale, leur forte transmissibilité et leur capacité à persister chez les patients. L’exemple le plus parlant est le cas du clone de Klebsiella pneumoniae appartenant au « sequence type » (ST) 258 et responsable de la diffusion mondiale de la carbapénèmase KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) portée majoritairement par des plasmides de la famille InFIIk. Les raisons du succès de ce clone et de l’association KPC/IncFIIk/ST258 ne sont pas encore totalement élucidées. Par ailleurs, il n’existe pas de corrélation entre le niveau d’expression d’une carbapénèmase, la sensibilité in vitro de la souche vis à vis des carbapénèmes et l’efficacité clinique d’un traitement par ces molécules. Les phénomènes d’héterorésistance aux carbapénèmes sont fréquents chez les souches produisant KPC, mais l’impact clinique est inconnu. Les mécanismes de régulation de l’expression des carbapénèmases ne sont pas élucidés.Les objectifs de cette thèse résident dans l’analyse des facteurs génétiques associés à la diffusion et la persistance de clones multi-résistants ainsi que l’analyse de l’expression des β-lactamases associées.La première partie de ce travail porte sur l’analyse de l’évolution in vivo d’une souche de K. pneumoniae ST258 produisant KPC ayant persisté chez un patient pendant près de 5 ans. L’analyse comparative des génomes provenant de 17 isolats a permis de mettre en évidence une diversification génétique importante ainsi que la sélection de mutations modifiant la virulence de la souche et sa sensibilité aux antibiotiques. Afin de caractériser les raisons du succès de certains plasmides portant KPC, une analyse transcriptomique d’une souche de Escherichia coli TOP10 transformée par un plasmide multi-réplicon IncFIIk-IncFIB exprimant KPC-2, a été réalisée en présence ou non d’imipénème. Les gènes les plus exprimés dans ces conditions sont les gènes de résistance aux antibiotiques et certains gènes essentiels à la réplication du plasmide. La présence d’imipénème affecte peu la transcription des gènes plasmidiques mais induit un stress oxydatif important dans l’ensemble de la souche. Par ailleurs, l’analyse de l’expression du gène blaKPC-2 dans différentes espèces par 5’-RACE a permis de révéler que ce gène de résistance est sous la dépendance de plusieurs promoteurs, dont la force diffère selon le fond génétique. Cette caractéristique pourrait expliquer le succès de certains isoformes du transposon Tn4401 permettant une meilleure expression du gène blaKPC-2, dans certaines espèces. Les outils développés dans cette thèse ont également été appliqués à l’analyse d’un clone d’Enterobacter kobei ST125 dont la céphalosporinase naturelle ACT-28 possède une activité d’hydrolyse accrue vis à vis de l’imipénème. Enfin, l’analyse du génome de la première souche Shewanella sp. produisant une BLSE de type CTX-M-15 a permis de révéler la présence d’un nouveau variant oxacillinase chromosomique avec activité carbapénèmase, appelé OXA-535. OXA-535 est proche d’OXA-436, un autre variant carbapénèmase porté par un plasmide ayant déjà disséminé chez les Entérobactéries. L’analyse de l’environnement génétique des gènes blaOXA-535 et blaOXA-436 confirme le rôle du genre Shewanella comme progéniteur des carbapénèmases de classe D. Ce travail contribue à une meilleure compréhension de la diffusion de certains clones multi-résistants et des mécanismes contrôlant l’expression des gènes de résistance aux β-lactamines. / Multidrug resistant bacteria and in particular carbapenemase-producing Enterobacteriaceae remain a major health public challenge. Some successful clones are emerging globally, due to their high transmissibility and their ability to colonize and persist in patients over time. Genomic analyses revealed that the dissemination of KPC carbapenemase is closely related to the spread of Klebsiella pneumoniae of the sequence-type (ST) 258 and to few successful plasmids linked to IncFIIk family. However, the reasons of the association between K. pneumoniae ST258, IncFIIk plasmids and KPC that led to the rapid spread of this clone are currently unknown.Furthermore, there is no correlation between expression level of a carbapenemase-encoding gene, in vitro susceptibility to carbapenems and efficiency of a carbapenem-based treatment. Most of the time, KPC-producing K. pneumoniae exhibit a heteroresistant phenotype with carbapenems, but its clinical impact remains unknown. The mechanisms underlying the regulation of carbapenemases expression remain to be explored.The objectives of the thesis are to obtain deeper insights into genomic plasticity of carbapenemase–producing clones, and into the expression of their β-lactamases.The first part of this work was dedicated to the in vivo evolution of a single strain of KPC-producing K. pneumoniae ST258 that colonized a patient for almost 5 years. Genomic comparison of 17 isolates revealed a remarkable diversification with occurrence of several mutations with impact on bacterial virulence and susceptibility to antibiotics.Several studies extensively described the genetic structures of blaKPC-carrying plasmids, but information regarding gene expression at the whole plasmid level are lacking. Accordingly, we performed RNA-seq on Escherichia coli TOP10 transformed with an IncFIIk-IncFI blaKPC-2-carrying plasmid, with or without imipenem exposure. In both conditions, plasmid-encoded genes related to antimicrobial resistance and involved in plasmid replication were the most expressed. Imipenem exposure led to a more general response with overexpression of E. coli numerous chromosome-encoded genes involved in oxidative stress response. In addition, analysis of blaKPC-2 gene expression in several species using 5’RACE revealed the presence of several promoters whose strength depends on the bacterial genetic background. This could promote higher expression of blaKPC-2 gene and explain the association of some isoforms of Tn4401 in different species. The tools developed in the frame of this work were also applied to study a single Enterobacter kobei ST125 clone whose natural cephalosporinase (ACT-28) has increased hydrolytic activity towards imipenem. Finally, genomic analysis of the first ESBL-producing Shewanella sp. was performed. It revealed the presence of blaCTX-M-15 and blaSHV-2 genes carried on an IncA/C plasmid and a new chromosomally-encoded oxacillinase variant of OXA-48 with carbapenemase activity, called OXA-535. OXA-535 was found to be closely related to OXA-436, another carbapenemase which has recently spread in Enterobacteriaceae. Analysis of the genetic environment of both blaOXA-48-like genes confirmed the role of Shewanella spp. as progenitors of class D carbapenemases.Overall, this work contributes to a better comprehension of the diffusion of multi-drug resistant clones and of the mechanisms implicated in β-lactamase expression.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2014. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-02T13:00:36Z No. of bitstreams: 1 2014_ManuellaRodriguesDeSouzaMello.pdf: 681269 bytes, checksum: 245580771537987e3030e85ea75ecfa7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-02T13:01:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ManuellaRodriguesDeSouzaMello.pdf: 681269 bytes, checksum: 245580771537987e3030e85ea75ecfa7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-02T13:01:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ManuellaRodriguesDeSouzaMello.pdf: 681269 bytes, checksum: 245580771537987e3030e85ea75ecfa7 (MD5) / O recente aparecimento de bactérias produtoras de enzimas carbapenemases representa um problema de saúde pública relacionado com a ineficiência no tratamento de infecções nosocomiais. Além do aumento de isolados humanos, muitas pesquisas apontam o crescente número de bactérias multirresistentes não somente em ambientes hospitalares, mas também em isolados de animais, ambientes e afluentes. Entretanto, estudos direcionados para o potencial zoonótico ainda são limitados. O objetivo do presente estudo foi identificar cepas de Enterobacteriaceae e P. aeruginosa produtores de enzimas carbapenemases circulantes em ambientes veterinários. Foram isoladas 17 amostras provenientes de clínicas veterinárias e submetidas ao teste de difusão em disco com imipenem, ertapenem e meropenem. 11 cepas sugestivas da presença de carbapenemases, com halo ≤22 mm no antibiograma, foram submetidas ao Teste de Hodge Modificado. Todas as amostras foram negativas para o teste de Hodge Modificado. Apesar de não ter sido detectada fenotipicamente a expressão da enzima carbapenemase, a resistência aos carbapenêmicos pode estar relacionada a outro mecanismo de resistência adquirido. Portanto, considerando os crescentes relatos da disseminação de carbapenemases, em especial a KPC, o mapeamento das áreas onde bactérias multirresistentes estão presentes é vital para a elaboração de medidas de controle e manutenção da salubridade da população. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The recent emergence of bacteria producing carbapenemase enzyme represents a public health issue related to the inefficiency in the treatment of nosocomial infections. In addition to the increased human isolates, current studies indicate the increasing number of multidrug-resistant bacteria not only in hospital settings, but also present in isolates from animals, common areas and affluents. However, studies on the zoonotic potential are still limited. The aim of this study was to identify strains of Enterobacteriaceae and P. aeruginosa producing carbapenemase enzymes in veterinary environments. 17 samples from veterinary clinics were isolated and examined through the disk diffusion test with imipenem, meropenem and ertapenem. 11 strains suggesting of the presence of carbapenemase with halo ≤ 22 mm on antibiograma were submitted to the modified Hodge test. All samples were negative for the modified Hodge test. Despite the expression of carbapenemase enzyme has not been phenotypically detected, the carbapenem resistance may be related to another mechanism of acquired resistance. Therefore, considering the increasing reports of the spread of carbapenemases, especially KPC, the mapping of areas where multidrug-resistant bacteria are present is vital for the development of control measures and maintenance of the population health.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11077_Dissertação (Jaqueline).pdf: 1705529 bytes, checksum: 66e1c6ab289307aa3361141c2baf7187 (MD5) Previous issue date: 2017-04-12 / Infecções hospitalares causadas por bactérias resistentes a múltiplos antimicrobianos (MDR) são uma ameaça global à saúde pública e resultam no aumento da falha terapêutica e das taxas de mortalidade. Dentro da família Enterobacteriaceae, Klebsiella pneumoniae produtora da carbapenemase KPC é o principal patógeno responsável por essas infecções e é alvo de grande preocupação devido seu alto potencial de disseminação. Para reduzir o atraso na terapia adequada e implementar as medidas de controle é essencial a detecção acurada deste mecanismo de resistência. Entretanto, isso representa um desafio para os laboratórios de microbiologia, pois os pontos de corte clínico recomendados pelos manuais de referência não são capazes de detectar todos os isolados produtores de carbapenemase e nenhum dos testes indicados como confirmatórios possuem 100% de sensibilidade e especificidade. O objetivo do estudo foi verificar a acurácia dos métodos e critérios interpretativos propostos pelos manuais Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e Brazilian Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (BrCAST) para detecção da produção de carbapenemase em 47 amostras clínicas de K. pneumoniae carreadora do gene blaKPC. A susceptibilidade aos carbapenêmicos e os critérios de seleção das amostras para realização dos métodos confirmatórios empregados (Teste de Hodge Modificado e Teste de sinergismo com inibidores) foram avaliada através dos métodos de difusão a partir do disco (DD) e da determinação da concentração mínima inibitória utilizando os critérios interpretativos de ambos os manuais. Todas as amostras apresentaram fenótipo MDR. Os resultados indicaram que os pontos de corte clínico associados aos pontos de corte de triagem propostos pelo BrCAST mostraram melhor desempenho em selecionar corretamente as amostras de K. pneumoniae carreando o gene blaKPC para os testes confirmatórios. Para garantir maior acurácia é crucial seguir estritamente o preconizado uso dos três carbapenêmicos e, além disso, foi observado que o método de DD seguindo os critérios do manual brasileiro foi o único capaz de selecionar corretamente todas as amostras para os testes confirmatórios. Ambos os testes fenotípicos foram capazes de detectar produção de carbapenemase nas mesmas 40 amostras e em 7 amostras os resultados nesses testes foram negativos apesar da presença do gene blaKPC.

The rapid spread of carbapenem-resistant lineages of Klebsiella pneumoniae, clustered within the clonal group CG258, is a growing public health problem associated with healthcareassociated infections. The objective of this study was to perform a genomic analysis of KPC-2 and/or CTX-M β-lactamase-producing strains of K. pneumoniae belonging to CG258 (ST11, ST258, ST340, ST437) circulating at the human-animal-environment interface, in Brazil and South America. The analysis was conducted to characterize the antimicrobial resistome, virulome, genetic elements of transfer and mobilization associated with the dissemination of the blaKPC-2 gene, and to perform a detailed comparative genomic analysis of the CG258; with subsequent pathogenicity evaluation in an invertebrate (Galleria mellonella) model of infection, aiming to identify biomarkers of virulence. The main results are presented in the format of six manuscripts. Manuscript I: New draft genome sequence of a Klebsiella pneumoniae strain 1194/11, belonging to ST340, showing a wide resisto-me. Manuscript II: The first draft genome sequence of a Klebsiella pneumoniae 606B ST340 carrying blaCTX-M-15 in food-producing animal isolated in Brazil. Manuscript III: The first draft genome sequence of a Klebsiella pneumoniae strain Kp171, recovered from a water sample collected in an urban river in Brazil, demonstrating that anthropogenic activities, including the release of wastewater and sewage from hospitals, may have contributed to the contamination of aquatic environments, raising a concern to public health. Manuscript IV: Identification and complete sequence analysis of an IncX3 plasmid carrying a non-Tn4401 genetic element (NTEKPC-Ic), originating from a hospital associated lineage of K. pneumoniae ST340, showing the spread of blaKPC-2 in new Incompatibility group. Manuscript V: Dissemination of blaKPC-2 in novel non-Tn4401 Element (NTEKPC-IId) carry by new small IncQ1 and Col-Like plasmids in lineages of Klebsiella pneumoniae ST11 and ST340. Manuscript VI: Yersiniabactin, colibactin and wider resistome contribute to enhanced virulence and persistence of KPC-2-producing K. pneumoniae CG258 in South America. The results obtained in the present study allow us to obtain a first genomic landscape of K. pneumoniae lineages of the CG258, circulating at the human-animal-environment interface, in Brazil and South America. In this regard, most likely the interplay of yersiniabactin and/or colibactin, and resistance to clinically significant antibiotics (as carbapenems and polymyxins) are contributing to the emergence of highly virulent and MDR lineages that pose great risk to human health. On the other hand, the wide antimicrobial resistome (antibiotics, disinfectants and heavy metals) could be contributing to adaptation of KPC-2- and/or CTX-M-producing K. pneumoniae CG258 in the human-animal-environment interface, highlighting the urgent need for enhanced control efforts. In conclusion, these findings could contribute to the development of strategies for prevention, diagnosis and treatment of K. pneumoniae infections. / A rápida disseminação de linhagens de Klebsiella pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos, agrupadas dentro do grupo clonal GC258, e um crescente problema de saúde pública associado com infecções relacionadas a assistência a saúde. O objetivo deste estudo foi realizar uma análise genômica de cepas de K. pneumoniae produtoras de β-lactamases KPC-2 e/ou CTX-M, pertencentes ao GC258 (ST11, ST258, ST340, ST437), circulando na interface humana-ambiente-animal, no Brasil e na América do Sul. A análise foi direcionada para caracterizar o resistoma e viruloma, elementos genéticos de transferência e mobilização associados com a disseminação de genes blaKPC-2, e realizar uma análise de genômica comparativa detalhada do GC258, com posterior avaliação da patogenicidade em modelo invertebrado (Galleria mellonella) de infecção, visando identificar biomarcadores de virulência. Os principais resultados são apresentados na forma de seis manuscritos. Manuscrito I: Nova sequência \"draft\" do genoma de K. pneumoniae 1194/11isolado de amostra clínica, pertencente ao ST340, mostrando um amplo resistoma. Manuscrito II: O reporte da primeira sequência \"draft\" do genoma de K. pneumoniae 606B (ST340), contendo blaCTX-M-15 em animais de produção isolados no Brasil. Manuscrito III: O primeiro esboço da sequência do genoma de K. pneumoniae Kp171, recuperado de uma amostra de água coletada em um rio urbano no Brasil, demonstrando que atividades antrópicas, incluindo a liberação de esgoto e esgoto de hospitais, podem ter contribuído para a contaminação ambientes aquáticos, levantando uma preocupação para a saúde pública. Manuscripto IV: Identificação e análise de sequencia completa de um plasmídeo IncX3 portador de um elemento genético não Tn4401 (NTEKPC-Ic), originado de uma linhagem hospitalar associada a K. pneumoniae ST340, mostrando a disseminação de blaKPC-2 no novo grupo Incompatibilidade. Manuscrito V: Disseminação de blaKPC-2 no novo elemento non-Tn4401 (NTEKPC-IId) portado por novos pequenos plasmídeos IncQ1 e Col-Like em linhagens de K. pneumoniae ST11 e ST340. Manuscrito VI: Os resultados obtidos no presente estudo permitem gerar um panorama genômico das linhagens de K. pneumoniae do GC258, circulando na interface humana-animal-ambiente, no Brasil e na América do Sul. De principal interesse, a convergência da virulência associada com genes codificando yersiniabactina e/ou a colibactina e a resistência a antibióticos clinicamente significativos (como carbapenemicos e polimixinas), estão contribuindo para o aparecimento de linhagens altamente virulentas e multirresistentes que apresentam um grande risco a saúde humana. Por outro lado, a ampla resistência aos antimicrobiana (antibióticos, desinfetantes e metais pesados) poderia estar contribuindo para a adaptação de estirpes de K. pneumoniae do GC258, produtoras de KPC-2- e/ou CTX-M, na interface humana-ambiente-animal, destacando a necessidade urgente de medidas para o controle de disseminação. Em conclusão, esses achados poderiam contribuir para o desenvolvimento de estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento das infecções por K. pneumoniae.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:11:26Z No. of bitstreams: 1 POLYANA SILVA PEREIRA.pdf: 2183990 bytes, checksum: f5a2198904653af5e6ed94add64d6d4e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:11:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 POLYANA SILVA PEREIRA.pdf: 2183990 bytes, checksum: f5a2198904653af5e6ed94add64d6d4e (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Klebsiella pneumoniae é um patógeno Gram-negativo da família Enterobacteriaceae, frequentemente associado às infecções. Isolados clínicos de K. pneumoniae usualmente apresentam resistência a classe dos beta-lactâmicos, devido a produção de carbapenemase do tipo KPC. Além da resistência a todos os beta-lactâmicos disponíveis, a KPC possui alta capacidade de disseminação, pois tem sido descrita em plasmídios associados à transposons (Tn4401). Foi descrita inicialmente nos EUA, e atualmente se tornou uma ameaça global. A sua primeira descrição no Brasil ocorreu em 2006 e desde então sua incidência tem crescido significativamente. Assim, o objetivo desse trabalho foi analisar o polimorfismo genético, determinar o perfil de resistência a antimicrobianos, identificar o plasmídio carreador e a região flanqueadora do gene blaKPC de 165 amostras de K.pneumoniae produtoras de KPC provenientes de doze estados Brasileiros (AL, AM, CE, DF, ES, GO, MG, MA, PE, PI, RJ e SC) no período de 2006 a 2010. A confirmação da produção de KPC e identificação da variante alélica foram realizadas por PCR e sequenciamento. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi determinada através de difusão em ágar (CLSI, 2011) e determinação da CIM por Etest® (ANVISA N°1/2010). PFGE e MLST foram utilizados para a análise epidemiológica. Avaliação da região flanqueadora do gene blaKPC foi realizada através de PCR para detecção do Tn4401. A identificação do plasmídio carreador do gene blaKPC foi realizada através de extração plasmidial (Kado e Liu, 1981) e hibridização (Sambrook e Russel, 2001). As amostras foram recuperadas principalmente a partir de sangue (39%) e urina (37%), e todas as cepas produziram KPC-2. Foi observada resistência a ciprofloxacina (95,7%), sulfametoxazol/trimetoprima (84,2%), amicacina (34%) e gentamicina (57%), fosfomicina (7,8%), polimixina B (11%) e tigeciclina (38%). A maioria das cepas se mostrou multirresistente, sendo três resistentes a todas as classes de antimicrobianos testadas. Através de PFGE, encontramos 28 grupos clonais, sendo três mais prevalentes: grupo A (40,6%- ES, RJ, SC e CE); grupo C (23% - CE, DF, MG, GO, PE e RJ); grupo Q (9,7%- AL, ES, DF e PI). Através de MLST, também se observou 28 clones, mostrando boa correlação. Os grupos clonais A/KpRj, C e Q foram designados por MLST como ST437, ST11 e ST340 respectivamente. Através de análise filogenética, observamos três complexos clonais entre nossas amostras: CC11 (ST11, ST340, ST437, ST757, ST855), CC16-17 e CC758-840. O CC11 apresenta grande importância epidemiológica, pois inclui dois STs que têm desempenhado papel de destaque em relação à disseminação do gene blaKPC: ST258 e ST11 (encontrado em nosso trabalho). O gene blaKPC-2 foi encontrado associado ao Tn4401, isoforma “a” em todas as amostras, e associado à plasmídios em 95,3% das amostras. Desses plasmídios, 92% eram de 40kb (IncN) e 8% de 55kb (IncL/M). Dessa forma, acreditamos que em nosso país esteja ocorrendo a disseminação do gene blaKPC tanto devido a dispersão de um mesmo plasmídio de aproximadamente 40kb do grupo de IncN entre cepas de diferentes STs, como também a disseminação de um mesmo complexo clonal (CC11), onde os clones A-KpRJ/ST437 e C/ST11 tem desempenhado importante. / Klebsiella pneumoniae is a Gram-negative pathogen belonging to Enterobacteriaceae family, often associated with infections. Clinical isolates of K. pneumoniae usually show resistance to beta-lactams, due to production of KPC-type carbapenemase. In addition to resistance to all beta-lactams available, this carbapenamase has high capacity to spread, since it has been described in plasmids associated with transposons (Tn4401). KPC was first described in the U.S., and nowadays is considered a global threat. The first description of KPC in Brazil occurred in 2006 and since then its incidence has greatly increased. Thus, the objective of this study was to analyze the genetic polymorphism, determine the antimicrobial resistance profile, and identify the carrier plasmid and the flanking region of the blaKPC gene of 165 KPC-producing K.pneumoniae from twelve Brazilian states (AL, AM, CE, DF, ES, GO, MG, MA, PE, PI, RJ and SC) in the period of years 2006 to 2010. Confirmation of KPC production and identification of the allele variant were performed by PCR and sequencing. The antimicrobial susceptibility was determined by agar diffusion (CLSI, 2011) and MIC determination by Etest® (ANVISA 1/ 2010). PFGE and MLST were used for epidemiological analysis. Evaluation of flanking region surrounding the blaKPC gene was performed by PCR for the detection of Tn4401. The identification of the plasmid carrying the blaKPC gene was performed by plasmid extraction (Kado and Liu, 1981) and hybridization (Sambrook and Russell, 2001). The isolates were mainly recovered from blood (39%) and urine (37%), and all strains produced KPC-2. Resistance was observed to ciprofloxacin (95,7%), sulfamethoxazole/trimethoprim (84.2%), amikacin (34%), gentamicin (57%), fosfomycin (7.8%), polymyxin B (11%) and tigecycline (38%). Most of the strains showed multidrug resistant pattern, and three of them were resistant to all classes of antimicrobials tested. By PFGE, we found 28 clonal groups, three being the most prevalent: group A (40.6% - ES, RJ, SC and EC), group C (23% - CE, DF, MG, GO, RJ and EP); group Q (9.7% - AL, ES, DF and PI). By MLST, we also found 28 profiles, showing good consistency between these two methodologies. The clonal group A/KpRj, C and Q were designated by MLST as ST437, ST11 and ST340 respectively. Phylogenetic analysis showed three clonal complexes: CC11 (ST11, ST340, ST437, ST757, ST855), CC16-17 and CC758-840. The CC11 has great epidemiological importance, because it includes two STs that have been playing a prominent role in the spread of the blaKPC gene: ST258 and ST11 (found in our work). The blaKPC-2 gene was found associated with Tn4401, isoform "a" in all samples, and associated with plasmids in 95.3% of them. Of these plasmids, 92% had 40kb belonging to the IncN group and 8% had 55kb (IncL/M). Thus, we believe that our country is experiencing the spread of the gene blaKPC both associated with the dispersion of a single plasmid of approximately 40kb of the IncN group among strains of different STs, but also by the spread of the same clonal complex (CC11), where the clones A-KpRJ/ST437 and C/ST11 has played an important role.

Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Resumo: A mastite bovina é uma inflamação da glândula mamária, geralmente ocasionada por micro-organismos, que causa grandes prejuízos às fazendas leiteiras, devido ao uso de medicamentos, pagamento aos médicos veterinários, descarte de leite e até do animal e a Escherichia coli é o principal agente etiológico causador da forma clínica dessa doença. Neste trabalho, foram pesquisados genes para a classificação de E. coli diarreiogênica (DEC) ou de E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC), dentro dos grupos filogenéticos, além de genes que codificam fatores de virulência e resistência aos antimicrobianos. Também foram realizados testes de quantificação de produção de biofilme e produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL). Entre os 161 isolados, dois (1,2%) foram classificados como DEC. Considerando-se os genes pesquisados, os mais frequentes foram fimH (160 = 99,3%), traT (126 = 78,3%), ecpA (108 = 67%) e ompT (60 = 37,3%). Em relação aos grupos filogenéticos, a maioria foi classificada nos grupos B1 (52,8%) e A (36,6%). Quanto à produção de biofilme, 68 (42,2%) foram classificadas como não produtoras, 80 (49,7%) como fracas, 11 (6,8%) como moderadas e apenas duas (1,2%) foram fortes produtoras. Apenas dois (1,2%) isolados apresentaram positividade no teste fenotípico de ESBL, com a presença do gene blaCTX-M-15. Considerando-se outros genes de resistência, blaTEM foi encontrado em sete (4,3%) isolados e blaSHV em um (0,6%). Os dois (1,2%) isolados escN+ apresentaram padr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bovine mastitis is an inflammation of the mammary gland, usually caused by microorganisms, which causes great damage to dairy farms, due to the use of medicines, payment to veterinarians, disposal of milk and even the animal and Escherichia coli is the main etiologic agent that causes the clinical form of this disease. In this study, genes were searched for the classification of diarrhogenic E. coli (DEC) or extra-intestinal pathogenic E. coli (ExPEC), within the phylogenetic groups, in addition to genes that encode virulence factors and resistance to antimicrobials. Quantification tests of biofilm production and production of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) were also performed. Among the 161 isolates, two (1.2%) were classified as DEC. Considering the researched genes, the most frequent were fimH (160 = 99.3%), traT (126 = 78.3%), ecpA (108 = 67%) and ompT (60 = 37.3%). Regarding phylogenetic groups, most were classified in groups B1 (52.8%) and A (36.6%). As for the production of biofilm, 68 (42.2%) were classified as non-producing, 80 (49.7%) as weak, 11 (6.8%) as moderate and only two (1.2%) were strong producers. Only two (1.2%) isolates were positive in the ESBL phenotypic test, with the presence of the blaCTX-M-15 gene. Considering other resistance genes, blaTEM was found in seven (4.3%) isolates and blaSHV in one (0.6%). The two (1.2%) escN+ isolates showed a “localized-like” adhesion pattern in HeLa cells and their potential to induce attaching/effacing lesio... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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Atualmente, no Brasil, a produção de enzimas do tipo KPC constitui o principal mecanismo de resistência aos carbapenêmicos em Klebsiella pneumoniae, contribuindo para a endemicidade hospitalar da espécie. No presente estudo, foi caracterizada a produção de KPC em 38 enterobactérias que foram diferençadas entre os grupos CESP (enterobactérias com produção induzida da βlactamase AmpC, ex., Enterobacter spp., Serratia marcescens e Morganella morganii) e não CESP (ex., Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Proteus mirabilis). pertencendo a isolados recuperados de pacientes colonizados e/ou apresentando infecção urinária, pneumonia ou bacteremia, em três centros médicos de três diferentes regiões do Brasil (Amazonas, Mato grosso, Minas Gerais), durante 2008-2013. Os isolados apresentaram resistência para cefalosporinas de amplo espectro (86,8 - 94,7%), cefoxitina (86,8%), ertapenem (89,4%), imipenem (89,4%), meropenem (84,2%), amicacina (86,8%), ciprof1oxacina (84,2%), tigeciclina (42,1 %, CIM50= 2 µg/ml), sulfametoxazol/trimetoprim (SXT, 60,5%) e gentamicina (57,8%). Entre bactérias do grupo CESP, os isolados de S. marcescens apresentaram sensibilidade para fosfomicina (CIM50= 8 µg/mL) e sulfametoxazol-trimetoprim (CIM50= 1/19 µg/mL). A produção de carbapenemase foi confirmada pelo teste de Hodge modificado e por inibição por acido fenil borônico em 76,31 e 73,68% dos isolados do grupo CESP e não CESP, respectivamente. A presença do gene blaKPC-2 foi confirmada em 78,9% dos isolados clinicos e variantes do gene blaCTX-M foram identificados em 57,89% das cepas. Cepas de S. marcescens e E. aerogenes clonalmente relacionadas por ERIC-PCR foram associadas a surtos de infecção nosocomial. Resultados do presente estudo confirmam que a produção de KPC no Brasil, ocorre em uma grande variedade de espécies de enterobactérias sendo frequentemente associada com a co-produção de ESBLs do tipo CTX-M, o que poderia favorecer a endemicidade com o subseqüente estabelecimento de surtos de infecção. Um dado relevante, foi à alta resistência a fosfomicina (66,66%) associada à presença do gene fosA2 em cepas de E. aerogenes e K. pneumoniae produtores de KPC-2. / Currently, in Brazil, the production of KPC-type enzymes is considered the main mechanism of carbapenem resistance in Klebsiella pneumoniae, which has contributed for the nosocomial endemicity of this specie. In this study, the KPC production was characterized in 38 Enterobacteriaceae isolates differenced among CESP (Enterobacteriaceae with inducible production of AmpC-type β-lactamase, i.e., Enterobacter spp., Serratia marcescens and Morganella morganii) and not CESP (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli e Proteus mirabilis) groups recovered from colonized patients and/or with urinary tract infection, pneumonia or bacteremia, in three medicai centers from different regions of Brazil (Amazonas, Mato Grosso, Minas Gerais) during 2011-2013. The isolates were resistant to broad-spectrum cephalosporins (86.8 - 94.7%), cefoxitin (86.8%), ertapenem (89.4%), imipenem (89.4%), meropenem (84.2%), amikacin (86.8%), ciprofloxacin (84.2%), tigecycline (42.1 %, MIC50 = 2 µg/mL), trimethoprim-sulfamethoxazole (SXT, 60.5%) and gentamicin (57.8%). S. Marcescens isolates exhibited additional susceptibility to fosfomycin (MIC50 = 8 µg/mL) and sulfamethoxazole-trimethoprim (MIC50 = 1/19 µg/mL). Carbapenemase production was confirmed by Hodge modified test and inhibition by phenyl boronic acid in 76.31 and 73.68% of CESP and no CESP isolates, respectively. In fact, the presence of the blaKPC-2 gene was confirmed in 78.9% of enterobacterial isolates, whereas blaCTX-M ESBL gene variants were identified in 57.89% of the strains. S. Marcescens and E. aerogenes isolates were clonally related by ERIC-PCR being associated with outbreaks of nosocomial infection. Results of this study confirm that the production of KPC in Brazil occurs in a variety of species of Enterobacteriacea producing CTX-M-rype ESBLs, favoring the endemicity and the establisbment of outbreaks. A relevant finding was the high resistance to fosfomycin (66.66%) associated with the presence of the fosA2 gene in KPC-2-producing E. aerogenes and K. pneumoniae strains.

KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) são -lactamases da classe A de Ambler globalmente disseminadas, com 10 variantes, sendo predominates KPC-2 e KPC-3. O objetivo deste trabalho foi estudar a genética e epidemiologia molecular de enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos isoladas no Brasil. Sessenta e quatro enterobactérias resistentes aos carbapenêmicos foram analisadas: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) e 1 Citrobacter freundii (Cf), de diferentes pacientes, em seis hospitais e em duas distintas regiões do Brasil. Identificação e testes de sensibilidade antimicrobiana foram realizados por sistemas semi-automáticos e métodos padronizados. A relação clonal foi estabelecido por Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) e também por tipagem por sequenciamento de multilocus no caso de K. pneumoniae. A presença de genes que codificam carbapenemases e -lactamases de espectro estendido foi pesquisada. A caracterização de blaKPC-2, do ambiente genético e de plasmídeos incluiu PCR e sequenciamento, análises de RFLP, S1-PFGE e hibridação. Os isolados Kp corresponderam a 5 pulsotipos, por PFGE, ligados a 6 tipos de sequência (ST): KPA-ST258 (n = 51 com 6 subtipos), KpA6-ST11 (n = 1), KPB-ST327 (n = 1), KPC-ST44 (n = 2), KPD-ST437 (n = 1) e KPE-ST48 (n = 1). Ecl foram agrupados em clones e e, Sm e Cf representam um clone cada. Todos os isolados foram resistentes aos -lactâmicos, sensíveis à colistina e tigeciclina e mostraram fenótipos variáveis contra aminoglicosídeos, quinolonas, nitrofurantoína e sulfametoxazol-trimetoprim. Heterorresistência a carbapenêmicos foi observada para isolados de Kp e Cf, conforme relatado anteriormente com produtores de KPC-2 e VIM. Esse estudo relata a disseminação do gene blaKPC-2 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro facilitada por clones de K. pneumoniae pertencentes ao globalmente disseminado Complexo Clonal CC258 (ST258, ST437 e ST11) e uma diversidade de plasmídeos (IncFII-KpA, IncN-Kp e Ecl, IncL/M-Sm e Cf e, dois plasmídeos não-tipáveis carreando Tn4401a ou Tn4401b) disseminados com sucesso entre as enterobactérias. Constitui também a primeira descrição do ST258 no Brasil associada a um surto em um hospital universitário da cidade de Ribeirao Preto. Este trabalho apontou a alta diversidade de elementos genéticos disponíveis abrigando blaKPC-2. Isso poderia ampliar enormemente a disseminação desse gene no Brasil como também no continente. / KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemases) are globally spread -lactamases of the Ambler class A comprising 10 variants, KPC-2 and KPC-3 being predominant. The objective of this work was study the genetic and molecular epidemiology of carbapenem resistant-enterobacterial isolates in Brazil. Sixty-four carbapenem resistant isolates were analyzed: 57 Klebsiella pneumoniae (Kp), 5 Enterobacter cloacae (Ecl), 1 Serratia marcescens (Sm) and 1 Citrobacter freundii (Cf) from different patients at six hospitals in two different Brazilian regions. Identification and antimicrobial susceptibility testing were accomplished by using semiautomatic systems and standard methods. Clonal relatedness was established by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) and also by multilocus sequence typing in the case K. pneumoniae isolates. The presence of genes encoding carbapenemases and extended spectrum -lactamases was searched. Characterization of blaKPC-2, genetic environment and plasmids included PCR and further sequencing, RFLP analyses, S1-PFGE and hybridization. The Kp isolates corresponded to 5 PFGE types linked to 6 sequence types (ST): KpA-ST258 (n=51 comprising 6 subtypes), KpA6-ST11 (n=1), KpB-ST327 (n=1), KpC-ST44 (n=2), KpD-ST437 (n=1) and KpE-ST48 (n=1). Ecl isolates were grouped in and clones and, Sm and Cf represent one clone each. All isolates were resistant to -lactams, susceptible to colistin and tigecycline and showed variable phenotype against aminoglycosides, quinolones, nitrofurantoin and trimethoprim-sulfamethoxazole. Heteroresistance to carbapenems was observed for Kp and Cf isolates, as previously reported to KPC-2 and VIM producers. This study reports the spread of blaKPC-2 in Sao Paulo and Rio de Janeiro states facilitated by globally spread CC258-K. pneumoniae clones (ST258, ST11, ST437) and a diversity of plasmids (IncFII-KpA, IncN-Kp and Ecl, IncL/M-Sm and Cf and, two untypeable plasmids carrying Tn4401a or Tn4401b) successfully disseminated among Enterobacteriaceae species. It also constitutes the first description of ST258 in Brazil which was associated with a hospital outbreak in Ribeirao Preto city. This work pointed out the high diversity of available genetic elements harboring blaKPC-2. This might greatly amplify the dissemination of KPC genetic in Brazil and within of the South America continent.