Hepatitis C, a life threatening disease, caused by the hepatitis C virus (HCV) currently affects over 170-200 million people worldwide (~3% of global human population), more than five times the percentage of total HIV infections. HCV infection has been shown to be a major cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma and is the leading cause of liver transplantation in the U.S. HCV has escaped every therapeutic target to date by means of its error-prone RNA polymerase, which allows it to mutate prolifically. The current standard anti-HCV therapy, which is pegylated interferon a combined with ribavirin, is difficult to tolerate, and more than 50% of HCV patients are refractory to it. No protective vaccine or therapeutic antibody is available, making the need for the development of an efficacious immunoprophylactic and therapeutic agent imperative. HCV is an enveloped virus with a positive sense RNA genome of ~9.6 kilobases (kb), which carries a large open reading frame (ORF), flanked by 5'- and 3'- untranslated regions (UTRs). Interestingly, within the highly mutational HCV RNA, there are a limited number of 100% conserved and functionally vital motifs, located in the 5' UTR, coding region and in the 3' UTR. Within the HCV genome, these motifs have been proposed to be involved in multiple exclusive interactions with each other and furthermore, these interactions have been demonstrated to be essential for HCV replication and/or translation of the viral proteins. / Bayer School of Natural and Environmental Sciences; / Chemistry and Biochemistry / PhD; / Dissertation;

Pour aider à la protection de l’environnement et au diagnostic de maladies, il est nécessaire de disposer de méthodes d’analyse performantes. Ces méthodes doivent être rapides et peu coûteuses afin d’analyser un grand nombre d’échantillons et détecter la présence éventuelle de la molécule recherchée. C’est dans ce cadre qu’un bio-essai à double reconnaissance dédié aux petites molécules a été développé. Il repose sur l’utilisation d’aptamères comme élément de reconnaissance moléculaire et sur la formation de « kissing complex ». Les aptamères sont des oligonucléotides qui possèdent une grande spécificité et une grande affinité pour leur cible. Les « kissing complexes » désignent, quant à eux, l’interaction de deux séquences au niveau de leur boucle apicale. L’objectif de la thèse est de continuer l’étude et l’optimisation de ce schéma d’analyse, puis montrer sa potentialité et sa versatilité. Dans un 1er temps, la détection en multiplexe de plusieurs petites molécules a été mise en place. L’optimisation du système de détection a ensuite été effectuée pour la détection de l’adénosine avec le développement d’une nouvelle stratégie de détection. Enfin, un test colorimétrique basé sur l’utilisation de nanoparticules d’or a été décrit. / Bioanalytical tools based on molecular recognition elements constitute one of the most important strategies used to routinely quantify low molecular weight analytes in biological fluids or environmental matrices as disease-related biomarkers, drugs or toxins/contaminants. Recently, a novel aptamer-based sensing design has been reported. It is based on a dual recognition mechanism that involves the formation of functional nucleic acid architectures, named “kissing complex”. Aptamers are single stranded oligonucleotides that possess high affinity and high selectivity for their target. The aim of this thesis is to pursue the study and the optimization of this sandwich like scheme and to prove its potential. Firstly, the simultaneous detection of multiple small analytes by fluorescence anisotropy using the sandwich like scheme has been reported. Then, this novel bioassay has been optimized through the development of a new strategy. Finally, a gold nanoparticle colorimetric

Le génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est constitué, comme tous les rétrovirus, de deux copies identiques d'ARN génomique. Ce phénomène de dimérisation interfère avec différentes étapes du cycle rétroviral. Il est en outre corrélé aux étapes d'encapsidation de l'ARN génomique et de maturation des particules virales. L'inhibition de la dimérisation représente une nouvelle voie de traitement potentiel du VIH. Ce travail a permis de déterminer par RMN la structure tridimensionnelle de différentes conformations de la séquence SL1 qui joue un rôle clé dans l'initiation de la dimérisation du rétrovirus. Il constitue une première approche dans la compréhension des interactions entre les 2 brins d'ARN de l'ARN génomique de VIH-1Laï lors de l'étape de dimérisation. Ces différentes investigations structurales constituent une base d'étude dans les stratégies de drug design impliquant le développement d'inhibiteurs susceptibles d'interférer avec les sites d'interactions ARN/ARN.

Le génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est constitué, comme tous les rétrovirus, de deux copies identiques d'ARN génomique. Celles-ci sont liées de manière non covalente au niveau de leur région 5'-terminale. Ce phénomène de dimérisation interfère avec différentes étapes clés du cycle rétroviral. C'est pourquoi, l'inhibition de la dimérisation représente une nouvelle voie de traitement potentiel du VIH. La première partie de ce travail porte sur la séquence d'ARN SL1 initiant la dimérisation chez VIH-1Lai. Nous nous sommes intéressés à la détermination structurale, par RMN et modélisation moléculaire, des espèces présentes dans le processus de dimérisation sous forme instable. Après avoir isolé les deux différents dimère d'ARN, nous avons mis en évidence la structure du dimère stable qui permet d'avancer des hypothèses quant à leur stabilité relative. La seconde partie de ce travail porte sur l'étude du fragment désoxyribose de SL1. Là encore, deux conformères de stabilité différente sont isolables. Le dimère instable s'organise sous forme de “kissing-complex” et représente la première structure de ce type élucidée pour un ADN. La structure du dimère stable demeure de type “kissing-complex” bien que présentant des différences à l'origine du changement de stabilité. La présence du groupement hydroxyle distinguant l'ADN de l'ARN explique cette différence de comportement. Ces investigations structurales constituent une solide base d'étude dans les stratégies de “drug-design” impliquant le développement d'inhibiteurs susceptibles d'interférer avec le phénomène de dimérisation.

La biochimie médicale est une discipline en constante évolution. L’enjeu du développement de nouvelles techniques est de permettre l’analyse à haut débit, de manière spécifique et à faible coût. Les techniques d’immunoanalyse omniprésentes en laboratoire de biologie médicale (LBM) répondent convenablement à ces critères, mais sont cependant perfectibles en ce qui concerne l’analyse des petites molécules d’intérêt biologique. L’objectif de ce travail est de développer des méthodes de dosage innovantes, pour les petites molécules, en utilisant les aptamères comme nouveaux outils de reconnaissance moléculaire. Il s’agit d’oligonucléotides fonctionnels simple brin, capables de reconnaître de manière spécifique une cible, isolés à partir d’une banque de candidats par une approche combinatoire in vitro nommée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Ils sont en concurrence avec les anticorps, en particulier dans le domaine du diagnostic. Nous avons dans un premier temps travaillé sur le développement de systèmes de dosage à double reconnaissance pour petite molécule, impliquant la formation d’un complexe boucle-boucle. L’adénosine et la théophylline ont tout d’abord servi de cibles modèles pour le développement en phase hétérogène d’une technique de dosage colorimétrique avec amplification enzymatique du signal. Le développement a ensuite été axé sur un analyte ayant un réel intérêt biologique, l’arginine-vasopressine. Le système a été développé en phase homogène en utilisant la technique d’anisotropie de fluorescence. L’application en milieu biologique a été facilitée par l’utilisation d’oligonucléotides non naturels en série L. Enfin nous avons décrit une méthode particulièrement innovante, sans marquage (« label-free »), permettant l’analyse des cibles de petite taille. Cette méthode basée sur l’utilisation du SYBR Green en solution couplée à la technique d’anisotropie de fluorescence, permet également l’étude des ligands de l’ADN. / Clinical chemistry is a constantly evolving discipline. The challenge of developing new techniques is to enable high throughput analysis specific and at low cost. Immunoassay techniques respond appropriately to these criteria, but are nevertheless perfectible with regards to the detection of small molecules of biological interest. The aim of this work is to develop innovative assay methods for small molecules of biological interest, using aptamers as alternative molecular recognition tools. They are single-stranded functional nucleic acids that are isolated from a very large library of candidates through an in vitro combinatorial approach (SELEX) for their ability to bind a peculiar species. They compete with antibodies, particularly in the area of diagnosis. First, we focused our work on the design of small molecule dual recognition assay systems that involved the formation of a loop-loop complex. Adenosine and theophylline served as model targets for the heterogeneous phase development of a colorimetric assay with enzymatic signal amplification. Subsequent works were performed by using arginine-vasopressin, an analyte with a real biological interest as target. A homogeneous phase fluorescence anisotropy detection system was constructed. Applications in complex matrix were facilitated by the use of non-natural L-oligonucleotides. Finally, a particularly innovative SYBR Green-based fluorescence anisotropy method, was reported allowing the detection of both small targets and DNA ligands.