Le génome du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est constitué, comme tous les rétrovirus, de deux copies identiques d'ARN génomique. Celles-ci sont liées de manière non covalente au niveau de leur région 5'-terminale. Ce phénomène de dimérisation interfère avec différentes étapes clés du cycle rétroviral. C'est pourquoi, l'inhibition de la dimérisation représente une nouvelle voie de traitement potentiel du VIH. La première partie de ce travail porte sur la séquence d'ARN SL1 initiant la dimérisation chez VIH-1Lai. Nous nous sommes intéressés à la détermination structurale, par RMN et modélisation moléculaire, des espèces présentes dans le processus de dimérisation sous forme instable. Après avoir isolé les deux différents dimère d'ARN, nous avons mis en évidence la structure du dimère stable qui permet d'avancer des hypothèses quant à leur stabilité relative. La seconde partie de ce travail porte sur l'étude du fragment désoxyribose de SL1. Là encore, deux conformères de stabilité différente sont isolables. Le dimère instable s'organise sous forme de “kissing-complex” et représente la première structure de ce type élucidée pour un ADN. La structure du dimère stable demeure de type “kissing-complex” bien que présentant des différences à l'origine du changement de stabilité. La présence du groupement hydroxyle distinguant l'ADN de l'ARN explique cette différence de comportement. Ces investigations structurales constituent une solide base d'étude dans les stratégies de “drug-design” impliquant le développement d'inhibiteurs susceptibles d'interférer avec le phénomène de dimérisation.

Staphylococcus aureus, pathogène opportuniste de l’homme, est responsable de 30% des infections nosocomiales. L’apparition de souches multi résistantes aux antibiotiques en font un problème majeur de santé publique. La pathogénie de la bactérie résulte de l’expression d’une pléthore de facteurs de virulence, mais quels sont les mécanismes de régulation contrôlant l’expression de ces gènes ? Aujourd’hui, il est clairement établi que les ARN non-codant sont des molécules clés dans la régulation de l’expression des gènes. Plus de 50 ARN ont été identifiés chez S. aureus. Néanmoins la fonction de peu d’entre eux est connue. Durant ce travail de thèse, l’étude de la fonction et du mécanisme de régulation des ARN RsaA et RsaE a été entreprise. RsaA est un ARN sous le contrôle du facteur de stress sigmaB. Les résultats obtenus montrent que ce dernier régule la traduction de l’ARNm mgrA qui code pour un facteur de transcription important dans l’expression des gènes de virulence et la régulation de l’autolyse. Par appariement de base, RsaA cible l’ARNm en utilisant deux sites distants et coopératifs, permettant un interaction forte qui empêche la traduction de l’ARNm. In vivo, la délétion du gène rsaA perturbe la synthèse de biofilm de capsule. En régulant la traduction de sa cible, RsaA permet de relier l’adaptation au stress à l’expression des gènes de virulence. De manière plus générale, les réseaux de régulation des ARN se connectent les uns aux autres pour permettre à la bactérie d’intégrer une multitude de signaux provenant du milieu extracellulaire afin de moduler finement l’expression des gènes. / Staphylococcus aureus is a versatile and opportunist human pathogen, which is responsible of 30% of nosocomial infections. S. aureus is today an important public safety concern due to high persistence rate in hospital combined with emergence of multi resistant strains against antibiotics. The pathogenicity of the bacteria results from the expression of numerous virulence factors. An importance focus has been made to understand what triggers virulence genes expression. Regulatory RNAs are important regulators of genes expression in bacteria. In S. aureus, there is more than 50 RNAs identified, but there is a lack of investigations about their functions and regulatory networks. The aim of this work was to characterize the function and mechanism of action of RsaA and RsaE RNAs. RsaA is under the control of the stress factor sigma B. Computational analysis combined with global analysis of the proteome led to the discovery of one target : mgrA mRNA, which is a global transcription factor involved in autolysis and biofilm regulation. In vitro studies show that RsaA binds efficiently mgrA mRNA using two distant and cooperative interaction sites. Binding of RsaA to the mRNA prevents initiation of the translation. In vivo, rsaA gene deletion shows impact on biofilm and capsule production. By regulating the expression of mgrA mRNA, RsaA network is linked to agr system and virulence gene expression. In a more general way, this work shows that regulatory RNAs networks allow bacteria to modulate virulence, stress and metabolism gene expression depending on the signals provided by the environment of the bacteria.

La NCp7 est impliquée dans de nombreuses étapes du cycle viral notamment la rétrotranscription. Ceci en fait une cible potentielle pour un traitement anti-HIV. Par son activité chaperonne, elle permet de stimuler le premier saut de brin. Ce dernier consiste en la déstabilisation et l'hybridation des séquences TAR et cTAR du génome viral. C'est à l'aide de séquences cTAR marquées à leurs extrémités 3' et 5' par des chromophores et différentes techniques de spectroscopie de fluorescence et d'absorption que nous avons pu mettre en évidence l'importance des structures primaire et secondaire de la NCp7 et de cTAR dans le premier saut de brin. L'activité déstabilisatrice est fortement dépendante des bulges et de la boucle interne de cTAR. D'autre part, cette activité dépend également de la présence du Trp37 ainsi que de la présence des deux doigts de zinc de la NCp7 dans leur conformation native. Ensuite, nous avons pu mettre en évidence que la NCp7 favorisait la formation de l'homodimère de mutants de la partie haute de cTAR par formation d'un complexe boucle-boucle. Finalement, nous avons étudié une nouvelle sonde fluorescente analogue à l'adénine (la 8-vinyl-déoxyadénosine) qui est une solution alternative à la 2-aminopurine.

Staphylococcus aureus, pathogène opportuniste de l'homme, est responsable de 30% des infections nosocomiales. L'apparition de souches multi résistantes aux antibiotiques en font un problème majeur de santé publique. La pathogénie de la bactérie résulte de l'expression d'une pléthore de facteurs de virulence, mais quels sont les mécanismes de régulation contrôlant l'expression de ces gènes ? Aujourd'hui, il est clairement établi que les ARN non-codant sont des molécules clés dans la régulation de l'expression des gènes. Plus de 50 ARN ont été identifiés chez S. aureus. Néanmoins la fonction de peu d'entre eux est connue. Durant ce travail de thèse, l'étude de la fonction et du mécanisme de régulation des ARN RsaA et RsaE a été entreprise. RsaA est un ARN sous le contrôle du facteur de stress sigmaB. Les résultats obtenus montrent que ce dernier régule la traduction de l'ARNm mgrA qui code pour un facteur de transcription important dans l'expression des gènes de virulence et la régulation de l'autolyse. Par appariement de base, RsaA cible l'ARNm en utilisant deux sites distants et coopératifs, permettant un interaction forte qui empêche la traduction de l'ARNm. In vivo, la délétion du gène rsaA perturbe la synthèse de biofilm de capsule. En régulant la traduction de sa cible, RsaA permet de relier l'adaptation au stress à l'expression des gènes de virulence. De manière plus générale, les réseaux de régulation des ARN se connectent les uns aux autres pour permettre à la bactérie d'intégrer une multitude de signaux provenant du milieu extracellulaire afin de moduler finement l'expression des gènes.

La biochimie médicale est une discipline en constante évolution. L’enjeu du développement de nouvelles techniques est de permettre l’analyse à haut débit, de manière spécifique et à faible coût. Les techniques d’immunoanalyse omniprésentes en laboratoire de biologie médicale (LBM) répondent convenablement à ces critères, mais sont cependant perfectibles en ce qui concerne l’analyse des petites molécules d’intérêt biologique. L’objectif de ce travail est de développer des méthodes de dosage innovantes, pour les petites molécules, en utilisant les aptamères comme nouveaux outils de reconnaissance moléculaire. Il s’agit d’oligonucléotides fonctionnels simple brin, capables de reconnaître de manière spécifique une cible, isolés à partir d’une banque de candidats par une approche combinatoire in vitro nommée SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Ils sont en concurrence avec les anticorps, en particulier dans le domaine du diagnostic. Nous avons dans un premier temps travaillé sur le développement de systèmes de dosage à double reconnaissance pour petite molécule, impliquant la formation d’un complexe boucle-boucle. L’adénosine et la théophylline ont tout d’abord servi de cibles modèles pour le développement en phase hétérogène d’une technique de dosage colorimétrique avec amplification enzymatique du signal. Le développement a ensuite été axé sur un analyte ayant un réel intérêt biologique, l’arginine-vasopressine. Le système a été développé en phase homogène en utilisant la technique d’anisotropie de fluorescence. L’application en milieu biologique a été facilitée par l’utilisation d’oligonucléotides non naturels en série L. Enfin nous avons décrit une méthode particulièrement innovante, sans marquage (« label-free »), permettant l’analyse des cibles de petite taille. Cette méthode basée sur l’utilisation du SYBR Green en solution couplée à la technique d’anisotropie de fluorescence, permet également l’étude des ligands de l’ADN. / Clinical chemistry is a constantly evolving discipline. The challenge of developing new techniques is to enable high throughput analysis specific and at low cost. Immunoassay techniques respond appropriately to these criteria, but are nevertheless perfectible with regards to the detection of small molecules of biological interest. The aim of this work is to develop innovative assay methods for small molecules of biological interest, using aptamers as alternative molecular recognition tools. They are single-stranded functional nucleic acids that are isolated from a very large library of candidates through an in vitro combinatorial approach (SELEX) for their ability to bind a peculiar species. They compete with antibodies, particularly in the area of diagnosis. First, we focused our work on the design of small molecule dual recognition assay systems that involved the formation of a loop-loop complex. Adenosine and theophylline served as model targets for the heterogeneous phase development of a colorimetric assay with enzymatic signal amplification. Subsequent works were performed by using arginine-vasopressin, an analyte with a real biological interest as target. A homogeneous phase fluorescence anisotropy detection system was constructed. Applications in complex matrix were facilitated by the use of non-natural L-oligonucleotides. Finally, a particularly innovative SYBR Green-based fluorescence anisotropy method, was reported allowing the detection of both small targets and DNA ligands.

L'ARN antisens CopA régule le taux de réplication du plasmide bactérien R1 en contrôlant la synthèse de la protéine initiatrice de la réplication, RepA. CopA se fixe à sa séquence complémentaire (CopT) dans la région 5' non traduite de l'ARNm repA. Cette interaction induit principalement une inhibition de la traduction de l'ARNm repA et favorise sa dégradation par la RNase III. L'efficacité du contrôle est directement reliée à la vitesse de formation du complexe CopA-CopT. Nous avons montré que les deux ARN interagissent via une interaction de type boucle-boucle, mais que celle-ci doit être rapidement convertie pour former un complexe irréversible et fonctionnel. Celui-ci n'est pas un duplexe étendu mais contient une jonction à quatre hélices stabilisée par une longue hélice intermoléculaire. Plusieurs intermédiaires réactionnels menant au complexe stable ont été caractérisés, ainsi que les déterminants structuraux de CopA et de CopT nécessaires à cette conversion qui est essentielle au contrôle. Ainsi, nous proposons un mécanisme de formation du complexe stable qui implique plusieurs étapes dans un ordre hiérarchique. Ce mode d'appariement ARN-ARN insoupçonné apparaît être une règle plutôt qu'une exception. En effet, nous avons montré qu'il est conservé dans de nombreux plasmides homologues à R1. L'ARN-III contrôle l'expression des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus. Cette deuxième partie de mon travail de thèse a eu pour but de déterminer la structure secondaire de cet ARN en solution et in vivo, et de définir des domaines fonctionnels. En combinant différentes approches in vitro, nous avons établi que l'ARN-III contient 14 structures en tige-boucle et trois interactions à longue distance. Nous avons également identifié un sous domaine fonctionnel impliqué dans le contrôle de la synthèse de la protéine A.