Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T18:56:25Z : No. of bitstreams: 1 rososchansky_j_me_botfm_prot.pdf: 1947576 bytes, checksum: 929aea29e1f474a65eb0cbd2df6026c9 (MD5) / Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) / Determinar o efeito da hidratação oral materna com solução isotônica e água no índice de líquido amniótico (ILA) em gestantes com normodramnia. Sujeitos e métodos: Noventa e nove gestantes com ILA normal, e entre 33a e 36a semana de gestação foram randomizadas em três grupos: hidratação com solução isotônica (n=34), hidratação com água (n=30) e controle (n=35). As mulheres do grupo hidratação com solução isotônica e com água ingeriram 1,5L da solução correspondente e as do grupo controle ingeriram 200 mL de água durante o mesmo período. O ILA foi aferido antes e depois da hidratação e comparados entre os grupos. O ultra-sonografista desconhecia o grupo a que a gestante pertencia. Resultados: A diferença do ILA pós e pré-tratamento foi maior nos grupos solução isotônica e água (12.1 mm, p=0.02; 13.1 mm, p=0.05), quando comparado ao grupo controle (1.4 mm, p=0.74). Não houve diferença significativa entre os grupos com solução isotônica e água. A administração de solução isotônica e água aumentaram a chance de incremento de 20 % do ILA, em 10.2 e 6.0 respectivamente. Conclusão: A hidratação oral materna com solução isotônica ou com água aumentou o ILA em aproximadamente 8.5 % em gestantes com normodramnia. / To determine the effect of maternal oral hydration with isotonic solution and water on Amniotic fluid index (AFI) in pregnant mothers with normohydramnios. Subjects and Methods: Ninety-nine pregnant women with normal AFI between the 33rd and 36th week of gestation were randomly divided into three groups: hydrated with isotonic solution (n=34), hydrated with water (n=30), and controls (n=35). The isotonic solution and water groups ingested 1.5L of liquid, and the controls ingested 200mL of water over the same period. AFI was compared before and after hydration and between groups. The ultrasound technician was blinded to which group a subject belonged. Results: The difference in pre and post treatment AFI was higher in the isotonic solution and water groups (12.1mm, p=0.02; 13.1mm, p=0.05) than the controls (1.4mm, p=0.74). There was no significant difference between the isotonic solution and water groups. Administering isotonic solution and water improved the chance of a 20% increase in AFI in 10.2 and 6.0 respectively. Conclusion: Maternal oral hydration with isotonic solution or water increases AFI by approximately 8.5% in pregnant women with normohydramnios.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T20:57:18Z : No. of bitstreams: 1 ramos_bra_me_botfm.pdf: 447116 bytes, checksum: 446e118d63a97d1a69658b7e651b69aa (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Microbial invasion of the amniotic cavity has been described in term deliveries and its role on the immune modulation is of interest to the better understanding of the underlying labor processes. The aim of this study was to determine the prevalence of Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in the amniotic fluid of term pregnancies and to evaluate its influence on cytokines production at the end of pregnancy. A cross sectional study was conducted with fifty five pregnant women out of labor with intact membranes and gestational age between 37 and 41 weeks seen at the Bom Jesus hospital in Ariquemes, Rondônia, between June 2009 and May 2010. Amniotic fluid samples and fragments of chorioamniotic membranes were collected at cesarean section. M. hominis and U. urealyticum detection was performed by PCR and Interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-10 and Tumor Necrosis Factor (TNF)- levels were determined by ELISA. Chorioamniotic membranes were submitted to histopatological analyses. Presence of M. hominis was detected in 36.4% of amniotic fluid samples and any of them was positive for U. urealyticum. Regarding cytokines levels, 63.6% and 90.9% of samples have not shown detectable concentrations of TNF- and IL-1β. The median concentration of IL-6 and IL-8 were 107.9 pg/mL (0-517.1) and 208.1 pg/mL (0-1897.4), respectively. Interleukin-1, IL-6, IL-8 and TNF- concentrations were not associated with the presence of M. hominis in amniotic fluid, regardless the gestational age. No sample had detectable IL-10 levels. The histopatological analyses have shown no chorioamnionitis in any of the membranes, only a discreet mononuclear infiltration in the decidua could be observed in 40.4% of the samples. Presence of M. hominis was detected in 36.4% of amniotic fluid samples and any of them was positive for U. urealyticum. Regarding cytokines levels, 63.6% and 90.9% of samples have not... (Complete abstact click electronic access below)

Resumo não disponível.

Orientador: Áureo Tatsumi Yamada / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T23:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bianco_JuaresEdnaldoRomero_D.pdf: 17105644 bytes, checksum: 64a116dab9ebcd72e51d45d800243157 (MD5) Previous issue date: 2018-08-16T20:37:19Z / Resumo: As células Natural Killer uterinas (uNK) participam da interação materno fetal atuando ativamente como elemento imuno-modulador do micro-ambiente uterino na gestação bem sucedida. Apesar das uNK possuírem um potencial lítico, relacionado com a sua resposta imune inata, este não se manifesta em uma gestação normal. Por outro lado, diversos relatos sugerem o envolvimento destas células em abortos e interrupções da gestação. No presente trabalho, foi avaliado o possível envolvimento das células uNK em atividade citotóxica sob a influência "in loco" do líquido amniótico no útero pseudogestante de camundongos. Para tanto, camundongos fêmeas foram acasaladas com machos vasectomizados, e os cornos uterinos injetados com óleo mineral para indução do útero pseudogestante. O líquido aminótico coletado em condições assépticas dos sítios de desenvolvimento embrionário normal no 10° dia de gestação (dg), foi inoculado no volume constante de 3uL através de micro-injeção na parede uterina da região antímesometrial nosnódulos de decidualização dos animais no 9o dia de pseudogestação (dpg). Amostras dos sítios inoculados com líquido amniótico foram coletadas nos intervalos de 30 minutos, 1, 2 e 6 horas para análises morfológicas, citoquímicas, imunocitoquímicas, imunoquímica e expressões gênicas. Como controles, foram utilizados úteros gestantes normais no 8o dg e úteros pseudogestantes submetidos à introdução de agulha hipodérmica na parede do corno uterino e/ou inoculados com 3uL de solução fisiológica estéril.Pelas análises morfológicas realizadas em cortes histológicos avaliados pela coloração de hematoxilina-eosina, o endométrio decidualizado da região mesometrial e antímesometrial do útero pseudogestante inoculado com salina ou simples introdução da agulha hipodérmica não apresentaram variações. Igualmente, a morfologia das células uNK através da citoquímica com lectina DBA, não apresentou diferenças entre os grupos controles. Ainoculação de LA no útero pseudogestante promoveuhiperemia local após 30 minutos que, em cortes histológicos, foi constatada como estagnação do sangue e dilatação dos vasos venosos no endométrio. Nestes locais foram constatadas alterações degenerativas nas células uNK com perda de reatividade da superfície celular e no conteúdo dos grânulos através da lectina DBA. A análise immunocitoquímica, RT-PCR e ELISA para as citocinas IFN-y e TNF-a e, das proteínas perforina e granzima-A revelaram que, o líquido amniótico acentuava a expressão destas moléculas ou dos seus genes relacionados à resposta pró-inflamatória, enquanto não alteravam a expressão de moléculas anti-inflamatórias como a IL-10. A geração do óxido nítrico (NO), através da quantificação de nitrato e nitrito, demonstrou um aumento nas concentrações, principalmente do nitrito após a inoculação do líquido amniótico. O teste de TÚNEL e a imunocitoquímica para anti-caspase-3 revelaram aumento de marcações positivas nas células uNK e deciduais sob o efeito do líquido amniótico em relação aos grupo controles, enquanto se verificava uma relação inversa para a imunocitoquímica com o anti-PCNA aos 2 a 6 horas após líquido amniótico. O conjunto dos resultados obtidos comprovam que as células uNK são sensíveis à ação local do líquido amniótico, com padrão de resposta compatível à ativação da sua capacidade citotóxica e pró-inflamatória relacionada com a resposta imune inata. / Abstract: Uterine Natural Killer (uNK) cells participate on the maternal fetus interaction actively playing as a immunomodulator element of the uterine micro-enviroment during a well successful gestation. Despite uNK having a lytic potencial that is related to its innate immune responsive, this does not manifest in a normal gestation. Moreover, several reports suggest the involvement of these cells in abortions and interruptions of gestation. In this study, we investigated the possible involvement of uNK cells in cytotoxic activity under the influence "in loco" of amniotic fluid in the uterus of mice pseudopregnant. For this, female mice were mated with vasectomized males and the uterine horns injected with mineral oil for induction of the pseudopregnant uterus. The amniotic fluid collected aseptically from sites of normal embryonic development in the 10 th day of gestation (dg) was inoculated on the constant volume of 3ul_ through microinjection on the uterine wall in the antimesometrial region into uterine nodules from animals on the 9th day of pseudopregnancy (dpg). Samples of inoculated sites with amniotic fluid were collected at intervals of 30 minutes, 1, 2 and 6 hours for morphological, cytochemical, immunocytochemical, immunochemical and relative gene expressions analyses. As controls, normal pregnant uteri on the 8th dg, and uterus on 9th dpg were submitted to the introduction of a hypodermic needle into the wall of the uterus and/or inoculated with 3uL of sterile saline.For the morphological analysis performed on histological sections evaluated by hematoxylin-eosin, the decidualized endometrium of the mesometrial and antimesometrial regions of the pseudopregnant uterus were inoculated with saline or simple introduction of the hypodermic needle showed no variations. Also, the morphology of uNK cells by DBA lectin cytochemistry, evidenced no differences among control groups.The amniotic fluid inoculation on the pseudopregnant uterus promote Hyperaemia after 30 min, in histological slides that was observed as blood interruption flow and dilatation of the vessels on the endometrium. On these areas it was observed degenerative modifications on uNK cells with loss in the positive reaction to DBA lectin in the cellular membranes and in the granules.The immunocytochemical analysis, RT-PCR and ELISA for the cytokines IFN-y and TNF-a, and the perforin and granzyme-A protein revealed that the amniotic fluid enhanced the expression of these molecules or their genes related to pro-inflammatory response, while not altering the expression of anti-inflammatory molecules such as IL-10.The generation of nitric oxide (NO), was observed through the quantification of nitrate and nitrite that demonstrated an increase in concentrations, primarily of nitrite after inoculation of amniotic fluid.The TUNEL assay and immunocytochemistry for anti-caspase-3 revealed an increase on positive uNK and decidual cells under the effect of amniotic fluid in relation to the control group, while there was an inverse relationship to immunocytochemistry with anti-PCNA at 2 and 6 hours after the amniotic fluid. The overall results show that uNK cells are sensitive to local action of amniotic fluid, compatible with standard response to the activation of their cytotoxic and proinflammatory that are related to the innate immune response. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Fernanda Garanhani de Castro Surita, José Guilherme Cecatti / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:09:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Figueira_CamillaOlivares_M.pdf: 1964790 bytes, checksum: 9f40cd5a6b3e989c4a5740350753fde4 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Objetivo: Estudar longitudinalmente os parâmetros Dopplervelocimétricos de artérias fetais e uterinas em mulheres com gestação de baixo risco, construindo intervalos de referência para as artérias uterinas (AUT), umbilical (AU), cerebral média (ACM), e renal (AR), correlacionando esta última com índice de líquido amniótico. Métodos: estudo de coorte longitudinal descritivo em 63 mulheres com gestação de baixo risco no Hospital prof. Dr. José Aristodemo Pinotti ¿ Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher- CAISM/UNICAMP. Foram aferidos o índice de pulsatilidade (IP) e a velocidade sistólica (VS) dos vasos estudados em intervalos de 4 semanas até a 36ª. semana e após, a cada 2 semanas até o parto para construção do intervalo longitudinal dos parâmetros. Para análise estatística foram calculadas as médias por intervalos de idade gestacional, valores dos percentis 5, 50 e 95 para cada parâmetro estudado e ainda, os índices de correlação intra classe e inter classe para cada artéria estudada. Foi estabelecido um nível de significância de 5% e para os procedimentos de análise foram utilizados os programas Epi.Info e SAS. Resultados: Foram construídos intervalos de referência e estabelecidos os percentis 5, 50 e 95 para IP e VS das artérias uterinas, umbilical, cerebral média e renais ao longo da gestação. A evolução dos parâmetros dopplervelocimétricos na população estudada foi semelhante ao padrão encontrado na literatura, entretanto foram observadas algumas diferenças nos valores absolutos. O ILA foi aferido e correlacionado ao Doppler da artéria renal, porém não houve associação entre eles. O Coeficiente de Correlação intra classe mostrou valores adequados pra a maioria dos parametros, indicando boa reprodutibilidade. Conclusões: Foram estabelecidos valores de intervalos de referência para a avaliação de VS e IP das principais artérias estudadas durante a gestação em um seguimento longitudinal. Os intervalos de referência mostram a evolução esperada dos parâmetros de uma gestação de baixo risco e são úteis no acompanhamento das gestações de alto risco. As avaliações intra e inter observador indicaram boa reprodutibilidade do método / Abstract: Objective: To study longitudinal Dopplervelocimetry parameters of uterine and fetal arteries in women of low risk pregnant women, and to develop reference interval values for uterine (UtA), umbilical (UA), middle cerebral (MCA), and renal arteries (RA) and correlate the latter with amniotic fluid index (AFI). Methods: longitudinal cohort study with 63 low risk pregnant women at prof. Dr. José Aristodemo Pinotti Hospital- CAISM/UNICAMP. Pultasility index (PI) and sistolic velocity (SV) of the arteries studied were measured at a 4 week interval until 36 weeks and then every 2 weeks to construct the longitudinal interval. Means for intervals of gestational age and percentiles 5, 50 and 95 were calculated for each parameter and Spearman correlation index was used to correlate the AFI with RA parameters. The Intra Class Correlation Coefficients were also calculated to evaluate the intra and inter observer variability for each vessel. A 5% significance level was established and programs Epi.Info and SAS were used for analysis. Results: Longitudinal reference intervals were constructed and the 5th, 50th and 95th percentiles for PI and SV of uterines, umbilical, middle cerebral and renal arteries established during pregnancy. AFI was measured and correlated with renal artery Doppler, but we found no association between these two parameters. The Intraclass Correlation Coefficient showed adequate values for the majority of the parameters, indicating good reproducibility. Conclusions: We have established a curve of reference intervals for the assessment of SV and PI of the main arteries studied during pregnancy after a longitudinal follow up. Reference intervals show the expected evolution of low risk pregnancy parameters and are useful in monitoring high risk pregnancies. Intra and inter observer evaluation indicated good reproducibility of the method / Mestrado / Saúde Materna e Perinatal / Mestra em Ciências da Saúde

Orientador: Jose Guilherme Cecatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:22:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dertkigil_MarciaSanJuan_M.pdf: 457919 bytes, checksum: d1358d139b645249677efe81ba78ad49 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Objetivo - Avaliar as possíveis mudanças no volume de líquido amniótico em gestantes submetidas à imersão em água durante atividade física moderada. Método: Foi realizado um estudo prospectivo comparando o ILA (índice de líquido amniótico) antes e depois da imersão em água e atividade física. Foram selecionadas gestantes do Ambulatório de Pré Natal Normal do Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, que aceitaram participar do estudo sobre atividade física na gestação. As gestantes foram alocadas aleatoriamente em dois grupos (com ou sem hidroginástica, respectivamente grupo A ou B). As gestantes do grupo A praticaram atividade física moderada na água, em imersão subtotal, três vezes por semana, com cinqüenta minutos cada sessão, em piscina aquecida a 30º C, desde o segundo trimestre da gestação até o parto. Foram excluídas mulheres com antecedentes de duas ou mais cesáreas, gravidez de risco ou condições que contra-indicassem a prática de atividade física (hipertensão arterial, placenta prévia e história de abortos de repetição, etc.). As gestantes foram avaliadas semanalmente, a partir de 20 semanas, para estimativa do ILA e edema pré-imersão (antes da sessão de hidroginástica) e pós-imersão (após a hidroginástica). Um segundo avaliador também obtinha dados do ILA das gestantes para avaliação da variabilidade inter-observador. Para os procedimentos de análise, foram utilizados os programas Epi.Info 2000 e SAS. Na análise estatística, as variáveis quantitativas foram comparadas através do teste t de Student ou do teste não paramétrico de Wilcoxon. Para a comparação da variabilidade das medidas inter-observador, foi utilizado o coeficiente de correlação linear. Foi estabelecido um nível de significância de 5%. Resultados: No total, 25 gestantes participaram do estudo, entre 19 e 36 anos, entre maio de 2003 e dezembro de 2004, tendo sido realizadas 232 avaliações do ILA pré e pós-imersão nestas gestantes, com uma média de 9,28 avaliações por mulher. Verificou-se aumento do ILA pós-imersão em relação ao ILA pré-imersão em todas as idades gestacionais estudadas, variando entre 8,8 e 21,5 % de aumento. Essa variação foi significativa para a grande maioria das idades gestacionais e não houve uma tendência significativa de aumento ou diminuição desta diferença com a idade gestacional. Houve uma boa correlação das medidas do ILA pré e pós-imersão entre os dois examinadores, com coeficiente de correlação entre os examinadores respectivamente de 0,78 e de 0,70. O edema de membros inferiores esteve presente em cerca de 23% das observações após a 29º semana, e regrediu após a imersão. Conclusões: houve um aumento significativo do ILA em quase todas as idades gestacionais, podendo ser efetivo o tratamento de imersão em água para aumentar o ILA / Abstract: Objective - To evaluate possible changes in the amniotic fluid index (AFI) among pregnant women practicing moderate physical activity in water immersion. Method: a prospective study was performed, comparing the AFI pre and post immersion in water for physical activity. Pregnant women from the Pre Natal Outpatient Clinic in the hospital of the University of Campinas who accepted to participate in the study on physical activity during pregnancy were selected. They were randomly allocated in two groups (with and without water aerobic, respectively group A and B). The women in group A practiced moderate physical activity in water under subtotal immersion, three times a week, in sessions of 50 minutes each, in swimming pool heated at 30º C, from the second trimester of pregnancy until delivery. Women with history of two or more cesarean sections, high risk pregnancy or conditions contra-indicating physical activity practice (hypertension, placenta previa, history of recurrent abortions, etc.) were excluded. The women were evaluated weekly with an ultrasound exam in order to estimate the pre and post immersion AFI and also a clinical screening for edema. A second examiner also obtained the AFI values in order to evaluate the inter observer variability. For statistical analysis the programs Epi.Info 2000 and SAS were used. The quantitative variables were compared with Student t or non parametric Wilcoxon test. For evaluation of inter observer variability of the measures, the linear correlation coefficient was used. A 5% significance level was previously determined. Results: a total of 25 pregnant women participated in the study between May 2003 and December 2004, with age ranging from 19 to 36 years and 232 ultrasound evaluations of pre and post immersion AFI, with a mean of 9.28 exams per woman. An increase in the post immersion AFI compared to pre immersion was observed in all gestational ages studied, ranging from 8.8 and 21.5%. These changes were significant for the vast majority of gestational ages and there was not a significant trend of increase or decrease of this difference with gestational age. There was a good agreement on pre and post immersion AFI values between both examiners, with a correlation coefficient of respectively 0.78 and 0.70. The edema of legs was detected in around 23% of weekly observations after 29 weeks and decreased after immersion. Conclusions: there was a significant increase of AFI in almost all gestational ages, then the treatment of immersion in water for increasing the AFI could be effective / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

O cão é um excelente modelo pré-clínico para o estudo de doenças, testes farmacológicos e novas terapias para futura aplicação em humanos. Desta forma, estudamos o modelo canino como fonte de células tronco de anexos fetais, o líquido amniótico, alantóide e conteúdo vitelino. Uma vez que hoje, as células tronco apresentam uma esperança na cura de diversas doenças tanto nos cães, como no ser humano. Sendo assim, caracterizamos e estudamos o potencial de diferenciação dessas células, isoladas após a técnica de ovário salpingo histerectomia, de cadelas em campanhas de castração. Após o isolamento e a caracterização, somente foi estabelecida a cultura do líquido amniótico e alantóide. Para caracterizar as células, isoladas no intuito de comprovar que são células tronco verdadeiras, os seguintes Imunomarcadores foram usados, vimentina, nestina, citoqueratina-18 e oct-4, sendo os três primeiros positivos para células do líquido amniótico e alantóide. Induzimos a diferenciação dessas células para osso, cartilagem e gordura, utilizando protocolos previamente estabelecidos. As células tronco do líquido amniótico limitaram-se à diferenciação condrogênica e osteogênica enquanto que as células tronco do alantóide, limitaram-se a diferenciação condrogênica. Ao mesmo tempo, ambos os tipos celulares, não prosseguiram à diferenciação adipogênica. Surpreendentemente, o meio de diferenciação para gordura, induziu a mudança morfológica nestas células que passaram a apresentar a morfologia típica de células neuronais. Podemos concluir que provavelmente para diferenciação adipogênica, é preciso desenvolver outro meio de cultura, por outro lado, esse resultado sugere que devemos explorar o potencial neurogênico desses tipos celulares. / The dog is an excellent preclinical model for the study of diseases, pharmacological tests and new therapies for future application in humans. Thus, we studied the canine model as a source of stem cells from fetal membranes, amniotic fluid, allantois and fluid yolk. Since today, stem cells have a hope in curing various diseases in both dogs and humans. Therefore, we characterize and study the differentiation potential of these cells, isolated after the technique of ovarian salpingo hysterectomy. After the isolation and characterization, was only established the culture of amniotic and allantois fluid. To characterize the cells isolated in order to demonstrate that they are true stem cells, the following were used antibodies, vimentin, nestin, cytokeratin-18 and oct-4. The cells were reactive positively to vimentin, nestin, cytokeratin. We induced the differentiation of these cells osteogenic, chondrogenic, adipogenic, using previously established protocols. Stem cells from amniotic fluid were restricted to chondrogenic and osteogenic differentiation while the stem cells of the allantois, limited to chondrogenic differentiation. At the same time, both cell types, were not able to adipogenic differentiation. Surprisingly, the means of adipogenic differentiation, induced the typical morphology of neuronal cells. We can conclude that probably for adipogenic differentiation, we must develop other culture media, on the other hand, this result suggests that we should explore the neurogenic potential these cell types.

Malformações fetais são importantes causas de óbito fetal e mortalidade infantil. A medicina regenerativa apresenta-se como a terceira modalidade terapêutica fetal. Células obtidas do líquido amniótico mostram-se como opção preferencial em terapia celular por sua alta taxa de proliferação in vitro, habilidade de autorrenovação e potencial multilinhagem. Para uso clínico, é recomendável a exclusão de material animal não humano do meio de cultura dessas células, prevenindo reações imunes, transmissão de príons, bactérias e vírus. O soro fetal bovino é componente usual do meio de cultura dessas células. Sua substituição por soro humano previne essas possíveis consequências. O objetivo deste trabalho foi estudar células obtidas do líquido amniótico, em meio de cultura suplementado por soro fetal bovino ou humano e compará-las. Foram avaliadas seu isolamento e cultivo, padrão de crescimento, morfologia, imunofenótipo, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, e caracterizou-se a expressão dos genes OCT-4, NANOG e SOX2. Foram analisadas amostras provenientes de cinco gestantes, obtidas por amniocentese de segundo trimestre, indicadas por idade materna avançada. As células do líquido amniótico, após centrifugação, foram colocadas em frasco de cultura com meio -MEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (grupo B) ou soro humano (grupo H). Ao atingirem 70% de confluência, foram tripsinizadas e expandidas. Após a terceira passagem celular foram separadas alíquotas do grupo B e H para avaliação de seu potencial de expansão, por meio da construção de curvas de crescimento celular para diferentes inóculos iniciais (1.000, 5.000, 10.000 e 15.000 células). Sua morfologia foi avaliada por microscopia ótica através da coloração de Leishman e por microscopia eletrônica. A análise do imunofenótipo das células dos dois grupos foi realizada por citometria de fluxo, analisando-se os marcadores de superfície: CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 e CD133. A diferenciação osteogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de fosfato-2-ascorbato e -glicerofosfato, comprovada pela produção de cálcio pelas células, coradas pela Alizarina e visualização da Fosfatase Alcalina nas células. A diferenciação condrogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de dexametasona e TGF-1, comprovada pela análise histológica após coloração pela hematoxilina-eosina. Avaliou-se a expressão gênica dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, por RT-PCR das células dos dois grupos (B e H), comparadas aos controles celulares MRC-5 e NTERA-2 cl.D1. Observou-se alta taxa de expansão, sem diferença significativa entre os grupos (p=0,715), mesmo considerando-se a evolução dia-a-dia (p=0,681) e a alta viabilidade celular, com média de 94% nos dois grupos (p=0,686). A análise morfológica das células dos dois grupos revelou aspecto mesenquimal típico, com crescimento celular em cultura também típico dessa linhagem. Ao microscópio eletrônico, observou-se maior número de vacúolos lipídicos naquelas células do grupo H. A imunofenotipagem demonstrou marcação positiva para linhagem mesenquimal e negativa para outras linhagens. Ocorreu diferenciação osteogênica e condrogênica e expressão dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2. Não houve diferença significativa nos aspectos estudados, entre os grupos B e H. Concluiu-se que essas células, isoladas do líquido amniótico, apresentam característica de fácil isolamento, alta taxa de proliferação, aspecto morfológico e imunofenótipo mesenquimal, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, expressando os transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, associados à pluripotência celular, tanto em meio suplementado por soro fetal bovino como por soro humano. / Fetal malformations are a significant cause of fetal death and infant mortality. Regenerative medicine is presented as a third therapeutic method. Cells obtained from the amniotic fluid are seen to be an option of choice for cell therapy because of their high rate of in vitro proliferation, power of selfrenewal and multi-lineage potential. For clinical use the exclusion of nonhuman animal material from the culture medium of these cells is to be recommended, thus precluding immune reactions and the transmission of prions, bacteria and viruses. Bovine fetal serum is a normal component of the culture medium of these cells. Its replacement by human serum precludes those possible consequences. The objective of this present study was investigation into the cells obtained from the amniotic fluid, in a culture medium supplemented with bovine fetal or human serum, and compare them. Their isolation and culture, growth rate, morphology, immune phenotype and osteogenic and chondrogenic capacity were assessed and the expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 genes was characterized. Samples taken from five pregnant women by amniocentesis during the second trimester, recommended by virtue of advanced maternal age, were analyzed. The cells of the amniotic fluid, after centrifugation, were placed in a culture flask with an -MEM medium supplemented with 20% of bovine fetal serum (group B) or human serum (group H). After attaining 70% confluence they were trypsinized and expanded. After the third cellular passage they were separated into quotas of groups B and H for assessment of their expansion potential, by means of the construction of cellular growth curves for the different initial inocula (1,000, 5,000, 10,000 and 15,000 cells). Their morphology was assessed by optical microscopy by means of Leishman´s staining and electron microscopy. The analysis of the immune phenotype of the cells of the two groups was undertaken by flow cytometry, the surface markers CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 and CD133 being analyzed. The osteogenic differentiation was undertaken by the addition of ascorbate-2-phosphate-2 and - glycerophosphate to the culture medium and proved by the production of calcium by the cells, stained with Alizarin, and visualization of the Alkaline Phosphatase in the cells. The chondrogenic differentiation was brought about by the addition of dexamethasone and TGF-1 to the culture medium and demonstrated by histological analysis after staining with hematoxilineeosine. The genic expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 transcripts was compared with the control cells MRC-5 and NTERA-2 cl.D1 by the RTPCR of the cells of the two groups (B and H). A high expansion rate was observed, with no significant difference between the groups (p=0.715), even when the day-to-day progress (p=0.681) was taken into consideration, and high cell viability, with an average of 94% in the two groups (p=0.686). The morphological analysis of the cells of the two groups presented a typical mesenchymal aspect, with cell growth in the culture also typical of this line. Under the electron microscope, a greater number of lipid vacuoles were observed in the cells of the H group. The immune phenotyping presented a positive marking for the mesenchymal line but a negative one for the others. Osteogenic and chondrogenic differentiation occurred as also did expression of the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2. There was no significant difference, as regards the aspects studied, between groups B and H. It is concluded that these cells isolated from the amniotic fluid were characterized by ease of isolation, a high rate of proliferation, mesenchymal morphological aspect and immune phenotype, capacity for osteogenic and chondrogenic differentiation, expressing the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2, both in the medium supplemented with bovine fetal serum and in that with human serum.

Malformações fetais são importantes causas de óbito fetal e mortalidade infantil. A medicina regenerativa apresenta-se como a terceira modalidade terapêutica fetal. Células obtidas do líquido amniótico mostram-se como opção preferencial em terapia celular por sua alta taxa de proliferação in vitro, habilidade de autorrenovação e potencial multilinhagem. Para uso clínico, é recomendável a exclusão de material animal não humano do meio de cultura dessas células, prevenindo reações imunes, transmissão de príons, bactérias e vírus. O soro fetal bovino é componente usual do meio de cultura dessas células. Sua substituição por soro humano previne essas possíveis consequências. O objetivo deste trabalho foi estudar células obtidas do líquido amniótico, em meio de cultura suplementado por soro fetal bovino ou humano e compará-las. Foram avaliadas seu isolamento e cultivo, padrão de crescimento, morfologia, imunofenótipo, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, e caracterizou-se a expressão dos genes OCT-4, NANOG e SOX2. Foram analisadas amostras provenientes de cinco gestantes, obtidas por amniocentese de segundo trimestre, indicadas por idade materna avançada. As células do líquido amniótico, após centrifugação, foram colocadas em frasco de cultura com meio -MEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (grupo B) ou soro humano (grupo H). Ao atingirem 70% de confluência, foram tripsinizadas e expandidas. Após a terceira passagem celular foram separadas alíquotas do grupo B e H para avaliação de seu potencial de expansão, por meio da construção de curvas de crescimento celular para diferentes inóculos iniciais (1.000, 5.000, 10.000 e 15.000 células). Sua morfologia foi avaliada por microscopia ótica através da coloração de Leishman e por microscopia eletrônica. A análise do imunofenótipo das células dos dois grupos foi realizada por citometria de fluxo, analisando-se os marcadores de superfície: CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 e CD133. A diferenciação osteogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de fosfato-2-ascorbato e -glicerofosfato, comprovada pela produção de cálcio pelas células, coradas pela Alizarina e visualização da Fosfatase Alcalina nas células. A diferenciação condrogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de dexametasona e TGF-1, comprovada pela análise histológica após coloração pela hematoxilina-eosina. Avaliou-se a expressão gênica dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, por RT-PCR das células dos dois grupos (B e H), comparadas aos controles celulares MRC-5 e NTERA-2 cl.D1. Observou-se alta taxa de expansão, sem diferença significativa entre os grupos (p=0,715), mesmo considerando-se a evolução dia-a-dia (p=0,681) e a alta viabilidade celular, com média de 94% nos dois grupos (p=0,686). A análise morfológica das células dos dois grupos revelou aspecto mesenquimal típico, com crescimento celular em cultura também típico dessa linhagem. Ao microscópio eletrônico, observou-se maior número de vacúolos lipídicos naquelas células do grupo H. A imunofenotipagem demonstrou marcação positiva para linhagem mesenquimal e negativa para outras linhagens. Ocorreu diferenciação osteogênica e condrogênica e expressão dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2. Não houve diferença significativa nos aspectos estudados, entre os grupos B e H. Concluiu-se que essas células, isoladas do líquido amniótico, apresentam característica de fácil isolamento, alta taxa de proliferação, aspecto morfológico e imunofenótipo mesenquimal, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, expressando os transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, associados à pluripotência celular, tanto em meio suplementado por soro fetal bovino como por soro humano. / Fetal malformations are a significant cause of fetal death and infant mortality. Regenerative medicine is presented as a third therapeutic method. Cells obtained from the amniotic fluid are seen to be an option of choice for cell therapy because of their high rate of in vitro proliferation, power of selfrenewal and multi-lineage potential. For clinical use the exclusion of nonhuman animal material from the culture medium of these cells is to be recommended, thus precluding immune reactions and the transmission of prions, bacteria and viruses. Bovine fetal serum is a normal component of the culture medium of these cells. Its replacement by human serum precludes those possible consequences. The objective of this present study was investigation into the cells obtained from the amniotic fluid, in a culture medium supplemented with bovine fetal or human serum, and compare them. Their isolation and culture, growth rate, morphology, immune phenotype and osteogenic and chondrogenic capacity were assessed and the expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 genes was characterized. Samples taken from five pregnant women by amniocentesis during the second trimester, recommended by virtue of advanced maternal age, were analyzed. The cells of the amniotic fluid, after centrifugation, were placed in a culture flask with an -MEM medium supplemented with 20% of bovine fetal serum (group B) or human serum (group H). After attaining 70% confluence they were trypsinized and expanded. After the third cellular passage they were separated into quotas of groups B and H for assessment of their expansion potential, by means of the construction of cellular growth curves for the different initial inocula (1,000, 5,000, 10,000 and 15,000 cells). Their morphology was assessed by optical microscopy by means of Leishman´s staining and electron microscopy. The analysis of the immune phenotype of the cells of the two groups was undertaken by flow cytometry, the surface markers CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 and CD133 being analyzed. The osteogenic differentiation was undertaken by the addition of ascorbate-2-phosphate-2 and - glycerophosphate to the culture medium and proved by the production of calcium by the cells, stained with Alizarin, and visualization of the Alkaline Phosphatase in the cells. The chondrogenic differentiation was brought about by the addition of dexamethasone and TGF-1 to the culture medium and demonstrated by histological analysis after staining with hematoxilineeosine. The genic expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 transcripts was compared with the control cells MRC-5 and NTERA-2 cl.D1 by the RTPCR of the cells of the two groups (B and H). A high expansion rate was observed, with no significant difference between the groups (p=0.715), even when the day-to-day progress (p=0.681) was taken into consideration, and high cell viability, with an average of 94% in the two groups (p=0.686). The morphological analysis of the cells of the two groups presented a typical mesenchymal aspect, with cell growth in the culture also typical of this line. Under the electron microscope, a greater number of lipid vacuoles were observed in the cells of the H group. The immune phenotyping presented a positive marking for the mesenchymal line but a negative one for the others. Osteogenic and chondrogenic differentiation occurred as also did expression of the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2. There was no significant difference, as regards the aspects studied, between groups B and H. It is concluded that these cells isolated from the amniotic fluid were characterized by ease of isolation, a high rate of proliferation, mesenchymal morphological aspect and immune phenotype, capacity for osteogenic and chondrogenic differentiation, expressing the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2, both in the medium supplemented with bovine fetal serum and in that with human serum.

As células-tronco mesenquimais (CTM) são células progenitoras indiferenciadas que apresentam altas taxas de proliferação em cultivo, capacidade de diferenciação em inúmeros tecidos e podem ser encontradas no organismo adulto e, também, em tecidos fetais, como cordão umbilical, placenta e liquido amniótico (LA). Estudos demonstraram que o LA humano obtido por amniocentese no segundo trimestre de gestação, comumente utilizado em exames de diagnóstico fetal, apresenta-se como uma fonte em potencial destas células progenitoras. Contudo, estas células necessitam de mais estudos quanto às técnicas de isolamento, expansão e, sobretudo, acerca dos protocolos de congelamento utilizados em sua criopreservação. Com isso, nos propusemos a padronizar técnicas de cultivo para as CTLA, como melhor meio de cultura e densidade de inóculo; avaliar as características biológicas como estado de indiferenciação, ciclo celular, marcadores de membrana, plasticidade e, ainda, testar dois protocolos de congelamento celular (padrão e gradual) com diferentes criopreservantes (DMSO, glicerol, trealose e sacarose) que mantivessem uma alta viabilidade e as demais características das células-tronco após períodos de 3 e 6 meses de armazenamento em nitrogênio líquido. Ao fim dos experimentos constatamos ser o líquido amniótico uma rica fonte de CTM passíveis de serem isoladas e cultivadas com meio de cultura a-MEM suplementado com 20% de SFB. Padronizamos, também, uma contagem celular inicial das amostras para otimizar o plaqueamento primário, uma densidade de inóculo ideal para as passagens posteriores (5.000 céls/cm2) e o tempo de dobramento (30 ± 4 horas) das mesmas. As CTLA expressaram genes de indiferenciação: Oct-4, Sox-2 e Nanog; apresentaram positividade para marcadores de superfície CD29, CD44, CD90 e CD105; alta taxa de proliferação in vitro e diferenciaram-se em tecido ósseo, adiposo, cartilaginoso e neuronal. Não encontramos diferenças significativas entre os dois métodos de congelamento avaliados no que diz respeito à viabilidade pós-congelamento. Todos os criopreservantes analisados mantiveram o estado de indiferenciação e plasticidade das células-tronco congeladas por 3 e 6 meses, contudo o DMSO 10% proporcionou maiores taxas de viabilidade do que os demais. As CTLA ficam desta maneira melhor caracterizadas, com protocolos de cultivo e estocagem bem estabelecidos, facilitando a produção de células-tronco funcionais em larga escala aptas a serem utilizadas em experimentos futuros / Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated progenitor cells that have high proliferation rates in culture, ability to differentiate into various tissues and can be found in adult and fetal tissues such as umbilical cord, placenta and amniotic fluid (AF). Studies showed that human AF obtained by amniocentesis in second trimester of pregnancy, commonly used in fetal diagnostic, is a potential source of progenitor cells. However, these cells require further studies above techniques of isolation, expansion and, especially, about freezing protocols used in their cryopreservation. For then, we analyzed isolation and expansion methods to AFSC as the best culture medium and inoculum density; biological characteristics such as undifferentiated state, cell cycle, membrane markers, plasticity, and also we tested two freezing protocols (standard and graduated) with different cryoprotectors (DMSO, glycerol, trehalose and sucrose) that could be able to maintain high viability and other characteristics of stem cells after 3 and 6 months of storage in liquid nitrogen. At the end of experiments we found that amniotic fluid is a rich source of mesenchymal stem cells that can be isolated and cultured with a-MEM medium supplemented with 20% FBS. Standardized an initial cell samples counting to optimize primary plating, an ideal inoculum density for the later passages (5000 cells/cm2) and doubling time (30 ± 4 hours). AFSC expressed undifferentiated genes: Oct-4, Sox-2 and Nanog, were positive for surface markers CD29, CD44, CD90 and CD105; presented high in vitro proliferation rate and capability to differentiate into bone, adipose, cartilage and neuronal tissues. There was not statistical significance in cell viability between standard and graduated freezing protocols. All evaluated cryoprotectors maintained the basic features of amniotic fluid stem cells, as Oct-4 gene expression, surface markers and plasticity. DMSO 10% showed higher rates of viability than the others. We can conclude that AF is a rich source of MSC with great capacity for expansion and differentiation and that both methods of freezing could be used for AF cells storage. All tested cryoprotectors maintains stemness of AFSC, therefore the highest viability rate is supplied by 10% DMSO. In this way, AFSC are better characterized, with cultivation and storage protocols standardized, resulting in large scale production of functional stem cells suitable for use in future experiments