DIAS, Ana Carla da Silva Carvalho. Efeito protetor da fucoidina, um inibidor de P e L-selectina, na resposta inflamatória sistêmica e distúrbios de motilidade gastrintestinal na pancreatite aguda experimental. 2013. 124 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-22T16:22:37Z No. of bitstreams: 1 2013_tese_acscdias.pdf: 6391660 bytes, checksum: 62b1f07c8aab044de5338353f4857e96 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-23T13:15:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_tese_acscdias.pdf: 6391660 bytes, checksum: 62b1f07c8aab044de5338353f4857e96 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-23T13:15:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_tese_acscdias.pdf: 6391660 bytes, checksum: 62b1f07c8aab044de5338353f4857e96 (MD5) Previous issue date: 2013 / Background & Aims: Neutrophils play a critical role in severe acute pancreatitis. Tissue infiltration of neutrophils in the pancreas is a multistep process, coordinated by specific adhesion molecules, such as P-selectin. Fucoidin is a sulphated fucosylated polysaccharide that binds to and blocks the function of L- and P-selectins, and the present study has evaluated whether fucoidin treatment could prevent neutrophil infiltration, and thereby reverse the systemic inflammation and gastrointestinal dysmotility associated with severe acute pancreatitis. Methods: Acute pancreatitis was induced in Swiss mice either by the retrograde infusion of taurolithocholic acid (3.0%) (TLC-S) into the pancreatic duct or by intraperitoneal injections of cerulein (50 µg/kg/h). The experimental groups received fucoidan (25 mg/kg, i.v.) before pancreatitis induction whist control groups received only saline. After 24 hours, pancreatic malondialdehyde (MDA), serum amylase, lipase, IL-1β, TNF- and nitrite were measured. In addition, myeloperoxidase (MPO) activity (lung, pancreas, stomach and jejunum) and histological assessment (pancreas) were determined. Gastric emptying and gastrointestinal transit (using the geometric center method) were also measured. Gastrointestinal contractility in vitro was recorded through force transducers coupled to a computerized data acquisition system, carbachol (0,01 µM – 30 µM), KCl 60mM and electrical field stimulation (0.5-8.0 Hz; 1ms; 40 V), was applied on gastric fundus and jejunum of mice 24 hours after TLC-S induced pancreatitis. Results: Pancreatic MDA, serum amylase, lipase, nitrite, TNF- and IL-1β, pancreatic and lung MPO, were increased in both TLCS- and cerulein acute pancreatitis compared with respective control groups. Fucoidan significantly decreased the augmented levels of amylase, lipase, pancreatic and lung MPO, MDA, TNF-, IL-1β and nitrite in both acute pancreatitis models. Pancreas histological changes observed in both models were significantly attenuated by fucoidan. The acute pancreatitis model induced by TLC-S caused delayed gastric emptying and gastrointestinal transit, incresead gastric and jejunum MPO, and jejunum hypercontractility in vitro. Fucoidan significantly reversed the gastrointestinal disorders in vivo and in vitro and augmented levels of gastric and jejunum MPO induced by TLC-S. Conclusion: Fucoidan reduced the severity of acute pancreatitis in mice by decreasing neutrophil infiltration, systemic inflammation and gastrointestinal dysmotility, suggesting that modulation of selectins may constitute a promising therapeutic approach for acute pancreatitis. / Introdução e objetivos: Os neutrófilos desempenham importante papel na pancreatite aguda grave. Infiltração de neutrófilos no pâncreas é um processo complexo, coordenado por moléculas de adesão específicas, tais como a P-selectina. Fucoidina é um polissacarídeo sulfatado que bloqueia a função da L-e P-selectinas. No presente estudo avaliamos se o tratamento com fucoidina poderia impedir a infiltração de neutrófilos e, assim, reverter a inflamação sistêmica e dismotilidades gastrintestinais associadas à pancreatite aguda grave. Métodos: A pancreatite aguda foi induzida em camundongos Swiss pela infusão retrógrada de ácido taurolitocólico (3,0%) (TLC-S) no ducto pancreático ou por injeções intraperitoneais de ceruleína (50 µg/kg/h). Os grupos experimentais receberam fucoidina (25 mg/kg, iv) antes da indução da pancreatite, e os grupos de controle receberam apenas solução salina. Após 24 horas, os níveis séricos de amilase, lipase, IL-1β, TNF-α, nitrito e de malondialdeído (MDA) pancreático foram medidos. Além disso, a atividade de mieloperoxidase (MPO) (pulmão, pâncreas, estômago e jejuno) e avaliação histológica (pâncreas) foram determinadas. O esvaziamento gástrico e trânsito gastrintestinal foram medidos pelo método de centro geométrico. A contratilidade gastrintestinal in vitro foi registrada através de transdutores de força conectados a sistema computadorizado de aquisição de dados. Carbacol (0,01 µM - 30 µM), KCl 60 mM e estimulação eléctrica (0,5-8,0 Hz; 1ms, 40 V), foram aplicados sobre o fundo gástrico e jejuno dos animais 24 horas após a pancreatite induzida por TLC-S. Resultados: Os níveis de MDA pancreático, amilase, lipase, nitrito, TNF-α e IL-1β séricos, bem como MPO pancreática e pulmonar estavam aumentados tanto no modelo de pancreatite aguda induzida por TLCS quanto no modelo ceruleína quando comparado aos grupos controle correspondentes. Fucoidina reduziu significativamente os níveis aumentados de amilase, lipase, MPO pancreática e pulmonar, MDA, TNF-α, IL-1β e nitrito em ambos os modelos de pancreatite aguda. As mudanças histológicas observadas no pâncreas em ambos os modelos foram significativamente atenuadas pela fucoidina. O modelo de pancreatite aguda induzida por TLC-S induziu retardo no esvaziamento gástrico e trânsito gastrointestinal, aumento de MPO no estômago e no jejuno, além de hipercontratilidade de jejuno in vitro. Fucoidina reverteu significativamente os distúrbios gastrintestinais in vivo e in vitro e os níveis aumentados de MPO gástrica e jejunal induzidos pela injeção de TLC-S. Conclusão: Fucoidina reduziu a gravidade da pancreatite aguda experimental através da diminuição da infiltração de neutrófilos, inflamação sistêmica e dismotilidades gastrintestinais, sugerindo que a modulação das selectinas, pode constituir uma abordagem terapêutica promissora para pancreatite aguda.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-23T17:29:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 983334 bytes, checksum: 7f0471578fe8924654865e3402110776 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-23T17:29:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 983334 bytes, checksum: 7f0471578fe8924654865e3402110776 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neutrófilos são as primeiras células do sistema imune a migrarem para o tecido inflamado e exercem a importante função de fagocitose e eliminação imediata de patógenos invasores. A ativação de neutrófilos é um processo de múltiplos passos e de alta complexidade. A busca por agentes biológicos capazes de modular o processo de ativação, migração, fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é importante pois aumentam a gama de opções para utilização na pesquisa. Nesse trabalho utilizamos a lectina extraída de Brassica oleracea (BOL) a fim de avaliar a sua capacidade na modulação da resposta de neutrófilos. Para os ensaios nós purificamos neutrófilos de camundongo tanto do sangue periférico quanto da cavidade peritoneal buscando avaliar sua capacidade migratória, o índice de CD62L na superfície e o índice fagocítico de neutrófilos pré-incubados com BOL. A lectina apresentou diversos efeitos de acordo com a dose utilizada, sendo possível observar o efeito de indução de migração para cavidade peritoneal de camundongos quando utilizada em doses intermediárias (1 μg/mL e 2,5 μg/mL) tanto quanto o efeito de redução de migração quando observada em doses altas (5 μg/mL e 10 μg/mL). O índice de fagocitose também foi avaliado e houve alteração de acordo também com a dose utilizada. As doses mais altas apresentaram efeito de redução na taxa de fagocitose (5 μg/mL e 10 μg/mL) enquanto as outras doses não apresentavam diferença estatística. Com esse trabalho conseguimos observar os efeitos imunomodulatórios sobre neutrófilos de uma lectina ainda muito pouco estudada e que demonstrou ter efeitos sobre a fisiologia de neutrófilos de acordo com a dose escolhida, alterando sua capacidade de migração e fagocitose. / Neutrophils are the first cells of the immune system to migrate into inflamed tissue and they develop the important function of phagocytosis and immediate elimination of invading pathogens. Neutrophil activation is a multi-step and highly complex process. Research on biological agents able to modulate the activation, migration, phagocytosis and production of reactive oxygen species (ROS) are important because they increase the range of options for use in the research. In this work we used the lectin extracted from Brassica oleracea (BOL) aiming to evaluate its ability to modulate the neutrophil response. For the tests, we purified mouse neutrophils from the peripheral blood and the peritoneal cavity with the objective to evaluate their migratory capacity, the surface CD62L index and the phagocytic index of neutrophils pre-incubated with BOL. The lectin presented several effects according to the dose used, being possible to observe the effect of induction of migration to peritoneal cavity when it was used in intermediate doses (1 μg/mL and 2.5 μg/mL) as well as the effect of reduction of migration as observed at high doses (5 μg/ mL and 10 μg/mL). The phagocytosis index was also evaluated and there was also an alteration according to the dose used. Higher doses showed a smaller phagocytosis rate (5 μg/mL and 10 μg/mL), unlike the other doses. In this work we were able to observe the immunomodulatory effects on neutrophils of a lectin that has not yet been studied and has shown to have effects on neutrophil physiology according to the chosen dose, altering its migration capacity and phagocytosis.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / IntroduÃÃo e objetivos: Os neutrÃfilos desempenham importante papel na pancreatite aguda grave. InfiltraÃÃo de neutrÃfilos no pÃncreas à um processo complexo, coordenado por molÃculas de adesÃo especÃficas, tais como a P-selectina. Fucoidina à um polissacarÃdeo sulfatado que bloqueia a funÃÃo da L-e P-selectinas. No presente estudo avaliamos se o tratamento com fucoidina poderia impedir a infiltraÃÃo de neutrÃfilos e, assim, reverter a inflamaÃÃo sistÃmica e dismotilidades gastrintestinais associadas à pancreatite aguda grave. MÃtodos: A pancreatite aguda foi induzida em camundongos Swiss pela infusÃo retrÃgrada de Ãcido taurolitocÃlico (3,0%) (TLC-S) no ducto pancreÃtico ou por injeÃÃes intraperitoneais de ceruleÃna (50 Âg/kg/h). Os grupos experimentais receberam fucoidina (25 mg/kg, iv) antes da induÃÃo da pancreatite, e os grupos de controle receberam apenas soluÃÃo salina. ApÃs 24 horas, os nÃveis sÃricos de amilase, lipase, IL-1β, TNF-α, nitrito e de malondialdeÃdo (MDA) pancreÃtico foram medidos. AlÃm disso, a atividade de mieloperoxidase (MPO) (pulmÃo, pÃncreas, estÃmago e jejuno) e avaliaÃÃo histolÃgica (pÃncreas) foram determinadas. O esvaziamento gÃstrico e trÃnsito gastrintestinal foram medidos pelo mÃtodo de centro geomÃtrico. A contratilidade gastrintestinal in vitro foi registrada atravÃs de transdutores de forÃa conectados a sistema computadorizado de aquisiÃÃo de dados. Carbacol (0,01 ÂM - 30 ÂM), KCl 60 mM e estimulaÃÃo elÃctrica (0,5-8,0 Hz; 1ms, 40 V), foram aplicados sobre o fundo gÃstrico e jejuno dos animais 24 horas apÃs a pancreatite induzida por TLC-S. Resultados: Os nÃveis de MDA pancreÃtico, amilase, lipase, nitrito, TNF-α e IL-1β sÃricos, bem como MPO pancreÃtica e pulmonar estavam aumentados tanto no modelo de pancreatite aguda induzida por TLCS quanto no modelo ceruleÃna quando comparado aos grupos controle correspondentes. Fucoidina reduziu significativamente os nÃveis aumentados de amilase, lipase, MPO pancreÃtica e pulmonar, MDA, TNF-α, IL-1β e nitrito em ambos os modelos de pancreatite aguda. As mudanÃas histolÃgicas observadas no pÃncreas em ambos os modelos foram significativamente atenuadas pela fucoidina. O modelo de pancreatite aguda induzida por TLC-S induziu retardo no esvaziamento gÃstrico e trÃnsito gastrointestinal, aumento de MPO no estÃmago e no jejuno, alÃm de hipercontratilidade de jejuno in vitro. Fucoidina reverteu significativamente os distÃrbios gastrintestinais in vivo e in vitro e os nÃveis aumentados de MPO gÃstrica e jejunal induzidos pela injeÃÃo de TLC-S. ConclusÃo: Fucoidina reduziu a gravidade da pancreatite aguda experimental atravÃs da diminuiÃÃo da infiltraÃÃo de neutrÃfilos, inflamaÃÃo sistÃmica e dismotilidades gastrintestinais, sugerindo que a modulaÃÃo das selectinas, pode constituir uma abordagem terapÃutica promissora para pancreatite aguda. / Background & Aims: Neutrophils play a critical role in severe acute pancreatitis. Tissue infiltration of neutrophils in the pancreas is a multistep process, coordinated by specific adhesion molecules, such as P-selectin. Fucoidin is a sulphated fucosylated polysaccharide that binds to and blocks the function of L- and P-selectins, and the present study has evaluated whether fucoidin treatment could prevent neutrophil infiltration, and thereby reverse the systemic inflammation and gastrointestinal dysmotility associated with severe acute pancreatitis. Methods: Acute pancreatitis was induced in Swiss mice either by the retrograde infusion of taurolithocholic acid (3.0%) (TLC-S) into the pancreatic duct or by intraperitoneal injections of cerulein (50 Âg/kg/h). The experimental groups received fucoidan (25 mg/kg, i.v.) before pancreatitis induction whist control groups received only saline. After 24 hours, pancreatic malondialdehyde (MDA), serum amylase, lipase, IL-1β, TNF- and nitrite were measured. In addition, myeloperoxidase (MPO) activity (lung, pancreas, stomach and jejunum) and histological assessment (pancreas) were determined. Gastric emptying and gastrointestinal transit (using the geometric center method) were also measured. Gastrointestinal contractility in vitro was recorded through force transducers coupled to a computerized data acquisition system, carbachol (0,01 ÂM â 30 ÂM), KCl 60mM and electrical field stimulation (0.5-8.0 Hz; 1ms; 40 V), was applied on gastric fundus and jejunum of mice 24 hours after TLC-S induced pancreatitis. Results: Pancreatic MDA, serum amylase, lipase, nitrite, TNF- and IL-1β, pancreatic and lung MPO, were increased in both TLCS- and cerulein acute pancreatitis compared with respective control groups. Fucoidan significantly decreased the augmented levels of amylase, lipase, pancreatic and lung MPO, MDA, TNF-, IL-1β and nitrite in both acute pancreatitis models. Pancreas histological changes observed in both models were significantly attenuated by fucoidan. The acute pancreatitis model induced by TLC-S caused delayed gastric emptying and gastrointestinal transit, incresead gastric and jejunum MPO, and jejunum hypercontractility in vitro. Fucoidan significantly reversed the gastrointestinal disorders in vivo and in vitro and augmented levels of gastric and jejunum MPO induced by TLC-S. Conclusion: Fucoidan reduced the severity of acute pancreatitis in mice by decreasing neutrophil infiltration, systemic inflammation and gastrointestinal dysmotility, suggesting that modulation of selectins may constitute a promising therapeutic approach for acute pancreatitis.