Les métastases sont des conséquences dramatiques lors de la progression des cancers. Malgré les traitements actuels la médiane de survie de patients atteints de métastases osseuses n’est que de 24 mois. Donc l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement ou la prévention des métastases revêt un caractère crucial. L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier le rôle de l’acide lysophosphatidique (LPA) et de l’autotaxine (ATX) dans la dissémination métastatique des cancers du sein. Notre laboratoire a montré que le LPA contrôle la croissance tumorale et la progression des métastases osseuses dans le contexte des cancers du sein. On sait depuis peu qu’en raison de son activité lysophospholipase D, ATX produit du LPA à partir de la lysophosphatidylcholine et contrôle les niveaux de LPA dans la circulation sanguine. ATX est une protéine sécrétée présentant des propriétés métastatiques. Les travaux présentés dans cette thèse montrent que l'expression d'ATX par les cellules tumorales contrôle les événements précoces de la dissémination métastatique des cancers du sein ainsi que le processus plus tardif de formation et de progression des métastases osseuses en agissant sur la fonction ostéoclastique. Il existe un grand nombre de récepteurs capables de transmettre l’activation cellulaire par le LPA (LPA1-6). Ce travail de thèse montre également que le niveau d’expression du récepteur LPA1 au niveau de la tumeur primaire est un facteur prédictif de la rechute métastatique chez les patientes ayant un cancer du sein. D’autre part dans un modèle animal préclinique, nous avons observé que le ciblage thérapeutique précoce de LPA1 par le DEBIO-0719 bloque efficacement la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein. En conclusion, nos résultats montrent que le ciblage de l’axe ATX/LPA/LPA1 présente un haut potentiel thérapeutique chez des patientes atteintes d’un cancer du sein à fort risque métastatique / Metastases consist of poor disease progression for patients with cancers. Bone metastases are frequently found in multiple cancers. Despite the improvement of current therapies, the survival of bone metastasis patients is only 24 months. The aim of this work consisted in understanding the role of lysophosphatidic acid (LPA), autotaxin (ATX) and the LPA receptor LPA1 in the metastatic dissemination of breast cancers. Our laboratory showed previously that LPA produced tumor growth and the progression of osteolytic bone metastases of breast cancer cells. Due to its lysophospholipase D activity, ATX generates LPA from lysophosphatidylcholine and controls LPA levels in the blood. ATX is a secreted protein with metastatic properties. In the present thesis, we first demonstrated that ATX expressed by tumors cells controls early events of metastatic dissemination of breast cancer cells and latter bone metastases formation and progression by acting on osteoclastic function. There is a large number of receptors mediating the cellular activation of LPA (LPA1-6). This work showed additionally that the LPA1 expression level at the primary tumor site is predictive for the metastatic relapse of breast cancers. On the other hand, in a preclinical animal model, we observed that targeting LPA1 at early stage of tumor development with the DEBIO-0719 decreased efficiently the metastatic dissemination of breast cancer cells. Altogether, these results indicate that targeting the ATX/LPA/LPA1 track has a high therapeutic potential against metastasis formation for patients with breast cancer

L'acide lysophosphatique est un biolipide naturel actif capable de réguler diverses fonctions biologiques et d'agir en tant que facteur de croissance, via l'activation de six différents récepteurs de surfaces couplées aux protéines G (LPA1-6). Notre laboratoire a montré que le ciblage thérapeutique du récepteur LPA1 bloque de façon remarquable la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein. Les mécanismes moléculaires et génétiques impliqués dans ce processus sont cependant encore inconnus. De plus, la plupart des cellules de mammifères co-expriment plusieurs formes de récepteurs du LPA. La réponse cellulaire est la résultante de l'activation de multiples voies de signalisation, parfois synergiques ou opposées, compromettant la validation chez le patient de l'efficacité des thérapies ciblant ces récepteurs. Au cours de cette thèse, nous avons dans un premier temps montré que HB-EGF est un marqueur spécifique de l'activité de LPA1. Le blocage pharmacologique de ce récepteur via des antagonistes des récepteurs LPA1-3 (Ki16425/Debio0719) ou l'invalidation de son expression par une technique d'ARN interférence entraine une inhibition de la surexpression en HB-EGF. Le ciblage thérapeutique de LPA1 via l'antagoniste Ki16425, dans notre modèle animal préclinique de xénogreffe de cancer de la prostate PC3, conduit également à une diminution de l'expression en ARNm de HB-EGF au niveau de la tumeur primaire et à une diminution des concentrations en HB-EGF humain circulants dans le sérum. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressé au rôle des miRNAs, qui sont impliqués dans la régulation de l'expression de gènes. Grâce à l'analyse de 1488 patients atteins de cancers du sein référencés sur des bases de données publiques, nous avons pu établir une corrélation entre le gène LPA1 et le gène ZEB1. Nous avons également trouvé que le coefficient de corrélation entre ZEB1 et LPA1 était supérieur au niveau des tumeurs mammaires basales / Lysophosphatidic acid (LPA) is a natural bioactive lipid with growth factor-like functions due to activation of a series of six G protein-coupled receptors (LPA1-6). It has been demonstrated that blocking LPA1 activity in vivo inhibits breast cancer cell metastasis, however, activated genes involved in LPA-induced metastasis have not been defined yet. In addition most mammalian cells co-express multiple LPA receptors, resulting in the co-activation of multiple intracellular signaling pathways with potential redundant or opposite effects impairing the validation of target inhibition in patients because of missing LPA receptor-specific biomarkers. In the first part of this thesis I found that HB-EGF is a specific biomarker of LPA1 activity. HB-EGF upregulation was inhibited by LPA1-3 antagonists (Ki16425, Debio0719) and by stably silencing LPA1. Using a human xenograft prostate tumors mouse model with PC3 cells, we found that a five-day treatment with Ki16425 significantly decreased both HB-EGF mRNA expression at the primary tumor site and circulating human HB-EGF concentrations in serum. In the second part of experimental work, we focused our attention on miRNAs that are master gene regulators. We carried out correlation studies in 1488 human primary breast tumors from publically available databases and found ZEB1 as the most correlated gene with LPAR1. The coefficient of correlation between ZEB1 and LPAR1 was higher in human basal tumors than in non basal tumors. In three different basal cell lines LPA up-regulated ZEB1 through an LPA1/Phosphatidylinositol-3-Kinase (Pi3K)/AKT-dependent pathway. Based on microarray and real-time PCR analyses we found that LPA up-regulated the oncomiR miR-21 through an LPA1/Pi3K/AKT/ZEB1-dependent mechanism. MirVana miR-21 inhibitor, silencing LPA1 or silencing ZEB1 totally blocked in vitro LPA-induced cell migration and invasion, and in vivo tumor cell bone colonization. In all cases, basal breast cancer cell functions were rescued with mirVana miR-21 mimic. All together our results identify HB-EGF as a new and relevant biomarker with potentially high value in quantifying LPA1 activation state in patients receiving anti-LPA1 therapies

Lysophosphatidic acid (LPA) is a mitogenic lipid that enhances cell growth, proliferation and motility through binding and activation of at least four receptors, LPA1/Edg2, LPA2/Edg4, LPA3/Edg7, and PPAR and #947;. Here, we show that LPA stimulation inhibits the cell cycle regulator and tumor suppressor, p53. Ten M LPA reduced the cellular levels of total p53 and p53 phosphorylated at serine 15 by approximately 50% in A549 cells and this effect was sustained for at least 6 h. This resulted in a corresponding decrease in p53-mediated transcription. Transient-transfection of the Edg-family LPA receptors, LPA1-3 in HepG2 cells, which do not respond to LPA, also showed this inhibitory response. The response was specific to LPA receptors since neither Gi-coupled M2 muscarinic acetylcholine receptors, nor a mutant LPA1 receptor (LPA1 R124A), which is unable to bind LPA, inhibited p53 activity. Both transient-transfection of the LPA-degrading lipid phosphate phosphatase-1 (LPP-1), or exogenous addition of phospholipase B, which decreases exogenous lysophosphatidate, reversed the LPA receptor-induced decrease in p53-mediated transcription. Although pertussis toxin did not prevent the inhibition of p53, a mutant LPA1 receptor (LPA1 and #8710;361), which lacks the C-terminal PDZ-binding domain, failed to inhibit p53 function. This establishes LPA-mediated inhibition of p53 function requires an interaction with PDZ-containing proteins. These data establish a novel role for LPA-mediated receptor activation in diminishing p53 activity; which, in addition to LPAs well-characterized effects on growth-promoting signaling pathways, is likely to contribute to the survival and proliferation of cancer cells. Of the Edg-family LPA receptors, the LPA1 receptor is the most widely expressed. In the next study, we investigated the agonist-induced endocytosis of the human LPA1 receptor, bearing an N-terminal FLAG epitope tag, in stably transfected HeLa cells. LPA treatment induced the rapid endocytosis of approximately 40% of surface LPA1 within 15 minutes. Internalization was dose dependent and LPA specific since neither lysophophatidylcholine nor sphingosine-1-phosphate induced LPA1 endocytosis. Removing agonist following incubation resulted in LPA1 recycling back to the surface. LPA1 internalization was strongly inhibited by dominant-inhibitory mutants of both dynamin2 (K44A) and Rab5a (S34N). Finally, our results indicate that LPA1 exhibits basal, LPA-dependent internalization in the presence of serum-containing medium.

The following thesis research was undertaken to gain a better understanding of the mechanisms that regulate the cellular trafficking and signaling of the endothelial differentiation gene (EDG) family of G-protein coupled receptors, LPA1, LPA2, and LPA3. This thesis will specifically focus on the regulation of the trafficking of the LPA1 Lysophosphatidic acid receptor, which is the most widely expressed and has been shown to be a major regulator of migration of cells expressing it. The initial studies undertaken in this project were aimed at understanding the endocytic pathway followed by the LPA1 receptor. Lysophosphatidic acid (LPA), an abundant serum phospholipid, stimulates heterotrimeric G protein signaling by activating three closely related receptors, termed LPA1, LPA2 and LPA3. In the first part of the project we show that in addition to promoting LPA1 signaling, membrane cholesterol is essential for the association of LPA1 with β-arrestin, which leads to signal attenuation and clathrin dependent endocytosis of LPA1. The second phase of the project was aimed at elucidating the different structural motifs required for the trafficking and signaling of the LPA1 receptor and helping us gain a more mechanistic view of the processes involved in its regulation. In the second part of the project we show that agonist-independent internalization of the LPA1 receptor is clathrin adaptor, AP-2 dependent and PKC-dependent and that it requires a distal dileucine motif, whereas agonist-dependent internalization of the LPA1 receptor is β-arrestin and clathrin-dependent and requires a cluster of serine residues in the tail region, which is upstream of the dileucine motif. These studies collectively vastly enhance our understanding of mechanisms that regulate LPA1 trafficking and signaling. These studies can also be applied to other G-protein coupled receptors making the task easier for other scientists to understand this vast family of receptors.

Les métastases sont des conséquences dramatiques lors de la progression des cancers. Malgré les traitements actuels la médiane de survie de patients atteints de métastases osseuses n'est que de 24 mois. Donc l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement ou la prévention des métastases revêt un caractère crucial. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier le rôle de l'acide lysophosphatidique (LPA) et de l'autotaxine (ATX) dans la dissémination métastatique des cancers du sein. Notre laboratoire a montré que le LPA contrôle la croissance tumorale et la progression des métastases osseuses dans le contexte des cancers du sein. On sait depuis peu qu'en raison de son activité lysophospholipase D, ATX produit du LPA à partir de la lysophosphatidylcholine et contrôle les niveaux de LPA dans la circulation sanguine. ATX est une protéine sécrétée présentant des propriétés métastatiques. Les travaux présentés dans cette thèse montrent que l'expression d'ATX par les cellules tumorales contrôle les événements précoces de la dissémination métastatique des cancers du sein ainsi que le processus plus tardif de formation et de progression des métastases osseuses en agissant sur la fonction ostéoclastique. Il existe un grand nombre de récepteurs capables de transmettre l'activation cellulaire par le LPA (LPA1-6). Ce travail de thèse montre également que le niveau d'expression du récepteur LPA1 au niveau de la tumeur primaire est un facteur prédictif de la rechute métastatique chez les patientes ayant un cancer du sein. D'autre part dans un modèle animal préclinique, nous avons observé que le ciblage thérapeutique précoce de LPA1 par le DEBIO-0719 bloque efficacement la dissémination métastatique des cellules de cancer du sein. En conclusion, nos résultats montrent que le ciblage de l'axe ATX/LPA/LPA1 présente un haut potentiel thérapeutique chez des patientes atteintes d'un cancer du sein à fort risque métastatique