Salmonella enterica sorovar (S.) Enteritidis é uma das principais bactérias envolvidas em surtos de infecção alimentar em humanos decorrentes do consumo de produtos de origem animal. Nas investigações epidemiológicas, a subtipificação fenotípica e genotípica permitem verificar diferenças ou similaridades entre linhagens, as quais podem indicar sua origem, auxiliando os programas de controle e prevenção do patógeno. No presente trabalho, foram analisados os padrões de resistência a antimicrobianos, fagotipificação, macrorestrição de DNA seguida de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e polimorfismo de comprimento do fragmento amplificado utilizando uma única enzima de restrição (SEAFLP) de 107 linhagens de S. Enteritidis, sendo 53 isoladas de aves e seus produtos (carcaças, carne, vísceras e ambiente) e uma de origem suína. Foram ainda analisadas 29 linhagens isoladas de alimentos e 14 isoladas de humanos envolvidos em surtos de salmonelose notificados no Rio Grande do Sul, uma amostra de referência (ATCC 13076), além de 9 linhagens isoladas na Europa e África. Na comparação entre amostras isoladas de aves e de surtos de salmonelose, as linhagens de origem avícola foram significativamente mais resistentes a antimicrobianos do que as isoladas de humanos e, embora não tenha sido encontrada relação entre os genótipos de PFGE e os padrões de resistência, a associação de ambas as técnicas possibilitou uma melhor caracterização de S. Enteritidis, podendo ser úteis como marcadores epidemiológicos. Por outro lado, SE-AFLP agrupou a maioria das linhagens de S. Enteritidis num padrão principal. Paralelamente, na comparação de técnicas genotípicas com base em PCR, SE-AFLP apresentou maior capacidade de discriminação, embora inferior à verificada pela fagotipificação e perfil de resistência a antimicrobianos. Assim, foi recomendado que esta técnica deve ser utilizada em associação com outras metodologias na tipificação de S. Enteritidis. Posteriormente, na caracterização do conjunto de linhagens de S. Enteritidis, foram identificados 13 diferentes padrões de resistência a antimicrobianos, além de 12 padrões de PFGE e 3 de SE-AFLP. As técnicas genotípicas demonstraram que existe um genótipo predominante de S. Enteritidis no Rio Grande do Sul, o qual está presente em aves e produtos relacionados, além de alimentos e humanos envolvidos em surtos de salmonelose, sugerindo que estas linhagens possam derivar de uma fonte comum, tendo provável relação clonal. Embora havendo um genótipo predominante de S. Enteritidis, a associação das técnicas propostas possibilitou a melhor caracterização do patógeno. / Salmonella enterica subsp. enterica (S.) serovar Enteritidis is one of the main pathogens involved in food-borne diseases worldwide. Subtyping is crucial to differentiate strains, as well to study its origin and major infection route, which can direct preventive and control measures in epidemiological investigations of food-related salmonellosis. In order to investigate phenotypic and genotypic characterization in S. Enteritidis, the aim of this study was analyze the antimicrobial resistance, phage types, pulsed-field gel elecrophoresis (PFGE) and single-enzyme amplified-fragment length polymorphism (SEAFLP patterns of 107 S. Enteritidis strains isolated from poultry (53 isolates from carcass, meat, viscera and environmental swab) and one from swine. We also analyzed 29 strains from food and 14 from humans involved in salmonellosis outbreaks in Rio Grande do Sul, one reference strain (ATCC 13076) and 9 strains isolated from African and European countries. Resistance rates found in poultry-related strains were significantly higher than that observed in strains isolated from humans. Since identical PFGE profiles were identified in antimicrobial resistant and susceptible strains, it was not possible to find relationship between the PFGE genotypes and the antimicrobial resistance patterns found. However, both approaches were able to improve S. Enteritidis characterization. On the other hand, SE-AFLP clustered most of the S. Enteritidis strains in a major pattern. In a comparison between based-PCR approaches, SE-AFLP showed a higher discriminatory power, although it was lower than that displayed by antimicrobial resistance and phage type patterns. Thus, SE-AFLP might be used associated to other approaches for S. Enteritidis characterization. In contrast, 13 different antimicrobial resistance patterns, 12 PFGE genotypes and 3 SE-AFLP genotypes were identified in the S. Enteritidis strains. Genotypic approaches showed that the strains isolated from poultry, poultry-related products, food and humans involved in salmonelosis outbreaks shared a major pattern. These results suggest that the strains have a close relationship and the association of the different approaches improved S. Enteritidis characterization.

O interesse da Medicina Veterinária nas espécies silvestres tem aumentado gradativamente, principalmente no estudo dos contextos ecológicos de saúde. Dentro desse contexto, autores realizaram estudos com o objetivo de conhecer a importância de Salmonella sp. na saúde das aves silvestres e seu potencial de transmissão para humanos e outros animais. Informações sobre a prevalência e distribuição dos sorovares de salmonelas na população de animais silvestres e domésticos são essenciais para relacionar os possíveis reservatórios que possam ser responsáveis pela transmissão dessa zoonose. Este trabalho teve como objetivo a detecção de Salmonella sp. em psitacídeos clinicamente sadios por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Foram coletados suabes cloacais de 280 psitacídeos mantidos em cativeiro no Estado do Rio Grande do Sul, pertencentes a treze espécies, provenientes de um zoológico, um criadouro conservacionista e um criadouro comercial. O DNA das amostras foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e examinados pela PCR com a utilização de um par de iniciadores que amplifica um fragmento de 284 pb do gene invA pertencente ao gênero Salmonella, resultando em 37 amostras positivas. Não houve diferença na prevalência de salmonela entre os três plantéis nem entre as 13 espécies analizadas. Não foi possível a detecção desse patógeno pela PCR com iniciadores para a identificação de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Pullorum e S. Gallinarum, nem através da Técnica Microbiológica Convencional nas amostras detectadas pela PCR genérica, provavelmente devido a maior sensibilidade e especificidade da PCR genérica. De acordo com a revisão bibliográfica realizada, este foi o primeiro trabalho de detecção direta de Salmonella em psitacídeos utilizando a PCR. Os resultados indicaram que aproximadamente 13,2% dos psitacídeos mantidos em cativeiro eram portadores assintomáticos ou eram transientemente infectados pelo gênero Salmonella.

A detecção de Salmonella sp. é fundamental nos programas de controle de salmonelose. Métodos de detecção mais eficientes permitem uma melhor determinação do nível de infecção dos rebanhos, um melhor entendimento da epidemiologia da infecção por Salmonella sp. e o desenvolvimento de programas de controle do patógeno, que visem a segurança biológica do alimento. Nos métodos convencionais, o enriquecimento seletivo é uma etapa crítica, pois inibe a microbiota competitiva e permite a multiplicação de Salmonella sp. Vários caldos de enriquecimento seletivo têm sido comparados quanto à eficiência na recuperação de Salmonella sp. a partir de alimentos, contudo existem poucos estudos relativos a fezes de suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar caldos de enriquecimento seletivo para o isolamento de Salmonella sp. a partir de fezes de suínos. Numa primeira fase, amostras de fezes foram contaminadas artificialmente e os caldos Rappaport-Vassiliadis incubado a 42°C (RV), Tetrationato Müller-Kauffmann a 37°C (TMK37) e 42°C (TMK42), e Selenito Cistina (SC) a 37°C foram testados, em associação com meios sólidos seletivos: Rambach (RA), Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4), e Verde Brilhante Vermelho de Fenol Lactose Sacarose (VB). Na segunda fase os caldos RV, TMK37 e TMK42, semeados nos meios XLT4 e VB, foram testados com amostras naturalmente contaminadas. Na primeira fase o RV, TMK42 e TMK37 foram mais eficientes que o SC. No isolamento de Salmonella sp. em amostras naturalmente contaminadas os caldos TMK42 e RV foram superiores ao TMK37. O desempenho destes influenciou diretamente a capacidade seletiva e indicadora dos meios sólidos seletivos. No presente estudo, a associação TMK42/XLT4 demonstrou ser mais sensível, e a RV/XLT4 mais específica. O ágar VB também é recomendado para aumentar a probabilidade de detecção do patógeno. Desta forma os caldos RV e TMK42 e o ágar XLT4 e o VB foram considerados os mais indicados para a implantação de protocolos de detecção de Salmonella sp. em fezes suínas. / Detection of Salmonella is a key point in veterinary Salmonella research and surveillance programs. Through an efficient method for pathogen detection, the herd infection leveI could be better determinated, which would permit the understanding of Salmonella infection epidemiology and the developing of pathogen control programs in order to achieve biological food safety. In a conventional isolation method, the selective enrichment is a critical step because it suppresses competitive microflora and permits Salmonella sp. to proliferate. Several selective enrichment broths have been compared for recovering Salmonella sp. from foods. However the isolation ITomswine feces has been conduct in a few studies. The aim of this study was to compare the efficiency of different selective enrichment methods for the isolation of Salmonella sp. from swine feces. In a first step, swine feces samples were artificially contaminated and Rappaport- Vassiliadis broth incubated at 42°C (RV), MüIler-Kauffmann tetrathionate broth at 37°C (MKT37) and 42°C (MKT42), and Selenite Cystine broth at 37°C (SC) were tested, in association with selective plating media: Xylose Lisine Tergitol 4 (XLT4), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BG). Later, in a second step, RV, MKT42 and MKT37 broths were streaked in XLT4 and BG media and tested with naturally contaminated samples. At the first step RV, MKT42 and MKT37 broths were more efficient than SC broth. When Salmonella sp. were isolated from naturally contaminated samples MKT42 and RV broth were superior to MKT37. The performance of the broths affected the selectivity and differentiation capacity of the selective plating media used. In the present study the association MKT42/XLT4 was the most sensitive and RV/XLT4 was the most specific. The use of BG agar is also recommended to improve the likelihood of Salmonella sp. detection. Therefore, RVand MKT42 broth, and XLT4 and VB media were considered the most appropriated to be used in detection protocols of Salmonella sp. from swine feces.

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de gerar dados de resistência a agentes antimicrobianos de Salmonella Enteritidis (SE) isoladas de amostras clínicas e do ambiente criatório de aves, nos anos de 1999, 2000 e 2001, de cortes de frango, no ano de 1996, ambos na região Sul, bem como de carcaças de frango, nos anos de 2004 e 2005, na região Nordeste, detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas das cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico e fagotipá-las. Realizou-se também a ribotipagem de 28 cepas de SE isoladas de carcaças resfriadas de frango no ano de 2004, na região Sudeste. Cento e dezesete cepas de SE foram submeitdos foram submetidas a testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos e os resultados indicaram que 84,6% (99/117) das cepas de Salmonella Enteritidis apresentaram resistência a um ou mais agentes antimicrobianos, sendo que o maior percentual está entre as cepas isoladas de carcaças resfriadas de frango, 100% (17/17), seguidas pelas isoladas de cortes de frango, 85,7% (18/21) e das de amostras clínicas e de ambiente criatório de aves, 81% (64/79). Cepas com diferentes níveis de resistência foram encontradas para ampicilina (0,8%), canamicina (1,7%), ciprofloxacina (1,7%), enrofloxacina (10,2%), gentamicina (14,5%), estreptomicina (16,2%), ácido nalidíxico (35,9%), nitrofurantoína (47%) e tetracicilna (59%). Nenhuma das 117 cepas de Salmonella Enteritidis foi resistente ao cloranfenicol, norfloxacina e polimixina B. Dentre as 99 amostras de SE que apresentaram resistência, 66,6% (66), foram resistentes a dois ou mais agentes antimicrobianos. Trinta e três cepas (33,3%), foram resistentes somente a um agente antimicrobiano, 16 a tetraciclina, 12 a nitrofurantoína, três ao ácido nalidíxico, uma a estreptomicina e uma a gentamicina. Para detectar mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas, 42 cepas de SE que apresentaram resistência ao ácido nalidíxico foram submetidas a reação em cadeia da polimerase e sequenciamento. Das 42 cepas, 30 (71,4%) apresentaram algum tipo de mutação no gene gyrA da região determinante de resistência a quinolonas. As alterações gênicas ocorreram nos aminoácidos dos codons Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) ou Asp-87 (62%). As mutações continham alterações de Gly para Asp (n: 1) no codon 81, Asp para Asn (n: 1) no codon 82, Ser para Phe (n: 9) no codon 83 e Asp para Tyr (n: 9) ou Asn (n: 9) no codon 87. Uma amostra apresentou uma inclusão do aminoácido prolina entre os codons 56 e 57. A fagotipificação de 116 cepas de SE apresentou que 68,9% (80/116) pertencem ao fagotipo (FT) 4, 15,5% (18/116) ao FT 4a, 12,2% (14/116) ao FT 1, 0,9% (1/116) ao FT6, 0,9% (1/116) ao FT 6a, 0,9% (1/116) ao FT 7 e 0,9% (1/116) ao FT 7a. Quando leva-se em consideração a origem dos isolados, observamos que nas SE isoladas de amostras clínicas e ambientais criatório de aves, 56,4% pertencem ao FT 4, 21,8% ao FT 4a, 17,9% ao FT 1, 1,3% ao FT 6, 1,3% ao FT 6a e 1,3% ao FT 7a. Nas amostras isoladas de carne cortes de frango, o FT 4 predomina com 95,2% (20/21) e 4,8% (1/21), pertencem ao FT 7. Nos isolados de carcaças resfriadas de frango 94,1% são do FT 4 e 5,9% (1/17) do FT 4a. A caracterização por ribotipagem foi realizada utilizando-se o RiboPrinter® system (DuPont), e apresentou quatro diferentes ribotipos, sendo que o mais comum foi o 25-S-1 (82,1%), seguido pelo 29-S-5 (10,7%) e 28-S-5 e 38-S-3 com 3,5% cada um. Baseados nos dados do presente estudo, conclui-se que: houve uma elevada percentagem de cepas de Salmonella Enteritidis resistente a um ou mais agentes antimicrobianos, indicando que levantamentos contínuos são necessários na indústria avícola e que existe a necessidade de um uso responsável dos agentes antimicrobianos, baseado na compreensão da ecologia da resistência, da transmissão da bactéria resistente e de genes de resistência, da relação entre o uso do antibiótico e aumento da resistência e de um conhecimento de intervenções efetivas; Que assim como em outros trabalhos amostras de S. Enteritidis resistentes ao ácido nalidíxico, isoladas no Brasil, também apresentam mutação no gene gyrA, da região determinante de resistência a quinolonas; Que o FT 4 foi o predominante e que entre as cepas de S. Enteritidis isoladas de aves e de seu ambiente criatório existe uma maior diversidade de fagotipos quando comparada as isoladas de carcaças de frango; E que ao avaliarmos os dados gerados pela ribotipagem observamos um baixo grau de diversidade gênica entre as cepas de Salmonella Enteritidis utilizadas no presente estudo. / This work aimed to evaluate the antimicrobial resistance of Salmonella Enteritidis (SE) isolated from clinical and environmental poultry samples, during the years of 1999, 2000 and 2001, broiler chicken parts, in 1996, both in Southern Brazil, broiler chicken carcasses, during the years 2004 and 2005, in Northeastern Brazil, detect mutations in the gyrA gene from nalidixic acid resistant and identify their phage type. Also, 28 SE strains isolated during the year 2004 in Southeastern Brazil were characterized by ribotyping. The antimicrobial resistance test was performed using the disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar. The results indicated that 84.6% (99/117) of SE strains were resistant to at least one of the antimicrobial agents tested. Resistance at different levels was found to ampicillin (0.8%), kanamycin (1.7%), cyprofloxacin (1.7%), enrofloxacin (10.2%), gentamycin (14.5%), streptomycin (16.2%), nalidixic acid (35.9%), nitrofurantoin (47%), and tetracycline (59%). None of the SE strains were resistant to chloramphenicol, norfloxacin and polimyxin B. Among the 99 SE strains showing resistance, 66.6% (66) presented multiple resistance, to two or more antimicrobial agents. Thirty-three strains (33.3%) were resistant to only one of the antimicrobial agents, 16 to tetracycline, 12 to nitrofurantoin, 3 to nalidixic acid, 1 to gentamycin, and 1 to streptomycin. Fourty-two nalidixic acid resistant strains were submited to PCR and sequencing to detect gyrA mutation genes. Thirty SE strains (71.4%) showed at least one mutation in gyrA genes of quinolone resistance determining region (QRDR), in the codons corrosponding to Gly-81 (3,5%), Asp-82 (3,5%), Ser-83 (31%) or Asp-87 (62%). These mutants contained a change from Gly to Asp (n: 1) at codon 81, Asp to Asn (n: 1) at codon 82, Ser to Phe (n: 9) at codon 83 and Asp to Tyr (n: 9) or Asn (n: 9) at codon 87. In one sample there was a Pro inclusion between the 56 and 57 codons. The phage typing of 116 SE isolates showed that 68.9% (80/116) belonged to the phage type (PT) 4, 15.5% (18/116) to the PT 4a, 12.2% (14/116) to the PT 1, 0.9% (1/116) to the PT 6, 0.9% (1/116) to the PT 6a, 0.9% (1/116) to the PT 7, and 0.9% (1/116) to the PT 7a. The ribotyping characterization was done using RiboPrinter® system (DuPont), and showed four different ribotypes. The most common ribotype was 25-S-1 (82.1%). The other ribotypes were 29-S-5 (10.7%), 38-S-3 (3.6%) and 28-S-5 (3.6%). In conclusion, the antimicrobial resistance levels presented here suggest a high occurrence of Salmonella Enteritidis strains resistant to at least one antimicrobial agent, indicating the need for continuous surveillance in the poultry industry, and the need for responsible use of antimicrobial agents in food animals, based on a understanding of the ecology of resistance, the transmission of both bacteria and resistance genes, the relationship between antimicrobial agents use and resistance amplification, and the knowledge of effective interventions. S. Enteritidis nalidixic acid resistant strains isolated in Southern and Northeastern Brazil showed mutation in the gyrA gene of QRDR. Phage type 4 was the most common isolated and among S. Enteritidis strains isolated from clinical and environmental poultry samples there were a higher phagetype diversity when compared with broiler chicken carcasses. The S. Enteritidis strains that were ribotyping showed a lower degree of genetic diversity.

PARENTE, Lucélia Saboia. Condiçoes higiênico-sanitárias da água e do camarão em duas fazendas de cultivo de pequeno e médio portes, no Estado do Ceará. 2005. 54 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Instituto de Ciências do Mar, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2005. / Submitted by Debora Oliveira (deby_borboletinha@hotmail.com) on 2011-11-25T15:00:44Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_lsparente.pdf: 282565 bytes, checksum: e8d596d7ce7e8f7e97d6829de5785616 (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid(nadsa@ufc.br) on 2011-12-07T18:03:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_lsparente.pdf: 282565 bytes, checksum: e8d596d7ce7e8f7e97d6829de5785616 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-12-07T18:03:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_lsparente.pdf: 282565 bytes, checksum: e8d596d7ce7e8f7e97d6829de5785616 (MD5) Previous issue date: 2005 / The shrimp species Litopanaeus vannamei is the single most important aquiculture resource in Northeastern Brazil. However, the rapid expansion of the activity has brought with it a number of water and food-borne bacterial diseases. The objective of the present study was to evaluate and compare the sanitary conditions of shrimp and pond water sampled at one small and one medium-sized shrimp farm in Ceará State. Thus, Escherichia coli was quantified by determining the most probable number (MPN) of fecal coliforms (FC) and total coliforms (TC) in a total of 41 water and 37 shrimp samples collected from two ponds at each farm between March and October 2004 and tested for Salmonella. FC and TC levels were roughly the same in water from the two farms, but shrimp collected from the smaller farm were more severely contaminated. Considering all four ponds investigated, 65% of the 80 strains isolated from water samples and 58.1% of the 124 strains isolated from shrimp samples could be identified as E. coli, while Salmonella was detected in two water samples and one shrimp sample. Since these pathogens are of fecal origin and inhabit the intestines of warm-blooded animals, their presence in local shrimp culture is of great relevance to public health and should be carefully monitored by the authorities to prevent contamination through human consumption. / O cultivo do Litopenaeus vannamei representa destaque comercial na aqüicultura do Nordeste do Brasil. Devido o elevado crescimento deste setor, tem-se observado, nos últimos anos grandes perdas ocasionadas por doenças causadas por bactérias, uma vez que muitas doenças são veiculadas através de águas e alimentos contaminados. O objetivo desse trabalho foi avaliar as condições higiênico-sanitárias da água utilizada nos tanques de cultivo e dos camarões neles cultivados de duas fazendas de cultivo de médio e pequeno portes no Estado do Ceará e comparar as condições higiênicas entre elas. Para isso foi feita uma estimativa do Número Mais Provável (NMP) de coliformes toais (CT) e fecais (CF),quantificação de Escherichia coli e pesquisa de Samonella. Foram analisados dois viveiros em cada fazenda e feitas 41 coletas de água e 37 de camarão em ambas fazendas, durante os meses de março a outubro de 2004. Os resultados mostram que a contaminação por CT e CF na água dos viveiros foi igual nas duas fazendas de médio e pequeno portes, e que a contaminação por CT e CF no camarão foi maior na Fazenda de Pequeno Porte. Das 80 cepas isoladas de água de todos os viveiros 65% foram de Escherichia coli e das 124 cepas isoladas de camarão E. coli representou 58,1%. A pesquisa de Salmonella foi confirmada em duas amostras de água e em uma de camarão dos quatro viveiros analisados. A detecção de cepas do sorogrupo de Salmonella e a presença de E. coli nas amostras de água e camarão é preocupante, uma vez que estes patógenos são de origem fecal e seu hábitat é o trato intestinal dos animais de sangue quente. É necessário um monitoramento permanente das águas utilizadas para o cultivo de camarão, uma vez que estes patógenos são causadores de enfermidades para o homem.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-11T18:23:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 765581 bytes, checksum: 2e64a0f66a1ba37820f7fe967a4a87bd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T18:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 765581 bytes, checksum: 2e64a0f66a1ba37820f7fe967a4a87bd (MD5) Previous issue date: 2016-03-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Salmonella é um dos principais micro-organismos implicados nas doenças causadas pela ingestão de alimentos contaminados e, portanto, torna-se necessário assegurar a ausência deste patógeno nos alimentos para garantir a segurança do consumidor. A maioria dos métodos de detecção de Salmonella depende da culturabilidade do patógeno nas condições de laboratório. É sabido que Salmonella pode entrar no estado conhecido como viável não cultivável (VNC) em alimentos ou no ambiente e assim, resistir durante longos períodos de tempo em condições adversas. Durante o estado VNC, a atividade metabólica das células é muito baixa, impossibilitando sua detecção por técnicas de cultivo tradicionais. Isto pode resultar em subestimação ou a não detecção de células viáveis. Considerando a escassez de informações sobre o estado VNC neste patógeno, objetivou-se, neste trabalho, avaliar condições de indução e de recuperação da culturabilidade de Salmonella no estado VNC e caracterizar a morfologia celular neste estado de resistência. A indução das células de Salmonella enterica sorovares Enteritidis e Typhimurium foi feita em solução tampão fosfato de Butterfield adicionado de 0,6 M de NaCl, solução salina (1,2 M de NaCl), ácido peracético (5,66 mg/mL) ou peróxido de hidrogênio (1,2 mg/mL) a 4 ° A culturabilidade foi acompanhada em caldo C. infusão de cérebro e coração (BHI) e a viabilidade celular foi verificada por microscopia de epifluorescência, com uso do kit Live/Dead® e citometria de fluxo. Análises morfológicas foram realizadas por microscopia de força atômica (MFA). Para a recuperação da culturabilidade foram utilizados o meio mínimo de sais (MMS) e o caldo BHI, suplementados com diferentes componentes. As condições de estresse utilizadas induziram a entrada de Salmonella no estado VNC, com variações no período de tempo para indução. Em condições de estresse nutricional e osmótico a entrada no estado VNC ocorreu em períodos acima de 93 dias, mas estas condições favoreceram a manutenção de maior percentagem de células viáveis, com valores acima de 80,9 %. Condições de estresse mais agressivas como o estresse ácido ou oxidativo induziram a entrada em estado VNC em períodos de, no máximo 24 horas, mas resultaram em percentagens de 8,51 % a 45,5 % de células viáveis. As células submetidas aos estresses nutricional e osmótico apresentaram alterações morfológicas, com redução do tamanho e alteração da forma bacilar para cocóide; alterações que não foram evidenciadas quando o estresse ácido ou oxidativo foram utilizados. O meio MMS foi mais eficiente para promover a recuperação da culturabilidade de Salmonella, particularmente quando 1 % de catalase foi incorporada ao meio. Aumento na frequência de recuperação da culturabilidade também foi constatado quando piruvato de sódio e extrato livre de células de Salmonella e Enterobacter cloacae foram adicionados aos meios de cultura. Salmonella Enteritidis demonstrou maior frequência de recuperação da culturabilidade do que Salmonella Typhimurium. Estes resultados confirmam que diferentes condições estressantes induzem Salmonella no estado VNC e que o uso de MMS acrescido de componentes, como a catalase, pode ser uma alternativa para aumentar a recuperação de células de Salmonella em estado VNC. Assim, estes resultados representam importante avanço no entendimento das condições de entrada e saída de Salmonella do estado VNC. / Salmonella is one of the main microorganisms implicated in diseases caused by food and it is necessary to ensure the absence of this pathogen in food for consumer ́s safety. Most of the methods for Salmonella detection relies on the pathogen culturability in laboratory conditions. It is known that Salmonella can be induced in a state known as viable but non culturable (VBNC) in food or in the environment and withstand in this form for long periods. During the VBNC state, the metabolic activity of the cells is very low, making it impossible to detect by traditional cultivation techniques. This may result in underestimation or failure to detect viable cells of this pathogen. Considering the few information about VBNC state in Salmonella, this study aimed to evaluate the induction of VBNC state in this pathogen, the culturability recovery conditions and characterize the cellular morphology in this state of resistance. The induction of Salmonella enterica serovar Enteritidis and Typhimurium to VBNC state was made in Butterfield phosphate buffer (0.6 M), saline solution (1.2 M NaCl), peracetic acid (5.66 mg/mL) or hydrogen peroxide hydrogen (1.2 mg/mL) at 4 ° C. The culturability was accompanied in brain heart infusion broth (BHI) and cell viability checked by epifluorescence microscopy with the Live / Dead® kit and flow cytometry. Morphological analyzes were performed by atomic force microscopy (AFM). For the recovery of culturability, minimal salts medium (MMS) and BHI broth supplemented with different components. All stress conditions used induced Salmonella into VBNC state and, the time for the VBNC state induction varying. In the starvation and osmotic treatment, VBNC state was detected after 93 days of treatment, but these conditions favored the maintenance of a higher percentage of viable cells, with values above 80.9%. More aggressive stress conditions as acid or oxidative stress induced the cells into VBNC state in periods shorter than 24 hours, but resulted in a percentage of 8.51% to 45.5% viable cells. Cells undergoing starvation and osmotic stress showed morphological changes, reducing the size and changing the bacillary form to coccoid but these changes were not apparent when the acid or oxidative stress were used. The medium MMS was more efficient to promote recovery Salmonella culturability, particularly when 1% catalase was incorporated into the medium. Higher frequency of recovery was also observed when sodium pyruvate and cell free extract of Salmonella and Enterobacter cloacae were added to the media. Among the serotypes used, Salmonella Enteritidis showed higher frequency of recovery than Salmonella Typhimurium. These results confirm that different stress conditions can induce Salmonella to enter in the VBNC state, and the use of MMS plus various components, particularly catalase, can be an alternative to ensure the recovery of Salmonella cells and facilitate the detection of the pathogen in food. Thus, these results represent an important advance in the understanding of the conditions of entry and exit of Salmonella VBNC state. / Não foi localizado o currículo lattes do autor.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-12T12:06:06Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2872306 bytes, checksum: 4524f2b2277b755bcb654e67c07705cb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T12:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2872306 bytes, checksum: 4524f2b2277b755bcb654e67c07705cb (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Quorum sensing (QS) é um mecanismo de comunicação entre células microbianas mediado por moléculas sinalizadoras, denominadas autoindutores (AIs). Embora não produza o AI-1, que são moléculas de acil homoserina lactonas (AHLs), Salmonella responde às AHLs produzidas por outros micro-organismos por sintetizar a proteína de resposta ao AI-1, denominada de SdiA. Contudo, o gene sdiA ainda não tem sua função estabelecida em Salmonella. Neste trabalho foi avaliada a influência de n-dodecanoil homoserina lactona (C12-AHL) e de furanonas, análogas de AHLs, sobre o crescimento, motilidade, adesão, formação de biofilme em poliestireno e síntese de proteínas por Salmonella Enteritidis PT4 em anaerobiose. Na presença ou na ausência de 50 nM de C12-AHL e, ou de furanonas, o crescimento, a motilidade em massa ou por espalhamento (swarming) e a motilidade por contração ou por espasmos (twitching) deste patógeno não foram alterados. Conforme verificado pela determinação do potencial de adesão e formação de biofilme em microplacas, enumeração de células aderidas e microscopia confocal de epifluorescência, foi constatada que a presença de C12-AHL induziu a formação de biofilme em superfície de poliestireno após 36 h de cultivo. Além disso, constatou-se o efeito antagonista das furanonas sobre a formação de biofilme nas mesmas condições. As proteínas sintetizadas por Salmonella Enteritidis PT4 na presença e na ausência de 50 nM de C12-AHL após 7 h de cultivo em anaerobiose foram extraídas, separadas por eletroforese bidimensional e preditas por comparação do ponto isoelétrico e massa molecular disponíveis em bancos de dados. Foi verificado que, na presença de C12-AHL houve síntese de maior número de proteínas, sendo que muitas delas estão relacionadas com o sistema QS e com a formação de biofilme. Os resultados obtidos evidenciam que a presença de C12-AHL exógena influencia o metabolismo de Salmonella Enteritidis PT4, cultivada em condições de anaerobiose e indicam uma nova linha de investigação que pode contribuir para o esclarecimento dos mecanismos relacionados com a patogenicidade de Salmonella. / Quorum sensing (QS) is a communication mechanism employed by microbial cells by means of signaling molecules, called autoinducers (AIs). Even though Salmonella does not produce AI-1, also known as acyl homoserine lactones (AHLs), it responds to AHLs produced by other microorganisms through an AI-1 response protein called SdiA. However, the sdiA gene has not established function in Salmonella. In this work the influence of n-dodecanoyl homoserine lactone (C12-AHL) and furanones, AHLs analogs, was assessed on the growth, motility, adhesion, biofilm formation on polystyrene and protein synthesis by Salmonella Enteritidis PT4 under anaerobic environment. In the presence or absence of 50 nM C12-AHL and/or furanones, growth, swarming and twitching motilities of this pathogen were not altered. We found that the presence of C12-AHL induced biofilm formation after 36 h of cultivation as determined by the adhesion potential and biofilm formation on microplates, the enumeration of adhered cells and by confocal epifluorescence microscopy. The results were evaluated by determining the adhesion potential and biofilm formation on microplates, the enumeration of adhered cells and by confocal epifluorescence microscopy. The antagonistic effect of furanones was also determined by using the same conditions. The proteins synthesized by Salmonella Enteritidis PT4 in the presence or absence of 50 nM C12-AHL, after 7 h of incubation in anaerobic conditions, were extracted, separated by bidimensional electrophoresis and predicted on the basis of their isoelectric point and molecular masses available on databases. In the presence of C12-AHL, there was an increased synthesis of proteins, with the majority related to the QS system and biofilm formation. The results demonstrate that the presence of exogenous C12-AHL affects the metabolism of Salmonella Enteritidis PT4, cultivated under anaerobic conditions and point towards a new line of investigation which could contribute to the understanding of the pathogenicity mechanisms in Salmonella.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-19T11:54:47Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 19644 bytes, checksum: 54f0c36ee9445a27674f067adaa45848 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T11:54:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 19644 bytes, checksum: 54f0c36ee9445a27674f067adaa45848 (MD5) Previous issue date: 2005-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O crescimento de 14 isolados de Escherichia coli, Yersinia enterocolitica e Salmonella spp., obtidos de carnes, carcaças e fezes suínas, foi avaliado em diferentes condições de cultivo. Treze isolados (92,8%) não cresceram na presença de 0,5% de ácido lático e de 10% de cloreto de sódio em meio Infusão Cérebro e Coração (BHI). As concentrações de 3,5% e, mais acentuadamente, 5% de cloreto de sódio reduziram o crescimento de todos os isolados nesse mesmo meio. A adição de até 0,02% de nitrito de sódio não afetou o crescimento dos isolados em BHI. O crescimento das estirpes E. coli CS5 e Salmonella sp. CCS1 e CCS2 em homogenato de carne suína foi menor na presença de 3,5% de cloreto de sódio. Os isolados E. coli CS3, Y. enterocolitica CS6 e Salmonella sp. CCS1 mostraram redução no crescimento com a adição de 0,015% de nitrito de sódio ao homogenato. Quando 3,5% de cloreto de sódio e 0,015% de nitrito de sódio foram adicionados ao homogenato, os isolados E. coli CS1 e Salmonella sp. FS3, FS7 e CCS3 foram inibidos. O crescimento dos demais isolados não foi afetado pela adição desses sais. A sobrevivência de seis isolados de Salmonella spp. inoculados em carne suína mantida a -15 °C por 20 semanas também foi avaliada. Após o período de estocagem, constatou-se redução média de 1,4 ciclo logarítmico na população. Salmonella sp. CCS4 apresentou a menor redução, aproximadamente 1,16 ciclo logarítmico. Salmonella sp. FS10 perdeu mais que 99% de culturabilidade, após incubação em solução salina com 0,85% e 3,5% de cloreto de sódio a 4 °C por 30 dias. A susceptibilidade dos isolados a dez antimicrobianos foi investigada. Os quatorze isolados apresentaram resistência à tetraciclina. Sete isolados (50%) foram resistentes a pelo menos dois antimicrobianos. Seis isolados (42,8%) exibiram resistência a três antimicrobianos: um isolado de E. coli, proveniente de carne suína (E. coli CS4) e cinco de Salmonella spp., sendo um obtido de fezes suínas (Salmonella sp. FS7) e os demais de carcaças suínas (Salmonella sp. CCS1, CCS2, CCS3 e CCS4). A multirresistência foi observada para os antimicrobianos tetraciclina, sulfametoxazol/trimetoprim, cloranfenicol e ácido nalidíxico. As concentrações mínimas inibitórias (CMI) do promotor de crescimento olaquindox foram determinadas para cada isolado e variaram de 15 a 60 μg/mL. Os maiores valores de CMI foram de 60 μg/mL para Y. enterocolitica CS6 e 50 μg/mL para Salmonella sp. FS7 e CCS3. / The growth of fourteen isolates of Escherichia coli, Yersinia enterocolitica and Salmonella spp. isolated from pork, swine carcasses and feces was evaluated at different conditions. In the presence of lactic acid 0,5 % and sodium chloride 10 % in brain heart infusion medium (BHI) 13 isolates (92,8 %) did not grow. Sodium chloride 3,5 % and 5 % concentration, more strongly, inhibited the growth of all isolates in the same medium. Addition of up to 0,02% of sodium nitrite did not affect the growth of isolates in BHI. The growth of E. coli CS5, Salmonella sp. CCS1 and CCS2 in pork homogenate was inhibited in the presence of sodium chloride 3,5%. Sodium nitrite 0,015% in pork homogenate inhibited the growth of the isolates E. coli CS3, Y. enterocolitica CS6 and Salmonella sp. CCS1. When both sodium chloride 3,5% and sodium nitrite 0,015% were added to the growth medium E. coli CS1, Salmonella sp. FS3, FS7 and CCS3 were inhibited. The growth of other isolates was not affected by addition of those salts to homogenate. The survival of six isolates of Salmonella spp in pork maintained at - 15°C for 20 weeks was also evaluated. After the storage period, the average reduction in population was 1,4 log 10 CFU ml -1 . Salmonella sp. CCS4 presented the smallest reduction, approximately 1,16 log 10 CFU ml -1 . Salmonella sp. FS10 lost more than 99% of its culturability after incubation in NaCl saline solution 0,85% and 3,5% at 4 °C for 30 days. The susceptibility of the isolates xto ten antimicrobials was investigated. Fourteen isolates were resistant to the antimicrobial tetracycline. Seven isolates (50%) were resistant to at least two antimicrobials. Six isolates (42,8%) exhibited resistance to three antimicrobials: one isolate of E. coli from pork (E. coli CS4) and five of Salmonella spp., one obtained from swine feces (Salmonella sp. FS7) and the others from swine carcasses (Salmonella sp. CCS1, CCS2, CCS3 and CCS4). The multidrug-resistance was observed for the antimicrobials tetracycline, sulfametoxazol/trimetoprim, chloranfenicol and nalidixic acid. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the growth promoter olaquindox was determined for each isolate and varied from 15 to 60 μg.ml -1 . The highest value of MIC was 60 μg ml -1 for Y. enterocolitica CS6 and 50 μg ml -1 for Salmonella sp. FS7 and CCS3.

Para avaliar a diversidade de Salmonella enterica, foram analisados os sorovares presentes em amostras de Salmonela isoladas de aves e seu ambiente do Sul do Brasil (n=155), Colômbia (n=141) e Mississippi (EUA, n=50). No total, foram examinados 346 isolados de Salmonela pela técnica de ribotipificação de sequências Intergênicas (ISR) usando PCR convencional (para bactérias vivas isoladas no Estado de Mississippi) ou nested PCR (para o DNA de Salmonelas do Brasil e da Colômbia, em cartões FTA). O sequenciamento da região intergênica do gene dkgB avalia polimorfismos de nucleotídeos simples que ocorrem em torno do gene ribossomal 5S. A concordância geral entre o esquema Kauffman-White-LeMinor (KWL) e a ISR foi de 85,2% em isolados do Brasil, e de 89,58% em isolados do Mississippi. É possível que a divergência seja devida à capacidade da ISR de detectar as misturas de sorovares numa cultura. Os sorovares de Salmonella enterica identificados nos isolados brasileiros foram: Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo e Senftenberg. Três sorovares ISR únicos foram detectados (UN0041, UN0042, UN0043). Nos isolados colombianos, foram identificados os sorovares Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen, Braenderup, Yoruba e um sorovar ISR Único (UN0048). Já no tocante aos isolados de Mississippi, foram identificados os sorovares Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg e um ISR Único (UN0094). Em geral, a ISR forneceu mais informações do que KWL sobre a ecologia de Salmonella enterica das aves comerciais. Em 73 isolados da Colômbia e 50 isolados de Mississippi, foram estabelecidas as resistências para 15 e 17 agentes antimicrobianos, respectivamente. Não foram identificados isolados pansusceptíveis. Todas as amostras analisadas foram classificadas como multirresistentes. Os resultados deste estudo mostram uma grande diversidade entre os isolados analisados, não só com respeito aos sorovares identificados em cada país, mas também sobre a sua resistência aos antimicrobianos. Os resultados desta pesquisa irão beneficiar a indústria avícola do sul do Brasil, da Colômbia e de Mississippi, porque a caracterização de cepas isoladas de aves comerciais poderá ser usada no futuro para o desenvolvimento e adaptação de programas de controle. / To assess diversity of Salmonella enterica serotypes present in poultry and their environment from Southern Brazil (n=155), Colombia (n=141) and Mississippi (EUA, n=50); 346 isolates were examined with conventional PCR (live bacteria from Mississippi) or nested PCR (Brazilian and Colombian Salmonella DNA in FTA cards) and sequencing of the dkgB-linked intergenic sequence ribotyping (ISR) region that assesses single nucleotide polymorphisms occurring around a 5S ribosomal gene. Overall agreement between Kauffman-White-LeMinor (KWL) scheme and ISR was 85.2% in Brazilian Salmonella isolates, and 89.58% in Mississippi´s isolates. It is possible that the disagreement was due to the ability of ISR to detect mixtures of serotypes in culture. Salmonella enterica serotypes identified among Brazilian isolates were Heidelberg, Enteritidis, Hadar, Typhimurium, Gallinarum, Agona, Cerro, Livingstone, Infantis, Isangi, Mbandaka, Montevideo, and Senftenberg. Three unique ISRs were detected (UN0041, UN0042, UN0043). Regarding the Colombian isolates, serotypes Enteritidis, Gallinarum, Isangi, Heidelberg, Paratyphi B var. Java, Tennessee, Saintpaul, Agona, Isangi, Mbandaka, Urbana, Albany, Javiana, Fresno, Miami, Muenster, Rissen Braenderup, Yoruba, and One Unique ISR (UN0048) were identified and among Mississippian isolates, serotypes Enteritidis, Typhimurium, Kentucky, Bredeney, Mbandaka, Saintpaul, Montevideo, Cubana, Lille, Senftenberg, Johannesburg, and one Unique ISR (UN0094). Overall, ISR provided more information than KWL about the ecology of on-farm Salmonella enterica. In 73 isolates from Colombia and 50 isolates from Mississippi, there were established the antimicrobial resistance against 15 and 17 antimicrobial agents, respectively. No pansusceptible isolate was identified. All analyzed isolates were classified as Multidrug resistant. The results of this study show a great diversity among analyzed isolates, not only in respect to the serotypes, but also about their antimicrobial resistance. The results of this research will benefit the poultry industries of Southern Brazil, Colombia and Mississippi, because the characterization of strains isolated from poultry can be used in the future to the development and adaptation of Salmonella control programs.

A detecção de Salmonella sp. é fundamental nos programas de controle de salmonelose. Métodos de detecção mais eficientes permitem uma melhor determinação do nível de infecção dos rebanhos, um melhor entendimento da epidemiologia da infecção por Salmonella sp. e o desenvolvimento de programas de controle do patógeno, que visem a segurança biológica do alimento. Nos métodos convencionais, o enriquecimento seletivo é uma etapa crítica, pois inibe a microbiota competitiva e permite a multiplicação de Salmonella sp. Vários caldos de enriquecimento seletivo têm sido comparados quanto à eficiência na recuperação de Salmonella sp. a partir de alimentos, contudo existem poucos estudos relativos a fezes de suínos. O objetivo deste trabalho foi comparar caldos de enriquecimento seletivo para o isolamento de Salmonella sp. a partir de fezes de suínos. Numa primeira fase, amostras de fezes foram contaminadas artificialmente e os caldos Rappaport-Vassiliadis incubado a 42°C (RV), Tetrationato Müller-Kauffmann a 37°C (TMK37) e 42°C (TMK42), e Selenito Cistina (SC) a 37°C foram testados, em associação com meios sólidos seletivos: Rambach (RA), Xilose Lisina Tergitol 4 (XLT4), e Verde Brilhante Vermelho de Fenol Lactose Sacarose (VB). Na segunda fase os caldos RV, TMK37 e TMK42, semeados nos meios XLT4 e VB, foram testados com amostras naturalmente contaminadas. Na primeira fase o RV, TMK42 e TMK37 foram mais eficientes que o SC. No isolamento de Salmonella sp. em amostras naturalmente contaminadas os caldos TMK42 e RV foram superiores ao TMK37. O desempenho destes influenciou diretamente a capacidade seletiva e indicadora dos meios sólidos seletivos. No presente estudo, a associação TMK42/XLT4 demonstrou ser mais sensível, e a RV/XLT4 mais específica. O ágar VB também é recomendado para aumentar a probabilidade de detecção do patógeno. Desta forma os caldos RV e TMK42 e o ágar XLT4 e o VB foram considerados os mais indicados para a implantação de protocolos de detecção de Salmonella sp. em fezes suínas. / Detection of Salmonella is a key point in veterinary Salmonella research and surveillance programs. Through an efficient method for pathogen detection, the herd infection leveI could be better determinated, which would permit the understanding of Salmonella infection epidemiology and the developing of pathogen control programs in order to achieve biological food safety. In a conventional isolation method, the selective enrichment is a critical step because it suppresses competitive microflora and permits Salmonella sp. to proliferate. Several selective enrichment broths have been compared for recovering Salmonella sp. from foods. However the isolation ITomswine feces has been conduct in a few studies. The aim of this study was to compare the efficiency of different selective enrichment methods for the isolation of Salmonella sp. from swine feces. In a first step, swine feces samples were artificially contaminated and Rappaport- Vassiliadis broth incubated at 42°C (RV), MüIler-Kauffmann tetrathionate broth at 37°C (MKT37) and 42°C (MKT42), and Selenite Cystine broth at 37°C (SC) were tested, in association with selective plating media: Xylose Lisine Tergitol 4 (XLT4), Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BG). Later, in a second step, RV, MKT42 and MKT37 broths were streaked in XLT4 and BG media and tested with naturally contaminated samples. At the first step RV, MKT42 and MKT37 broths were more efficient than SC broth. When Salmonella sp. were isolated from naturally contaminated samples MKT42 and RV broth were superior to MKT37. The performance of the broths affected the selectivity and differentiation capacity of the selective plating media used. In the present study the association MKT42/XLT4 was the most sensitive and RV/XLT4 was the most specific. The use of BG agar is also recommended to improve the likelihood of Salmonella sp. detection. Therefore, RVand MKT42 broth, and XLT4 and VB media were considered the most appropriated to be used in detection protocols of Salmonella sp. from swine feces.