Rapid, sensitive and quantitative assays for proteases are of great significance for drug development and in diagnosis of diseases. Herein, we describe work towards a novel assay for the multiplexed detection of proteases using ICP-MS. Protease substrates were synthesized containing a diethylenetriaminepentaaceticacid(DTPA) ligand to chelate lanthanide metal ions at the N-terminus, providing a distinct tag for each substrate. A biotin label was appended to the C-terminus allowing separation of uncleaved peptide from the digestion. The enzymatic activities can then be determined by detecting the lanthanide signal of the peptide cleavage products by ICP-MS. Substrates synthesized include DTPA-Gln-Val-Tyr-Gly-Nle-Nle-Lys(biotin)-amide, DTPA-Asp-Gln-Val-Asp-Gly-Lys(biotin)-amide and DTPA-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys-Lys(biotin)-amide for calpain-1, caspase-3 and MMP-9 They were loaded with terbium, holmium and praseodymium respectively. As a proof-of-concept, α-chymotrypsin assays were carried out using DTPA-Asp-Leu-Leu-Val-Tyr-Asp-Lys(Biotin) loaded with lutetium, as a substrate. Calpain-1 assays were also performed. Parallel assays with commercially available fluorogenic substrates for both the enzymes were performed for comparison.

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[pt] O consumo de suplementos alimentares tem apresentado um aumento significativo nos últimos anos principalmente pelo grande apelo desse produto em relação a complementação da dieta com elementos essenciais e a melhora e manutenção da saúde. A combinação do crescente consumo e o livre acesso a esse produto, aliado a ausência de fiscalização por parte dos órgãos governamentais torna seu consumo descontrolado, um potencial risco a saúde da população. Nesse cenário o desenvolvimento de métodos analíticos destinados ao controle de qualidade incluindo a determinação da concentração de selênio total e de suas espécies torna-se uma necessidade. Para isso, foram desenvolvidas metodologias para a quantificação de selênio total por ICP-MS e suas espécies inorgânicas (Se IV e Se VI) e selenometionina por HPLC-ICP-MS em amostras de suplementos alimentares enriquecidos em selênio e em amostra de levedura enriquecida isotopicamente em 78Se. A metodologia para determinação de selênio total, utilizando diferentes gases de reação, foi otimizada empregando planejamento experimental e os limites de detecção encontrados foram entre 0,01 mg kg(-1) (CH4) e 0,1 mg kg(-1) (NH3) e a concordância com o MRC Selm-1 de entre 99 por cento (NH3) e 104 por cento (CH4). Os resultados encontrados referentes à concentração de selênio nas amostras de suplementos alimentares apresentaram uma discrepância em relação ao valor informado no rótulo entre -29 por cento e +170 por cento e, de maneira complementar, o acoplamento do HPLC ao ICP-MS permitiu realizar a especiação de selênio nas amostras de suplemento alimentar. O emprego das técnicas ICP-MS, HPLC-ICP-MS e ESI-MS possibilitou a caracterização de uma amostra de levedura enriquecida isotopicamente em 78Se em termos de sua distribuição isotópica, concentração de selênio total e selenometionina bem como proteínas com peso molecular de aproximadamente 12 kDa. / [en] The consumption of dietary supplements has a significant increase in recent years mainly for a great appeal of this product in relation to a complementation of the diet with essential elements and an improvement and maintenance of health. The combination of increased consumption and free access to this product, associated to the lack in the inspection by government, makes their consumption uncontrolled and a potential risk to the citizen health. In this scenario the development of analytical methods for quality control, including a determination of the total selenium concentration and its species becomes a primordial necessity. For this, methodologies were developed for quantification of total selenium by ICP-MS and its inorganic species (Se IV and Se VI) and selenomethionine by HPLC-ICP-MS in samples of selenium-based food supplements and in isotopically enriched yeast sample in 78Se. The methodology for total selenium determination was optimized by experimental design and the limits of detection were in the range of 0.01 mg kg(-1) (CH4) and 0.1 mg kg(-1) (NH3) and the agreement with the CRM Selm-1 were between 99 percent (NH3) and 104 percent (CH4). The results found for selenium content in the food supplements samples presented a discrepancy in relation to the labeled value between -29 percent and + 170 percent and, complementarily, coupling of HPLC to ICP-MS allowed an speciation analysis in the food supplements samples. The use of the ICP-MS, HPLC-ICP-MS and ESI-MS techniques enabled a characterization of a 78Se isotopically enriched yeast sample in terms of its isotopic distribution, total selenium concentration and selenomethionine as well as proteins with molecular weight of approximately 12 kDa.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:35:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_9503_Bruna Miurim Dalfior - Boneco da Dissertação.pdf: 1665517 bytes, checksum: cafb38cb1e974effc713eb159eb2aa62 (MD5) Previous issue date: 2015-11-16 / O continente Antártico é um dos poucos lugares que não foi explorado em sua totalidade, porém estudos revelam que esse local está sofrendo interferência pelas atividades antrópicas. Por esse motivo, o monitoramento desta região torna-se muito importante. Após otimização e verificação da metodologia as concentrações biodisponíveis nas amostras de sedimento coletadas ao longo de toda a Península Fildes, Ilha Rei George, Antártica, foram determinadas por ICP-MS. As faixas encontradas em µg kg-1 foram 525,17 2314,11 (Pb), 54,83 193,77 (Cd), 54,83 193,77 (Sn), 2095,04 11094,1 (Co), < 2,4 54,61 (Hg), < 5,3 38,66 (Mo) e 120,31 1297,06 (As). Quando comparados esses valores com os descritos na literatura verifica-se que estão abaixo ou dentro da faixa já reportada. A presença desses elementos nas amostras pode ser atribuída à diferentes fatores, tais como a composição natural do sedimento, a contaminação por estações científicas, a existência de uma pista de pouso local, além do transporte local e global de elementos químicos causados pelos fenômenos físicos, o que acarretaria a deposição dos mesmos em diferentes matrizes.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:58:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10255_Rayana Alvarenga Costa.pdf: 3195656 bytes, checksum: 244f9112e799add76c1a8840cbe40dce (MD5) Previous issue date: 2016-09-29 / Tendo em vista a forte relação entre os crimes de homicídio e o uso de armas de fogo no Brasil, a Balística Forense tem como importante ferramenta a detecção de resíduos originados por disparo de armas de fogo (GSR - GunShot Residues) nas mãos de um suspeito, contribuindo para determinação da autoria de um disparo. Dentre os tipos de munições existentes, a munição limpa foi desenvolvida na última década para minimizar a exposição dos atiradores ao chumbo (Pb), visto que em munições convencionais este elemento, bem como o Ba e Sb se apresentam em concentrações significativas. Estudos mostram dificuldades na detecção de GSR de munição limpa por espectroscopia de energia dispersiva acoplado a microscopia eletrônica de varredura (MEV/EDS) e teste residuográfico. Técnicas analíticas modernas como a espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) vem sendo utilizada como uma análise rápida para a detecção de elementos químicos presentes nos GSR, por apresentar alta sensibilidade, seletividade e caráter multielementar. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a aplicabilidade da técnica da ICP-MS para quantificar os GSR advindos de munições limpas ou clean range ammunition ou non toxic ammunition utilizando pistola calibre .40 e revólver calibre .38 em função do número de disparos (n = 1-7 e n = 1-5, respectivamente). Os GSR foram coletados nas regiões da pinça-palmar e pinça-dorsal, sendo avaliadas sobre ambas as mãos (direita e esquerda). Os resultados obtidos foram comparados com técnicas clássicas dentro da balística forense: ensaio colorimétrico usando rodizonato de sódio e MEV/EDS. Resultados negativos foram observados para Pb e Ba usando o teste residuográfico para análise de GSR de munições limpas, até 7 disparos. Já a análise por MEV/EDS foi realizada no GSR produzido a partir de n = 7 (pistola calibre .40) e n = 5 (revólver .38) de munição limpa. As fotomicrográficas mostraram que o GSR produzido a partir da munição limpa não apresenta morfologia definida como os do GSR de munição convencional. Além disso, os resultados de EDS identificaram principalmente elementos como C, O, K, Al, S, Si, Cu, Zn, Ti, Cr, Cl, Mo, Sr e Fe. Diferente dos métodos convencionais, a técnica de ICP-MS mostrou resultado positivo para Pb, Ba e Sb com concentração máxima de 2,64 (±0,60) &#956;g&#8729;L-1, 10,9 (±5,44) &#956;g&#8729;L-1 e 0,12 (±0,02) &#956;g&#8729;L-1 para pistola .40 e 4,59 (±1,8) &#956;g&#8729;L-1, 1,95 (±1,1) &#956;g&#8729;L-1, 0,10 (±0,07) &#956;g&#8729;L-1 para revólver .38. Além deles, elementos como Al, Ti, Cr, Mo, Cu, Zn e Sr foram também detectados nos GSR de munições limpas. Observou-se que com o aumento do número de disparos houve o aumento da concentração de todos os elementos investigados e sugere-se que Al, Sr, Zn e Cu possam vir a ser utilizados como novos marcadores de GSR para munições limpas. Portanto, a técnica ICP-MS apresentou resultados promissores e mostrou-se adequada para a análise de GSR de munições limpas