Thèse de doctorat : Biologie Végétale et Forestière : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

La symbiose ectomycorhizienne associe les racines d’un arbre aux hyphes d’un champignon, conduisant à un échange réciproque de nutriments entre les deux partenaires. La colonisation fongique massive du cortex racinaire est caractérisée par la formation d’une interface symbiotique, le réseau de Hartig. L’acquisition du génome du symbionte ectomycorhizien Laccaria bicolor a permis d’identifier des petites protéines prédites sécrétées, les MiSSPs (Mycorrhiza-induced Small Secreted Proteins). Mon projet de thèse avait pour objectifs la comparaison des sécrétomes, notamment les petites protéines sécrétées (SSPs), de champignons ectomycorhiziens et saprotrophes, la localisation subcellulaire in planta et l’analyse fonctionnelle de MiSSPs de L. bicolor. L’analyse bioinformatique a notamment permis de révéler des clusters de SSPs conservées entre champignons ectomycorhiziens et saprotrophes ou spécifiques de champignons ectomycorhiziens, mettant en lumière que les champignons ectomycorhiziens partagent des SSPs avec leurs ancêtres saprotrophes mais possèdent aussi d’autres SSPs spécifiques à leur mode de vie. Un jeu de MiSSPs de L. bicolor ont été localisées in planta. Trois d’entre eux ciblent spécifiquement des compartiments subcellulaires de la cellule végétale. Le motif répété DWRR présent dans la séquence de MiSSP8 est partagé par une famille de protéine fongique de champignons majoritairement saprotrophes. Ces résultats suggèrent que l’utilisation de SSPs comme moyen de communication est générique chez les champignons et démontrent aussi qu’au moins une petite protéine sécrétée requise pour la symbiose de L. bicolor a évoluée à partir de protéines de champignons saprotrophes / Roots of most trees form ectomycorrhizal (ECM) symbiosis with mutualistic soil-borne fungi, relying on a bi-directional exchange of nutrients between the two partners. Fungal colonization of cortical root cells form the Hartig net, a symbiotic interface. Functioning of this symbiotic interface is not well known. However, Laccaria bicolor genome sequencing sheds the light on upregulated small-secreted proteins, so-called MiSSPs (Mycorrhiza-Small Secreted Proteins). Several L. bicolor MiSSPs were demonstrated as symbiosis effectors. My PhD project aims to compare secretomes, in particular SSPs, of fungal with different lifestyles and pursue functional analysis of MiSSPs of L. bicolor. Based on the clustering analysis, we identified clusters of SSPs shared between saprotrophic and ECM fungi and clusters of SSPs specific to ECM-fungi. This study highlights that ECM fungi share SSPs with their saprotrophic ancestors but also possess lifestyle specific SSPs. In planta subcellular localization of a set of MiSSPs belonging to a core-regulon showed that three of them are able to target different plant subcellular compartments. Functional analysis of the symbiosis effector MiSSP8 does not lead to the identification of a putative interactor but the repetitive motif DWRR of MiSSP8 protein sequence is unique to fungi and is shared with SSPs from saprotrophic ancestors. Our results suggest the use of SSPs as mean of communication is common and generic and show at least one SSPs required for ectomycorhizal symbiosis of L. bicolor has evolved from SSPs found in saprotrophic fungi

La phytostabilisation est une méthode de gestion de sites pollués par des éléments traces métalliques (ETM) grâce à une approche verte. Les champignons mycorhiziens, associés aux racines, peuvent contribuer au potentiel de phytostabilisation des arbres en réduisant notamment le transfert des ETM vers les parties aériennes. Dans le cadre du projet BIOFILTREE, plusieurs approches sont mises en oeuvre afin de sélectionner des espèces fongiques performantes en phytostabilisation. Tout d'abord, afin de cibler des espèces d'intérêt, les communautés fongiques associées aux racines de divers clones de peupliers sur un site pollué sont analysées. Tous les peupliers sont colonisés par des champignons ecto-, endomycorhiziens et endophytes. Cependant, des spécificités d'hôtes sont observées parmi ces communautés, avec notamment un champignon majoritaire du genre Hebeloma qui ne s'associe pas avec tous les génotypes. Ensuite, plusieurs campagnes de prélèvements de champignons sur divers sites pollués ont permis d'isoler des souches particulièrement tolérantes aux ETM. De très fortes variations intra- et interspécifiques sont observées lors de ces tests. En parallèle, des approches ciblées de caractérisation fonctionnelle de gènes impliqués dans l'homéostasie au zinc sont mises en oeuvre chez Laccaria bicolor, un champignon ectomycorhizien modèle. L'homéostasie aux ETM est liée entre autres à l'activité des transporteurs des familles ZIP (Zrt-, Irt- related Protein) et CDF (Cation Diffusion Facilitator). L'étude des membres de ces deux familles a permis d'affiner la compréhension des mécanismes d'absorption et de séquestration des ETM dans les hyphes des champignons ectomycorhiziens / Phytostabilization is a gentle management option for sites polluted by trace elements (TE). Mycorrhizal fungi could assist plants in stabilizing pollutants by increasing the soil-prospected volume and by immobilizing MTE in their hyphae. Within the BIOFILTREE project, several approaches were used to select fungal strains that could be used for enhancing the phytostabilization process. Firstly, the mycorrhizal status of roots of three poplar clones from a TE-polluted site and the fungi associated with the roots were analyzed. The roots were colonized by endomycorrhizal, ectomycorrhizal, and endophytic fungi. Our data also revealed some specific trends, i.e. Hebeloma species was not associated with all poplar genotypes. Secondly, several fungal strains were isolated from polluted sites and their in vitro tolerance to TE was tested. There was a strong inter- and intra-specific variation in metal tolerance. In a greenhouse study, two poplar clones were inoculated with an endomycorrhizal inoculum and grown on a TE-polluted soil. A slight modification in TE accumulation in shoots was observed. In parallel, the role of ZIP (Zrt-Irt- like Proteins) and CDF (Cation Diffusion Facilitator) proteins in TE homeostasis/tolerance was also studied in the ectomycorrhizal model fungus Laccaria bicolor. The corresponding proteins were functionally characterized by the use of different approaches (yeast complementation, GFP-chimeric proteins, transcript analyses, cell metal content analyses). This study allowed us to better understand the mechanisms underlying zinc uptake and compartmentation in the hyphae of this fungus

Le système racinaire des arbres peut établir des symbioses ectomycorhiziennes (ECM) avec des champignons rhizosphériques. La mise en place de la symbiose est accompagnée d'une stimulation de la formation des racines latérales (RLs), et d'une modification de la croissance racinaire. Ces processus développementaux conduisent à la formation de racines courtes typiques des ECMs. Il a été montré que l'auxine est une phytohormone clef dans la formation des RLs ainsi que dans la croissance racinaire. Notre projet s'est focalisé sur l'étude de la régulation des voies de l'auxine dans la racine de peuplier en réponse à L. bicolor. Dans cette étude, nous avons mis en évidence un arrêt de croissance des RLs et des racines adventives du peuplier Populus tremula x P. alba, après deux semaines de co-culture avec L. bicolor. De plus, nous avons aussi montré que cet arrêt n'est pas conditionné par la présence du réseau de Hartig. Une analyse de l'expression globale des gènes de peuplier dans la mycorhize a été réalisée au cours de la formation de la mycorhize. Cette analyse, couplée à des observations du gradient auxinique via le patron d'expression du promoteur DR5, montre que la signalisation auxinique est affectée dans l'organe symbiotique. La quantification de l'auxine (acide indole 3-acétique, AIA) et des métabolites associés a permis de mettre en évidence un environnement symbiotique riche en auxine dans la mycorhize, qui pourrait expliquer les modifications de la signalisation auxinique. De plus, un changement de la conjugaison et de la dégradation de l'AIA est détecté dans la racine, ainsi qu'une dégradation de l'AIA dans les hyphes de L. bicolor. En parallèle, une analyse fonctionnelle de PtaPIN9, un orthologue de AtPIN2, responsable du transport basipète de l'auxine à l'apex racinaire chez Arabidopsis thaliana, a été réalisée au cours de la mycorhization avec L. bicolor. L'immunolocalisation de PtPIN9 dans les racines de peuplier a montré une localisation similaire à AtPIN2, dans les cellules épidermiques. Les lignées transgéniques ayant une modification de l'expression de ce gène ne répondent pas à L. bicolor en terme de stimulation de RLs. Dans les racines mycorhizées, PtaPIN9 n'est plus observée, mais les modifications de l'expression de PtaPIN9 ne modifient ni l'arrêt de croissance racinaire, ni la formation du réseau de Hartig. Ces résultats montrent des modifications majeures des voies de l'auxine du peuplier par le champignon symbiotique L. bicolor. Cette étude ouvre des perspectives sur la compréhension du rôle de l'auxine dans le développement racinaire ainsi que dans le contexte des interactions plantes-microorganismes / Root systems of host trees are known to establish the ectomycorrhizal (ECM) symbiosis with rhizospheric fungi. This mutualistic association leads to modifications of root development that including a stimulation of lateral host roots, and a modification in root growth. The phytohormone auxin (Indole-3-acetic acid, IAA) is known to regulate LRs formation and root growth. Our research focussed on auxin pathways in poplar root in response to L. bicolor. In this study, our data showed that the poplar-Laccaria bicolor interaction leads to the arrest of LRs and adventitious root growth after two weeks of interaction. We also showed that this arrest is not regulated by the Hartig net. Differential auxin responses were analyzed by using an auxin-responsive DR5::GUS marker line and revealed a loss of auxin response in ECM roots. An oligoarray-based transcript profiling of poplar roots in contact with L. bicolor highlights a differential expression of auxin asociated genes in ECM. Measurement of auxin metabolite in ECM and in the free living partners revealed an IAA accumulation, an activation of the IPyA (Indol-3-Pyruvic Acid) dependant IAA biosynthesis pathway in both partners, as well as changes in IAA conjugation pathways in poplar and in IAA degradation pathways in L. bicolor. Our findings illustrate the impact of L. bicolor colonization on root auxin metabolism and response, and also suggest a role of auxin as a signal in the formation of ECM and in the regulation of ECM function. In parallel, PtaPIN9 function analysis in response to L. bicolor has been performed. PtaPIN9 immunolocalization in poplar roots showed similar localization to AtPIN2 in epidermis cells. Transgenic lines having a modification in PtaPIN9 expression, did not formed new LRs in respond to L. bicolor. In ECM roots, the loss of PtaPIN9 signal is observed but modifications of PtaPIN9 expression did not modify the root growth arrest and the Hartig net formation. These results show major changes in auxin associate pathways in poplar root by the symbiotic fungus L. bicolor, during the formation of the mycorrhiza root. Our results offer perspectives on the role of auxin in root development and in the context plants-microbes interactions

La pollution par les métaux lourds entraine des conséquences néfastes pour les sols et pour les communautés qui les colonisent. Afin d'étudier la diversité des mécanismes moléculaires mis en jeu par ces organismes en réponse au stress métallique, deux approches différentes ont été menées.Premièrement, une approche ciblée de caractérisation fonctionnelle de gènes impliqués dans l'homéostasie et la tolérance au zinc a été menée chez Laccaria bicolor, un champignon ectomycorhizien modèle à forte valeur économique ajoutée. L'homéostasie et la tolérance au zinc sont essentiellement liées à l'activité des transporteurs des familles ZIP (Zrt-, Irt- related Protein) et CDF (Cation Diffusion Facilitator). Une étude phylogénétique a permis de mettre en évidence une expansion du nombre de gènes appartenant à ces deux familles dans le génome de L. bicolor, comparé à celui de S. cerevisiae. Le niveau d'expression de ces différents gènes a ensuite été étudié dans différents tissus fongiques ou en présence de différentes concentrations en zinc. L'étude s'est poursuivie par la caractérisation fonctionnelle et la localisation subcellulaire de plusieurs membres CDF et ZIP. L'ensemble de ces analyses ont permis d'affiner fortement les connaissances dans le domaine de l'homéostasie et de la tolérance au zinc chez les champignons ectomycorhiziens. Enfin, une approche expérimentale innovante de métatranscriptomique a également été utilisée. Cette étude du métatranscriptome a permis la comparaison de fonctions exprimées au sein de communautés de microorganismes eucaryotes colonisant des sols d'intérêt (contaminé, anciennement contaminé et non contaminé par des métaux lourds). Des banques environnementales d'ADNc construites à partir des ARN messagers extraits directement de ces sols ont été criblées par complémentation fonctionnelle de mutants de levures sensibles au zinc. Cette étude a permis l'identification de nouveaux gènes et de nouveaux mécanismes impliqués dans la résistance au zinc. La mise au point de cette approche ouvre de nouvelles perspectives intéressantes au niveau de la recherche fondamentale mais aussi de la recherche appliquée en permettant la détection de gènes d'intérêt, que l'organisme soit cultivable ou non / Heavy metal pollution leads to harmful impacts on lands and their associated communities. In order to study the diversity of the molecular determinants involved in metal tolerance by these organisms, two different strategies were employed. First, the mechanisms involved in zinc homeostasis and tolerance were studied by functional characterization of selected genes in Laccaria bicolor, an ectomycorrhizal model fungus with high economic value. Zinc homeostasis and tolerance mechanisms are mainly achieve d through the intracellular traffic of zinc mediated by transporters belonging to the ZIP (Zrt-, Irt- related Protein) and CDF (Cation Diffusion Facilitator) families. Phylogenetic analyses revealed an expansion of both CDF and ZIP gene numbers in the genome of L. bicolor, when compared to that of S. cerevisiae. Gene expression was also studied in different fungal tissues or under different zinc concentrations in the culture medium. Moreover, the functional characterization of several CDF and ZIP members was performed, as well as their subcellular localization. These data allowed us to refine the knowledge on the molecular mechanisms involved in both zinc homeostasis and tolerance in ectomycorrhizal fungi. Finally, an innovative experimental approach of metatranscriptomics was used. The study of the soil metatranscriptome from eukaryotes allows the comparison of functions expressed in eukaryotic communities colonizing different types of soil (contaminated, formerly contaminated, or non-contaminated by heavy metals). Environmental cDNA libraries constructed from mRNA extracted directly from these soils were screened by functional complementation of yeast mutants sensitive to zinc. This study allowed the identification of new genes and new mechanisms involved in zinc resistance. The development of this approach opens new insights into both fundamental and applied research for the detection of genes of interest, whatever the organism is cultivable or not

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