The Lactococcus lactis Ll.LtrB group II intron retrohomes by reverse splicing into one strand of a double-stranded DNA target site, while the intron-encoded protein cleaves the opposite strand and uses it as a primer for reverse transcription of the inserted intron RNA. The protein and intron RNA function in a ribonucleoprotein particle, with much of the DNA target sequence recognized by base pairing of the intron RNA. Consequently, Ll.LtrB introns can be reprogrammed to insert into specific or random DNA sites by substituting specific or random nucleotide residues in the intron RNA. Here, I show that an Escherichia coli gene disruption library obtained using randomly inserted Ll.LtrB introns contains most viable E. coli gene disruptions. Further, each inserted intron is targeted to a specific site by its unique base-pairing regions, and in most cases, could be recovered by PCR and used unmodified to obtain the desired single disruptant. I also demonstrate that Ll.LtrB introns can be used for efficient gene targeting in a variety of Gram-negative and positive bacteria, including E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Bacillus subtilis, and Staphylococcus aureus. Ll.LtrB introns expressed from a broad-host-range vector or an E. coli-S. aureus shuttle vector yielded targeted disruptions in a variety of test genes in these organisms at frequencies of 1-100% without selection. By using an Ll.LtrB intron that integrates in the sense orientation relative to target gene transcription and thus could be removed by RNA splicing, I disrupted the essential gene hsa in S. aureus. Because the splicing of the Ll.LtrB intron by the intron-encoded protein is temperature-sensitive, this method yields a conditional hsa disruptant that grows at 32oC, but not at 43oC. Finally, I developed high-throughput screens to identify E. coli genes that affect either the splicing or retrohoming of the Ll.LtrB intron. By using these screens, I identified fourteen mutants in a variety of genes that have decreased intron retrohoming efficiencies and additional mutants that have increased intron retrohoming efficiencies, in some cases apparently resulting from increased stability of the intron RNA. / text

This thesis is an investigation of the exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis subsp. Cremoris JFR1 and the hyphal cell wall glucans of Candida albicans. L. lactis is an important organism in the dairy industry for the production of fermented dairy products and the exopolysaccharides have been shown to add textural qualities to the foods. C. albicans is a fungal pathogen responsible for the common yeast infection and many post-surgery complications in hospitals and can grow in both the yeast and hyphae form. Through a series of GC-MS, NMR and chemical degradation experiments three unique polysaccharides are discovered in the L. lactis samples giving a molecular basis to the textural qualities provided by these molecules. Additionally, several unique structural features are discovered on the C. albicans hyphal glucan providing possible explanations for the differing immune responses elicited by the hyphae form of the fungus.

Thesis (Master)--İzmir Institute of Technology, İzmir, 2005 / Keywords: Lactococcus lactis ssp. lactis, chromosome profiling, pulsed field gel electrophoresis, plasmid profiling, plasmid stability. Includes bibliographical references (leaves 58-63)

Thesis (Ph. D.)--University of Texas at Austin, 2008. / Vita. Includes bibliographical references.

Proefschrift Rijksuniversiteit Groningen. / Datum laatste controle: 16-12-1997. Lit.opg. - Met samenvatting in het Nederlands.

Titre de l'écran-titre (visionné le 23 novembre 2023) / Les bactéries lactiques sont indispensables pour la production de produits laitiers fermentés comme le fromage. Les espèces bactériennes Lactococcus lactis et Lactococcus cremoris sont les plus utilisées par l'industrie laitière. Cependant, la fermentation peut être ralentie par des bactériophages. Ils se multiplient via un cycle lytique débutant par leur adsorption à la surface cellulaire. Toutefois, l'adsorption ne mène pas toujours à l'infection dû à la présence de mécanismes de défense contre les phages chez certaines souches bactériennes. Ce phénomène est peu étudié puisque les essais classiques d'adsorption virale nécessitent beaucoup de ressources et les résultats obtenus peuvent être variables et ambigus. L'objectif général de ce projet consistait à explorer l'utilisation de la fluorescence pour optimiser les essais d'adsorption virale. Ainsi, cinq phages infectant des lactocoques et appartenant aux trois principaux groupes (Skunavirus, Ceduovirus et P335) isolés dans les usines laitières ont été sélectionnés afin d'adapter les protocoles à une diversité de phages. D'abord, le protocole classique d'adsorption virale a été utilisé pour cinq phages sur leur souche bactérienne hôte et sur une souche insensible, suspectée de bloquer l'adsorption. Un protocole de microscopie à fluorescence a ensuite été mis au point en utilisant le SYBR Gold pour marquer l'ADN viral et le rouge du Nil pour les membranes bactériennes. Cette méthode a permis une analyse qualitative efficace de l'adsorption des cinq phages et qui concordait avec les résultats obtenus par la méthode classique. Finalement, une méthode a été développée pour réaliser des essais d'adsorption en plaque 96 puits, afin de quantifier l'adsorption des phages sur plusieurs souches bactériennes en un seul essai. L'ajout de la fluorescence a aussi été tenté pour faire ces essais d'adsorption à un plus haut débit. Toutefois, la spécificité du fluorophore et la sensibilité du lecteur de plaque ne conviennent pas au contexte des tests d'adsorption. / Lactic acid bacteria are indispensable to produce fermented milk products, such as cheese. The bacterial species Lactococcus lactis and Lactococcus cremoris are the most used by the dairy industry. However, the fermentation process may be slowdown by the presence of lytic bacteriophages. These phages replicate through the lytic cycle that begins with their adsorption to the cell surface. However, phage adsorption does not always lead to a successful infection, due to the presence of phage defense mechanisms in some bacterial strains. This phenomenon is not often studied because classical phage adsorption assays need a lot of resources, and the results obtained are often variable and ambiguous. The general objective of this project was to explore the use of fluorescence to optimize viral adsorption assays. To do this, five lactococcal phages belonging to the three main groups (Skunavirus, Ceduovirus, and P335) isolated in cheese plants were selected to adapt the protocols to a diversity of phages. First, classical phage adsorption assays were performed with five of these phages on their host strain and on insensitive strains, suspected to block phage adsorption. A fluorescence microscopy protocol was then developed using SYBR Gold as a marker for viral DNA as well as Nile red for bacterial cell membranes. This method allowed a qualitative analysis of the adsorption of five phages on the different bacterial strains, and the results were in accordance with the ones obtained with the classical assays. Finally, a 96-well plate method was developed to quantify phage adsorption on multiple bacterial strains in a single assay. The addition of fluorescence has also been attempted to perform these phage adsorption assays at a higher throughput. However, the specificity of the fluorophore and the sensitivity of the plate reader were not suited to the context of phage adsorption tests.

Depuis 2002 a émergé le concept de « catalyse électromicrobienne ». Cette même année, une équipe du LGC a démontré un phénomène de transfert d’électrons entre un biofilm aérobie marin et une cathode d’acier inoxydable. A partir de ces biofilms a été isolée une souche bactérienne, Algoriphagus yeomjeoni, pouvant former un biofilm électroactif monoespèce. Les objectifs de ce travail ont été de rechercher cette capacité à réduire du dioxygène chez des bactéries marines mais également chez une souche issue de l’industrie agroalimentaire Lactococcus lactis. La première partie de cette étude porte sur l’étude d’Algoriphagus yeomjeoni. Les essais électrochimiques ont eu lieu en eau de mer synthétique, dont on contrôle la composition. Aucune production de courant n’a pu être détectée même en repassant en eau de mer naturelle. La perte d’électroactivité de cette souche nous a amené à la deuxième partie de ce travail qui a été la recherche de nouveaux isolats bactériens électroactifs à partir d’un biofilm formé en milieu marin. La population microbienne de ce biofilm a été étudiée par pyroséquençage. Puis, quatre souches bactériennes ont pu être isolées et identifiées. Ces souches appartenant au genre Bacillus, Roseobacter, Pseudoalteromonas et Marinobacter ont toutes présentées des capacités de réduction du dioxygène à la cathode aussi bien en eau de mer naturelle qu’eau de mer synthétique. Enfin, des essais électrochimiques ont été réalisés avec Lactococcus lactis. Cette souche a présenté des capacités électrochimiques dans un compartiment anodique avec un record de performance de 400 mA.m-2. Et, pour la première fois, Lactococcus lactis a été capable de catalyser une réduction impliquant le dioxygène à une cathode avec une densité de courant maximale de 50 mA.m-2. / Since 2002 emerged the concept of "microbial electro-catalysis". That same year, a team from the Chemical Engineering Laboratory demonstrated a phenomenon of electron transfer between a marine aerobic biofilm and a stainless steel cathode. From these biofilms was isolated a bacterial strain Algoriphagus yeomjeoni which form a mono-species electroactive biofilm. The objectives of this work were to seek the ability to catalyze a reduction of oxygen amongst marine bacteria but also in a strain used in food industry Lactococcus lactis. The first part of this study focuses on the study of Algoriphagus yeomjeoni. Electrochemical tests were conduct in synthetic seawater, whose composition is controlled. No power generation could be detected even by returning in natural seawater. The loss of electroactivity of this strain led us to the second part of the work that has been looking for new electroactive bacterial isolates from a biofilm formed in a marine environment. This microbial population in this biofilm was studied by pyrosequencing. Then, four bacterial strains have been isolated and identified. These strains of the genus Bacillus, Roseobacter, Pseudoalteromonas and Marinobacter have all shown the ability to reduce the oxygen at the cathode in both natural and synthetic seawater. Finally, electrochemical tests were performed with, Lactococcus lactis. This strain showed electrochemical capacity in an anode compartment with a record performance up to 400 mA.m-2. Furthermore, and for the first time, Lactococcus lactis was able to catalyze the oxygen reduction involving a cathode with a maximum current density of 50 mA.m-2.

Les bactéries lactiques, en particulier Lactococcus lactis sont utilisées en industrie agroalimentaire. Ces bactéries sont connues pour avoir une activité réductrice, désignant leur aptitude à abaisser le potentiel redox (Eh) d’un milieu. Le génome de L. lactis MG1363 code plusieurs protéines possédant un motif CXXC potentiellement liées à une activité redox. Pour comprendre le rôle des protéines de surface riches en cystéines, deux approches ont été utilisées. Par l’approche bioinformatique, notre intérêt s'est porté sur deux protéines de surface de fonctions inconnues et à motif CX2CX10CX2C : Llmg_0524 et Llmg_0526. Leurs gènes forment un opéron induit temporairement en début de croissance. Dans les deux protéines, le motif chélate un ion de zinc par les résidus cystéines, formant un complexe très stable. Nos données suggèrent que cet opéron contribue à l'intégrité de la paroi cellulaire et que le zinc participe à la stabilité des protéines. L'identification des protéines à thiols exofaciaux par une approche biochimique indique la présente d’AhpF à la surface de L. lactis. La délétion du gène ahpF entraîne une forte sensibilité du mutant au cumène hydroperoxyde, mais aucune au peroxyde d'hydrogène. Le cumène hydroperoxyde provoque une modification de la proportion en acide gras chez le mutant ahpF, le mécanisme de cyclopropanation contribue à sa survie en réponse à un stress oxydatif. La compréhension des fonctions impliquées dans l'activité réductrice des lactocoques permettra une meilleure maîtrise du Eh dans la fabrication des produits fermentés et un meilleur contrôle des flores pathogènes et d’altérations. Le projet Food-Redox a été financé par l'ANR. / Lactic acid bacteria, particularly Lactococcus lactis are used in dairy industry. These bacteria are known to have a reducing activity, indicating their ability to lower the redox potential (Eh) of a medium. L. lactis MG1363 genome encodes several proteins with a CXXC motif, potentially linked with a redox activity. To understand the role of proteins rich in cysteine located at the surface of L. lactis, two approaches were used, one bioinformatics and biochemical another. For bioinformatic approach, interest was focused on two proteins of unknown function and CX2CX10CX2C motif: Llmg_0524 and Llmg_0526. Their corresponding genes form an operon temporarily induces in early growth phase. In these two proteins, the pattern chelate a zinc ion via its cysteine residues. The zinc-cysteine complexe is very stable, it suggests a probable role in protein stability. Data suggest that this operon contributes to the cell wall integrity. The identification of exofacial thiol proteins by a biochemical approach indicates that AhpF is present at the surface of L. lactis. The ahpF gene deletion causes a strong sensitivity to the cumene hydroperoxide, but no sensibility for hydrogen peroxide. In the mutant ahpF incubation with cumene hydroperoxide modified fatty acid proportion, cyclopropanation mechanism thus contributes to the survival in response to oxidative stress. Understanding the lactococci functions involved in the reduction activity allows a better control of redox potentiel in the fermented food production and thus a better control of foodbornes microorganisms in these products. Food-Redox project is financially supported by the French National Research Agency.

Les bactéries lactiques (BL), communément employées en industrie agroalimentaire, font à présent l’objet d’études visant à les utiliser pour de nouvelles applications telles que le développement de vaccins vivants ou la délivrance de molécules d’intérêt biothérapeutique chez l’hôte. Dans cette optique, différents systèmes de présentation de protéines à la surface des bactéries à Gram positif ont été développés. L’un d’entre eux est basé sur l’activité d’enzymes, les sortases, liant de façon covalente les protéines à la paroi bactérienne. Nous avons utilisé la BL modèle, Lactococcus lactis, afin d’étudier les sortases, jusqu’alors étudiées essentiellement chez les bactéries pathogènes. La sortase A (SrtA) est responsable de l’ancrage d’au moins cinq protéines à motif LPxTG à la surface. Une seconde sortase, de classe C (SrtC), a été identifiée et caractérisée. Nous avons mis en évidence la capacité de L. lactis à produire des pili à sa surface qui sont polymérisés par SrtC et ancrés à la paroi par SrtA. Ces pili résultent de la polymérisation de la piline majeure YhgE qui peut être surplombée par la piline mineure de coiffe YhgD. La production de pili chez L. lactis entraîne un changement de comportement des cellules résultant à des phénotypes particuliers. Nous avons pu l’associer à l’auto-agrégation des cellules en culture liquide, à la formation de biofilms hétérogènes et aériens, et à l’adhésion à la mucine gastrique de porc. Plus précisément, YhgE a été impliquée dans l’auto-agrégation et les biofilms atypiques, et une troisième piline, dont l’appartenance au pilus n’a pas été démontrée, semble aussi impliquée dans la production de biofilms atypiques. / Lactic acid bacteria (LAB), which are commonly used in food industry, are now being studied for their use in new applications such as biotherapeutic molecule delivery vehicules in human host or as live vaccines. Recently, surface protein delivery systems have been developed in Gram positive bacteria and one of them is based on enzymes, the sortases which covalently bind proteins to the cell wall. We used the LAB model, Lactococcus lactis, in order to study the sortases of these non-pathogenic bacteria. This work has functionally characterized the sortase A (SrtA) responsible for cell wall anchoring of at least five LPxTG proteins. A second sortase, from class C (SrtC), has been identified and characterized. We demonstrated the ability of L. lactis to produce pili on its surface that are polymerized by SrtC and cell wall anchored by SrtA. These pili result from polymerization of the YhgE major pilin and can be topped by the YhgD tip minor pilin. Pili production in L. lactis leads a change in cell behavior resulting in individual phenotypes. We were able to associate it with the self-aggregation of cells in liquid cultures, heterogeneous and aerial biofilm formation and bacterial adhesion onto pig gastric mucin. Specifically, YhgE was involved in both self-aggregation and atypical biofilm formation, while a third pilin, whose pilus membership has not been established, was also involved in the production of atypical biofilms.

Published Article / An artificial neural network (ANN) that is able to distinguish between Cheddar cheese produced with milk from mixed and single breed sources was designed. Samples of each batch (4 pure Ayrshire/4 mixed with no Ayrshire milk) were ripened for 92 days and analysed every 14 days. A novel ANN was designed and applied which, based only on Lactococcus lactis counts, provided an acceptable classification of the cheeses. The ANN consisted of a multi-layered network with supervised training arranged in an ordered hierarchy of layers, in which connections were allowed only between nodes in immediately adjacent layers.