Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

M.S.

M.S.

The causes of acid liquefaction in a high grade pasteurized milk were investigated. 1. Liquefying milk produced much less acid and had a much lower plate count than normal milk. 2. <i>Bacillus albolactis</i> was found regularly in the milk. It made up a much larger percentage of the total flora in liquefying than in normal milk. 3. Associated growth experiments showed that <i>Strep. lactis</i> could control the liquefying activities of <i>Bacillus albolactis</i>. 4. Pasteurization experiments showed that milk heated for 20 minutes at temperatures higher than 61°C. would undergo acid liquefaction. This appeared to be due to the increase in the percentage of <i>Bacillus albolactis</i>. 5. Inoculation of pasteurized samples with <i>Strep. lactis</i> prevented acid liquefaction. 6. Comparison with a type species showed that the strains of <i>Strep. lactis</i> repeatedly isolated from the milk studied were of the <i>tardus</i> variety. 7. The liquefaction was probably primarily due to an increased percentage of <i>Bacillus albolactis</i> brought about by pasteurization; the lack of the type of species of <i>Strep. lactis</i> and the absence of lactobacilli might also have been contributing factors. / Master of Science

Les ferments utilisés dans la fabrication du fromage Cheddar, généralement composés de combinaisons de souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris, ont un impact important sur la qualité du produit final. Une dynamique d’association est susceptible de s’installer entre les souches présentes. L’objectif de cette étude visait à distinguer les différents groupes de souches de L. lactis ssp. cremoris sélectionnées et à quantifier les proportions de chaque groupe de souches utilisées comme ferment afin d’étudier leur comportement lors d’une fabrication de fromage Cheddar. Lors de l’analyse MLST, le gène nusA s’est démarqué des autres car il a permis de séparer les 23 souches en six groupes intéressants. Une méthode PMA-qPCR spécifique a donc été développée avec ce gène pour cible. Cette technique a été utilisée pour l’évaluation des proportions des souches en combinaisons pendant une simulation de production fromagère. Cette méthode pourrait avantageusement être transférée à l’industrie puisqu’elle est accessible, rapide et reproductible. / Starters used in Cheddar cheesemaking have a major impact on the quality of the final product. These starters are usually composed of Lactococcus lactis subsp. cremoris strain combinations and interactions between strains can be present. The main goal of this study was to discern groups of L. lactis subsp. cremoris and to quantify proportions of each strain group with the objective of studying their behavior during Cheddar cheesemaking. The MLST study showed that the nusA gene classifies strains into six interesting groups. Therefore, a specific PMA-qPCR method was developped with this target gene. The technique was used to quantify strain proportions during cheesemaking simulation. This method could be transferred to the industry because it is easy to use, fast and reproductible.

Les souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris sont caractérisées par un polymorphisme génétique conduisant à des propriétés technologiques différentes. Le but de ce projet était d'évaluer la diversité génétique des souches de L. lactis ssp. cremoris par deux approches moléculaires. D'une part, l'hybridation génomique comparative des souches combinée à l'analyse MLSA ont permis de classifier les souches et d'identifier des marqueurs pour la sélection et la distinction des souches de ferments. D'autre part, l'analyse comparative des transcriptomes des souches au cours d'une simulation des conditions de fabrication du Cheddar a permis d'identifier deux types de réponses, a) un transcriptome commun qui pourrait représenter une réponse commune de toutes les souches de Lactococcus lactis ssp. cremoris au cours de la fabrication, et b) des réponses spécifiques pour chacune des souches pouvant les distinguer. Celles-ci permettront d'identifier des marqueurs technologiques qui seront utilisés en industrie, tels que les transporteurs d'oligopeptides, des gènes de la résistance, et d'autres gènes liés à la production de flaveurs. L'analyse de la diversité génétique entre les souches de L. lactis ssp. cremoris a permis de mieux comprendre les origines de la diversité et d'identifier des gènes potentiellement liés à la différence des comportements et de la réponse des souches

Au Canada, l'industrie de la transformation laitière est aux prises avec des pertes économiques importantes causées par la variabilité des fromages produits. Le fromage Cheddar est un écosystème complexe formé des bactéries du ferment (Lactococcus sp.) et de la flore secondaire (principalement des lactobacilles) qui sont essentielles au développement de la flaveur et de la texture typique de ce type de fromage, mais le rôle de chaque espèce reste peu connu. L'objectif de cette étude était de déterminer la contribution des espèces bactériennes les plus actives à la fabrication et à la maturation du fromage Cheddar afin de mieux comprendre leur évolution tout au long de l'affinage. Des méthodes moléculaires ont été utilisées pour évaluer l'abondance, la diversité, la viabilité et l'activité des bactéries. Des fromages Cheddar expérimentaux et commerciaux ont été analysés par banques de clones (basées sur l'ADNr et l'ARNr 16S) et par PCR quantitative (qPCR pour l'ADN et RT-qPCR pour l'ARN) pour évaluer l'impact de la thermisation du lait (fromages faits avec du lait thermisé ou du lait pasteurisé) et de la température de maturation (4, 7 ou 12 °C) sur l'évolution de l'abondance (ADNr 16S) et de la viabilité (ARNr 16S) des populations bactériennes pendant l'affinage, tout en permettant le suivi de gènes liés au développement de la flaveur (Idh, bcaT, araT). Une approche de RT-qPCR à haut débit a aussi été utilisée pour analyser les profils transcriptomiques de Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 et Lactobacillus casei ATCC 334 en culture mixte dans des modèles de fabrication (test d'activité de Pearce) et de maturation fromagère (caillés modèles). La diversité des souches du groupe L. casei I L. paracasei isolées de tous les fromages a aussi été étudiée par séquençage multilocus (MLST). Les résultats démontrent que les lactocoques restent l'espèce dominante tout au long de la maturation et que les lactobacilles les plus abondants ne sont pas nécessairement les plus actifs. L'abondance des lactobacilles diminue pendant la maturation dans les fromages pasteurisés, mais la viabilité de L. casei I L. paracasei et L. buchneri I L. parabuchneri augmente dans les fromages thermisés, surtout après une maturation à 12 °C, L. casei I L. paracasei étant l'espèce la plus active. De plus, les souches de cette espèce qui ont été isolées de tous les échantillons de fromage sont proches phylogénétiquement même si elles proviennent de sources différentes. L'expression des gènes ldh, bcaT et araT suggère que Idh pourrait être utilisé comme marqueur moléculaire pour évaluer la contribution des lactocoques et des lactobacilles pendant la maturation. Dans les modèles fromagers, les gènes liés au métabolisme des carbohydrates étaient plus exprimés chez L. lactis subsp. cremoris SK11 en culture mixte. Cette condition avait aussi un impact sur la réponse transcriptomique des gènes liés au métabolisme des acides aminés, à la dégradation des peptides et à la réponse au stress chez L. casei ATCC 334. Certains gènes (metC pour les deux espèces, galK, adh et Idh pour SK11 et luxS, pepQ, pepM et pepX pour 334) pourraient être utilisés comme marqueurs moléculaires pour suivre des fonctions métaboliques utiles pendant la fabrication et la maturation fromagère dans un environnement à plusieurs espèces bactériennes comme le fromage Cheddar. Cette étude a permis de quantifier l'évolution de l'abondance et de la viabilité des bactéries du fromage Cheddar en cours de maturation tout en identifiant des marqueurs moléculaires pouvant servir à améliorer la reproductibilité des caractéristiques d'un bon fromage. Les prochains travaux devront se pencher sur l'application de cette approche quantitative à d'autres échantillons de fromage Cheddar ou d'autres types de fromages et devront intégrer l'étude du transcriptome d'autres espèces de lactobacilles afin de mieux comprendre leur contribution au développement de la flaveur. À terme, les résultats présentés dans cette thèse pourront être utilisés afin de mieux contrôler l'affinage en industrie.

Clostridium difficile est le microorganisme le plus fréquemment identifié dans les pathologies entériques pour des patients souffrants de coliques pseudomembraneuses et de diarrhées associées aux antibiotiques. Les drogues les plus communément utilisées pour traiter les maladies associées à C. difficile sont limitées au métronidazole et à la vancomycine puisque de nombreuses souches isolées cliniquement de C. difficile sont résistantes à de nombreux antibiotiques couramment utilisés pour traiter des infections à bactéries Gram positif. La recherche de nouveaux traitements pour limiter l’incidence de C. difficile demeure une urgence pour le secteur de la santé. L’usage de probiotiques, particulièrement de bactéries lactiques métaboliquement actives, a récemment été proposé à la communauté médicale comme une alternative. Dans ce contexte, le but de cette étude est d’évaluer la capacité de la bactérie lactique Lactococcus lactis UL719 et la nisine à inhiber C. difficile dans les conditions intestinales. Dans un premier temps, l’activité antibactérienne de la nisine contre des souches cliniques de C. difficile a montré que la nisine était active à des concentrations minimales d’inhibition comprises entre 0,8 et 51,2 µg/mL dépendamment des souches. De plus, la nisine est capable d’inhiber la germination des spores de C. difficile. Suite à ces résultats, la survie de la souche productrice de nisine, L. lactis UL719 et la stabilité physicochimique de la nisine ont été évaluées à l’aide d’un simulateur du tractus gastro-intestinal. Les résultats ont démontré la capacité de la souche productrice de nisine à survivre au tractus gastro-intestinal avec un taux de survie de 0,5 % et, malgré les conditions de stress gastro-intestinal, à garder la capacité à produire sa bactériocine. Par contre, la nisine seule perdait son activité antimicrobienne suite à son passage dans le duodénum. Finalement, quand l’activité antimicrobienne a été évaluée dans un modèle in vitro de fermentation colique simulant les conditions physiologiques intestinales, L. lactis UL719 n’a pas d’effet sur C. difficile mais la nisine a montré une inhibition totale de ce pathogène. Il a aussi été observé que la nisine avait un léger effet inhibant sur la population bactérienne à Gram-positif dans le modèle colique in vitro humain mais l’effet est temporaire. / Clostridium difficile is the most frequently identified enteric pathogen in patients with nosocomial antibiotic-associated diarrhea and pseudomembranous colitis. The most common drugs used to treat diseases associated with C. difficile are limited to metronidazole and vancomycin since most clinically isolated C. difficile strains are resistant to many antibiotics currently used to treat Gram-positive bacterial infections. The search for new treatments to limit the impact of C. difficile becomes an urgent need for the health sector. The use of probiotics, particularly metabolically active lactic acid bacteria, was recently proposed as an alternative for the medical community. In this context, the aim of the study was to investigate the capacity of the lactic acid bacteria Lactococcus lactis UL719 and nisin to inhibit C. difficile in intestinal conditions. First, the antibacterial activity of nisin against clinical strains of C. difficile showed that it was active with minimum inhibitory concentrations between 0.8 and 51.2 µg/mL, depending on the strains. In addition, nisin was able to inhibit spore germination of C. difficile. Given these results, the survival of the nisin-producing strain, L. lactis UL719 and the physicochemical stability of nisin were evaluated using a simulator of the gastrointestinal tract. The results demonstrated the ability of the nisin producing strain to survive the gastrointestinal tract with a 0.5 % survival rate and, despite the conditions of gastrointestinal stress, to keep its ability to produce the bacteriocin. However, the nisin alone lost its antimicrobial activity after its passage through the duodenum. Finally, when the antimicrobial activity was evaluated in an in vitro model of colic fermentation simulating physiological intestinal conditions, L. lactis UL719 had no effect on C. difficile, but nisin showed a complete inhibition of this pathogen. It was also observed that nisin had a slight inhibitory effect on the Gram-positive bacterial population in the in vitro human colic model, but the effect was temporary.

La présente étude visait à évaluer le potentiel de cultures lactiques bioprotectrices de même que leurs métabolites à activité antimicrobienne (bactériocines) pour le contrôle de Clostridium tyrobutyricum dans du fromage de type Cheddar et la prévention des défauts de texture et de saveur qui lui sont associés.Trois cent quarante et une souches de bactéries lactiques ont été criblées in vitro pour leur capacité à produire des molécules antimicrobiennes actives contre C. tyrobutyricum ATCC 25755. Trois isolats identifiés comme étant des Lactococcus lactis ssp. lactis ont montré une activité inhibitrice significative contre C. tyrobutyricum. L’opéron codant pour la production de nisine A a été identifié chez ces trois isolats alors que la production de nisine a été confirmée par des tests de diffusion sur gélose contre C.tyrobutyricum. Des essais d’interaction et de biocompatibilité entre ces souches productrices de nisine A et des ferments industriels pour fromage Cheddar ont permis de définir un ferment protecteur mixte comprenant un Lactococcus lactis ssp lactis CUC-H, lactococcus lactis ssp cremoris CUC222 et Lactococcus lactis ssp lactis 32 producteur de nisine A. D’autre part, de la nisine A a été produite et purifiée à partir du surnageant de culture de la souche Lactococcus lactis ssp lactis 32 puis encapsulée dans des billes constituées d'alginate et d'amidon non gélatinisé. Le ferment mixte protecteur de même que la nisine purifiée encapsulée ont été testés pour leur efficacité à inhiber C. tyrobutyricum dans un caillé modèle de fromage Cheddar en utilisant deux concentrations de sel (1.3 et 2%), pendant deux semaines à 30°C et pendant un mois à 4°C. Les résultats obtenus avec les échantillons de caillé modèle ont été validés lors d’une production à l’échelle pilote de fromage Cheddar. Les résultats ont montré que C. tyrobutyricum n'a pas été détectée dans les échantillons entreposés à 4°C contenant de la nisine encapsulée à partir de la 3e semaine en présence de 1.3% de sel et de la deuxième semaine en présence de 2% de sel. Lorsque le ferment protecteur est utilisé, une diminution d'environ 0.6 log₁₀ de C. tyrobutyricum a été observée à partir de la deuxième semaine dans le caillé modèle entreposé à 4°C. D’autre part, l'analyse de chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) des caillés a montré que Lactococcuslactis ssp lactis 32 était capable de produire in situ de la nisine à partir de la deuxième semaine.Les résultats de l’analyse métagénomique montrent que l'abondance relative du genre Clostridium a diminuée dans les caillés fromagers en présence aussi bien de la souche protectrice que de la nisine encapsulée, comparativement aux fromages témoins. Ces résultats confirment que l’ajout de Lactococcus lactis ssp. lactis 32 en tant que souche protectrice productrice de nisine permet de contrôler le développement de C. tyrobutyricum dans les caillés modèles de fromage cheddar. Les résultats obtenus dans le fromage Cheddar produit à l’échelle pilote ont montré une réduction de 1log₁₀ de C. tyrobutyricum dans les groupes traités aussi bien avec la nisine encapsulée qu’avec la souche protectrice. De plus, l’analyse de l’activité protéolytique des fromages a montré une augmentation significative de la fraction d’azote soluble dans l'eau en présence de la souche protectrice ou de la nisine encapsulée. En revanche, les teneurs en azote des fractions TCA et PTA étaient plus élevées dans le groupe contenant de la nisine encapsulée. En conclusion, les deux stratégies utilisées dans le cadre de cette étude basées sur l’utilisation de lanisine purifiée encapsulée ou de la souche L. lactis ssp lactis 32 productrice de nisine semblent être efficaces à différents niveaux pour le contrôle de C. tyrobutyricum dans du fromage Cheddar. La présence de nisine dans la matrice fromagère semble également avoir des effets significatifs sur l’activité protéolytique globale de la matrice fromagère. Ce résultat suggère des effets potentiels sur la vitesse de maturation des fromages ainsi que sur leurs caractéristiques organoleptiques et sensorielles. / The present study aimed to assess the potential of bioprotective lactic acid cultures as well as their metabolites with antimicrobial activity (bacteriocins) for the control of Clostridium tyrobutyricum in Cheddar-type cheese and the prevention of texture and flavour side effects.Three hundred forty-one strains of Lactococci have been screened in vitro for their ability to produce antimicrobial molecules active against C. tyrobutyricum ATCC 25755. Three isolates identified as Lactococcus lactis ssp. lactis showed significant inhibitory activity against C. tyrobutyricum. The gene coding for the production of nisin-A has been identified in these three isolates while the production of nisin has been confirmed by agar diffusion test against C. tyrobutyricum ATCC 25755. Interaction and biocompatibility assays between these nisin-A producing strains and industrial starter for Cheddar cheese allowed to define a mixed protective starter comprising a Lactococcus lactis ssp lactis CUC-H,a Lactococcus lactis ssp cremoris CUC 222 and Lactococcus lactis ssp lactis 32 as a nisin-A producer. Nisin-A was also purified, then encapsulated in vesicles made of alginate and non-gelatinized starch.The effectiveness of the protective mixed starter as well as the encapsulated nisin were tested for their effectiveness in inhibiting C. tyrobutyricum in a Cheddar cheese slurry using two different salt concentrations (1.3 and 2%), for two weeks at 30 °C or for one month at 4 °C. The results obtained with the cheese slurry samples were validated during a pilot scale production of Cheddar cheese.The results showed that C. tyrobutyricum was not detected in the samples containing encapsulated nisin from third week in the presence of 1.3% salt and from second week in the presence of 2% salt at 4 °C. When the protective starter is used, a progressive decrease in the number of C. tyrobutyricum, of approximately 0.6 log₁₀, was observed from the second week in cheese slurry stored at 4 °C. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis indicated that the protective culture was capable of producing nisin in situ since the second week.The results of the metagenomic analysis showed that the relative abundance of the genus Clostridium decreased in cheese samples in the presence of both the protective strain and the encapsulated nisin, compared to the control. These results confirm that the addition of Lactococcus lactis ssp. lactis 32 asa nisin-A producing strain helps in controlling C. tyrobutyricum in cheddar cheese slurries. In Cheddar cheese produced at a pilot scale, a reduction of 1.0 log₁₀ in the number of C. tyrobutyricum was obtained in cheeses treated with both the encapsulated nisin and with the protective strain. In addition, analysis of the proteolytic activity of cheeses showed a significant increase in the water-soluble nitrogen (WSN) fraction in the presence of the protective strain or of the encapsulated nisin. On the other hand, the TCA- soluble nitrogen and PTA- soluble nitrogen fractions were higher in the encapsulated nisin group. In conclusion, the two strategies used in this study based on the use of encapsulated nisin or ofNisin-producing Lactococcus lactis appear to be effective at various extend for the control of C.tyrobutyricum in Cheddar cheese. The presence of nisin in the cheese matrix also seems to have significant effects on the overall proteolytic activity of the cheese matrix. This result suggests potential effects on the ripening speed of cheeses as well as on their intrinsic organoleptic and sensory characteristics.

La diversité génomique de Lactococcus lactis a été évaluée par Hybridation Suppressive Soustractive (SSH) et par ±Multilocus Sequence Type Analysis¿ (MLSA). Les gènes présentant la plus grande diversité sont les gènes de prophages, de réplication plasmidique et les transposases. De plus, pour les souches IL1403, MG1363, SKll et A TCC-19257, des transporteurs (sucre, peptides, acides aminés), des peptidases et des glycosyltransférases spécifiques ont été isolées. Les résultats pour les 21 loci partiellement séquencés pour les souches SK11 , A TCC-I9257, HP, Wg2 et ES ont permis de construire un schéma MLSA optimal avec six gènes, selon le degré de polymorphisme, l'origine des loci et le nombre d'allèles par loci. La similarité des séquences démontre la relation phylogénétique entre les souches, qui peuvent être divisées en deux groupes centrés autour de la souche SK11 et A TCC 19257. Ce projet de recherche a permis de repérer des différences spécifiques entre les souches de Lactococcus lactis tout en présentant l'utilisation d'outils de génomique comparative pouvant être appliqués au domaine alimentaire.