Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine vétérinaire : Toulouse 3 : 2007. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 85-90.

Le microbiote du lait cru est un déterminant majeur de sa qualité et de celle des produits dérivés. Dans les fermes laitières, l'hygiène et la santé du pis, les fèces, la litière et les fourrages conservés sont les principales sources de microorganismes qui contaminent l'environnement de l'étable et qui peuvent se retrouver dans le lait. Les ensilages de légumineuses et de graminées produits par fermentation lactique, outre les bactéries lactiques, sont riches en espèces microbiennes dont la prévalence, la diversité et l'abondance dépendent de facteurs incontrôlables tels que les paramètres environnementaux, et de facteurs contrôlables tels que les pratiques de gestion adoptées par les fermiers. Le choix du type de fourrages parmi lesquels le foin, les ensilages d'herbe/légume ou de maïs, l'utilisation ou non d'inoculants, le type d'inoculant commercial utilisé et les types de structures d'entreposage sont autant d'éléments qui influencent la composition microbienne des ensilages et dont la gestion a un impact peu documenté sur la qualité microbiologique du lait cru. Les travaux de cette thèse portent sur l'écologie microbienne des fourrages préservés et l'évaluation de leur contribution à la contamination du lait cru de vache. Pour ce faire, des méthodes de préservation d'échantillons de lait cru à base d'azidiol ou de bronopol ont été évaluées pour leur capacité à maintenir intactes la viabilité et l'abondance des communautés bactériennes présentes. Des échantillons de foin, d'ensilages inoculés et non inoculés, et de lait cru ont été prélevés deux fois, à l'automne 2015 et au printemps 2016 dans 24 fermes laitières au Québec. Les analyses métataxonomiques et des charges microbiennes déterminées par PCR quantitative après le traitement ou non des cellules microbiennes au propidium monoazide ont montré que l'azidiol combiné au diméthyle sulfoxide et une température de -20 °C permet de stabiliser le microbiote du lait cru pendant au moins 30 jours, et que l'azidiol seul maintient l'intégrité des communautés bactériennes pendant 10 jours à 4 °C. Ces études ont également démontré que le séquençage à haut-débit des régions V3-V4 et V6-V8 du gène codant pour l'ARN ribosomique 16S génère des données dont l'exploitation peut conduire à des conclusions plus ou moins divergentes selon les hypothèses de départ. L'importance d'un choix judicieux de la région hyper variable à séquencer est soulignée. Nos résultats ont révélé des différences entre le microbiote du foin et celui des ensilages, ainsi qu'entre les types d'ensilage inoculés et non inoculés. De plus, les rations alimentaires à base de foin, d'ensilage d'herbe/légume non inoculé, d'un mélange d'ensilage d'herbe/légume non inoculé et d'ensilage de maïs inoculé, ou d'un mélange d'ensilage d'herbe/légume et de maïs inoculés et non inoculés partagent jusqu'à 31 % de leur microbiote identifié au niveau de variants de séquences avec le lait cru produit dans les fermes correspondantes. Les taxons plausiblement transférés des fourrages au lait appartiennent surtout aux Proteobacteria, Firmicutes et Actinobacteria. Les résultats obtenus suggèrent que la contamination bactérienne du lait cru par les fourrages se fait de manière aléatoire. Il ressort de nos études que ces taxons supposément transférés des ensilages sont en grande partie responsables des différences observées entre les communautés bactériennes du lait des cinq types de rations. Bien que les structures phylogénétiques des échantillons de lait produits par les vaches alimentées avec les rations d'ensilages non inoculés ou inoculés se soient montrées significativement différentes, il est difficile de conclure sur l'impact réel des inoculants sur la qualité microbiologique du lait cru. L'analyse des réseaux de co-occurrence et de co-exclusion au sein du microbiote a révélé d'une part, dans les ensilages les interactions entre les bactéries lactiques et non-lactiques qui pourraient considérablement influencer le processus de fermentation et ultimement la qualité du produit final, et d'autre part, dans le lait des niches microbiennes associées aux sites de contamination du lait dans l'environnement à la ferme. Par l'implémentation des méthodes d'analyses multivariées et multi-table intégrant le microbiote et les paramètres physico-chimiques des matrices alimentaires échantillonnées, cette thèse propose une approche d'exploitation des données de métataxonomique permettant d'approfondir nos connaissances de la microbiologie du lait cru et des produits laitiers. / The microbiota of raw bovine milk is tightly associated with its quality and that of derivatives. On dairy farms, udder health, faeces, beddings, and fermented forage are among the main sources of milk microbial contaminants. Grass/legume and corn silage obtained by lactic fermentation harbour complex microbial community of which the diversity, the prevalence, and abundance are driven by uncontrollable factors such as environmental conditions, or controllable factors inherent to farm management practices. Forage types including hay, grass/legume or corn silage, the use of microbial additives and their commercial types, and the types of storage structures may influence community assembly of mature silage. However, the impact of forage management practices on the raw milk microbiota is not fully understood. This thesis aimed at investigating the microbial ecology of preserved forage and assessing their contribution to the raw milk contamination. To do so, the ability of milk sample preservation methods based on azidiol or bronopol to maintain viable and stable microbiota over time was assessed. Forage and raw milk samples were collected twice from 24 dairy farms in Quebec, in the fall 2015 and the spring 2016. Analyses of metataxonomic and qPCR-based bacterial load data derived from cells treated or not with propidium monoazide to account for viability showed that azidiol combined with dimethyl sulfoxide prevented the microbiota instability of raw milk stored at -20 °C for at least 30 days. Azidiol used alone was additionally found to keep the microbiota in milk samples intact for up to 10 days when stored at 4 °C. It was demonstrated that for hypothesis-driven microbiota studies, divergent conclusions can be drawn from hight-throughput sequencing of the V3-V4 and V6-V8 hypervariable regions of the 16S rRNA gene pool. The importance of the hypervariable region to target is therefore highlighted. Our study revealed differences between hay microbiota and that of silage, whether inoculated or not. Moreover, forage ration combinations shared up to 31 % of their bacterial phylotypes with raw milk samples produced in the corresponding farms. Taxa that were probably transferred from forage ration combinations to raw milk encompassed the phyla Proteobacteria, Firmicutes, and Actinobacteria. Our results suggested that raw milk contamination on the farm occurs erratically, and that transferred taxa were mainly involved in differential abundance outcomes. Although the microbiota of milk samples associated with the five forage ration combinations exhibited differences in phylogenetic composition, concluding on the effects of microbial additives used for ensiling is a challenge. In this thesis, the analysis of bacteria interaction networks showed that co-occurrence or co-exclusion of lactic and non-lactic bacteria might considerably affect the microbiological quality of mature silage at feed-out. On the other hand, the same analysis performed with milk samples revealed microbial niches associated with milk contamination points on the farm environment. Through the implementation of multivariate multi-table analysis methods that integrated data from the microbiota and from the physicochemical characteristics of the sampled matrices, this thesis suggests methodological approaches that exploit metataxonomic data to deepen our knowledge of the raw milk microbiota and dairy products.

L'objectif était de déterminer si la diversité des espèces microbiennes peut contribuer à la maîtrise de Listeria monocytogenes à la surface de fromage au lait cru. La stratégie reposait sur le criblage de communautés microbiennes de croûtes de fromage St Nectaire fermiers puis la reconstitution de communautés de composition plus simplifiée. Dix consortiums microbiens naturellement présents à la surface de ces fromages au lait cru sur trente quatre testés protégeaient contre L. monocytogenes. Le consortium de croûte le plus inhibiteur, composé de 8 espèces de bactéries lactiques dont Brochothrix thermosphacta, Marinilactobacillus psychrotolerans et Carnobacterium mobile peu fréquentes dans les produits laitiers, 12 espèces de bactéries à Gram positif et catalase positive, 10 espèces de bactéries à Gram négatif, 4 espèces de levures et 3 moisissures, était difficile à reconstituer. Par méthodes cultures dépendantes et indépendantes (Single Strand Conformation Polymorphism) il a été montré qu'au cours d'affinage les profils bactériens du consortium naturel était plus divers que ceux des consortiums reconstitués. Néanmoins, un consortium simplifié composés de flores cultivables sur un milieu "Brain Heart Infusion" et caractérisé par la présence de bactéries à Gram négatif et la dominance, notamment en fin d'affinage, d'espèces halophiles Brochotrix, Carnobacterium et Marinilactibacillus, était presque aussi inhibiteur que le consortium complexe. L'inhibition par ce consortium serait essentiellement associée à la production d'acide lactique en début d'affinage et d'acide acétique en fin d'affinage. Elle pourrait être contrecarrée par une consommation de lastate par les levures

Les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) sont des bactéries pathogènes originaires du tractus digestif des ruminants qui peuvent contaminer certains aliments. Une fois ingérés, ils peuvent provoquer des pathologies graves. Le comportement des STEC n’appartenant pas au sérotype O157:H7 dans les fromages était mal connu. Par ailleurs, en dépit d’une forte prévalence des STEC dans les fromages, cet aliment est moins impliqué dans les épidémies que la viande. C’est pourquoi nous avons étudié dans un premier temps le devenir de ces STEC au cours de la fabrication de 5 schémas technologiques de fromages différents. Dans un deuxième temps, nous avons analysé le comportement et la survie de STEC ayant survécu à la fabrication d’un fromage au cours d’une digestion artificielle. Nos résultats ont montré que certaines technologies sont favorables à la croissance des STEC. Seul un affinage de plus de 60 jours a permis une réduction du taux des STEC. Les étapes de cuisson du caillé ou de coagulation longue de certaines technologies semblent inhiber la croissance des STEC. De plus, la croissance et la survie observées pour les souches E. coli O157:H7 étaient plus faibles que pour les souches E. coli non-O157:H7. L’étude de la survie des souches STEC au cours de la digestion artificielle a montré une différence de comportement entre les 2 souches STEC testées : la souche E. coli O157:H7 a survécu à la digestion tandis que celle de sérotype O26:H11 s’est fortement développée en fin de digestion. / Shiga-toxin producing Escherichia coli (STEC) are an important cause of foodborne illness. They are originated from the digestive tract of the ruminants and can contaminate certain food. Once ingested, they can be responsible for a variety of clinical outcomes. To date, most authors have focused their work on the behavior of E. coli O157:H7 during cheese manufacturing: little is known about the behavior of non-O157:H7 STEC. Furthermore, the presence of STEC strains has been found in raw milk cheeses but dairy products remain less implicated in outbreaks than meat. Consequently, we chose to study the behavior of O157:H7 and non-O157:H7 STEC strains during the manufacturing of 5 different cheese technologies. Then, secondly, it appeared interesting to evaluate the survival of STEC isolated from cheeses during artificial digestion. Our results showed that certain technologies are favorable to the growth of the STEC. Only a long ripening step (>60 days) could then allow a reduction of the STEC rate. In contrast, the cooking step of the curd or the long coagulation of certain technologies inhibited their growth. Our results also showed that the growth and the survival of the E. coli O157:H7 strains were lower than those of the non-O157:H7 E. coli strains. The study of the survival of STEC strains during the artificial digestion highlighted an important difference of behavior for the 2 strains tested: the E. coli O157:H7 strain was able only to survive whereas the E. coli O26:H11 strain knew an important growth at the end of digestion.

L'objectif était de déterminer si et comment les populations microbiennes des laits crus pouvaient faire barrière à Listeria monocytogenes dans un fromage à pâte pressée non cuite. La comparaison des profils SSCP de fromages avec et sans développement de L. monocytogenes a permis d'identifier les pics de Lactococcus lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus saccharominimus, Enterococcus faecium, Chryseobacterium sp. et Corynebacterium flavescens dominants dans les profils des fromages inhibiteurs. Lc. lactis s'est révélée le plus inhibiteur en fromages par production d'acide lactique en début d'affinage. L'inventaire des populations du lait cru le plus inhibiteur a permis de reconstituer une communauté de 32 espèces. Par omission successive de groupes microbiens constituant cette communauté, il a été montré que les bactéries lactiques agissaient en synergie avec les bactéries à Gram positifs non lactiques dans l'inhibition. Le rôle des levures serait moindre et les bactéries à Gram négatif n'interviendraient pas. En cours d'affinage, l'inhibition serait plutôt attribuée à la production d'acides organiques, d'alcools et de certains esters

Les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) sont des bactéries pathogènes originaires du tractus digestif des ruminants qui peuvent contaminer certains aliments. Une fois ingérés, ils peuvent provoquer des pathologies graves. Le comportement des STEC n'appartenant pas au sérotype O157:H7 dans les fromages était mal connu. Par ailleurs, en dépit d'une forte prévalence des STEC dans les fromages, cet aliment est moins impliqué dans les épidémies que la viande. C'est pourquoi nous avons étudié dans un premier temps le devenir de ces STEC au cours de la fabrication de 5 schémas technologiques de fromages différents. Dans un deuxième temps, nous avons analysé le comportement et la survie de STEC ayant survécu à la fabrication d'un fromage au cours d'une digestion artificielle. Nos résultats ont montré que certaines technologies sont favorables à la croissance des STEC. Seul un affinage de plus de 60 jours a permis une réduction du taux des STEC. Les étapes de cuisson du caillé ou de coagulation longue de certaines technologies semblent inhiber la croissance des STEC. De plus, la croissance et la survie observées pour les souches E. coli O157:H7 étaient plus faibles que pour les souches E. coli non-O157:H7. L'étude de la survie des souches STEC au cours de la digestion artificielle a montré une différence de comportement entre les 2 souches STEC testées : la souche E. coli O157:H7 a survécu à la digestion tandis que celle de sérotype O26:H11 s'est fortement développée en fin de digestion.

La pathogénicité des souches d'Escherichia coli producteurs de Shiga-Toxines (STEC) dans les fromages est peu connue à ce jour et bien que la prévalence des STEC dans les matrices au lait cru soit élevée, le nombre de cas épidémiologiques liés à leur consommation reste rare. L'objectif de la thèse est d'apporter des éléments de compréhension de cette pathogénicité en axant nos travaux sur (i) la caractérisation génétique de souches isolées de produits laitiers, (ii) l'étude de l‘inhibition de l'adhésion des EHEC grâce aux globules gras du lait et des fromages au lait cru. Les données de l'étude sur la diversité génétique par PFGE d'une Une collection de souches de STEC isolées de produits au lait cru présentent une grande diversité de profils de macrorestriction révélés par électrophorèse en champ pulsé (PFGE). L'analyse de leur profil de virulence par approche rt-qPCR a montré que, à l'exception de quelques gènes (stx1/2 chez les STEC O26:H11 et les gènes stx1, nleF et Z6065 chez les STEC O157:H7), ces souches isolées de produits laitiers possèdent le patrimoine génétique propre à déclencher les pathologies à EHEC. Des associations entre les globules gras et les EHEC ont été mise en évidence par microscopie à épi fluorescence. Nos travaux ont également montré une inhibition de l‘adhésion de deux souches EHEC à des enthérocytes en culture (modèle in vitro).Enfin, des tests d‘adhésion des EHEC dans une matrice fromagère appauvrie ou non en globules gras, en modèle souris ont été réalisés. Les données ont montré que la présence de globules gras induit un retard d‘excrétion des EHEC d‘un jour. Les globules gras induisent également une variation du site d‘implantation (de 6 cm) au niveau du colon. Nos travaux apportent des connaissances sur la pathogénicité des STEC issus de produits laitiers. Néanmoins, des études complémentaires sont nécessaires pour statuer sur la pathogénicité des STEC isolés de fromages au lait cru et apporter des réponses concrètes aux industriels de cette filière et aux instances décisionnelles pour l‘établissement d‘une éventuelle réglementation. / Pathogenic Shiga toxin producing Escherichia coli (STEC) are foodborn pathogens wordwild and their pathogenicity in dairy products are yet not well define. Despite their presence in such foodstuff, STEC outbreaks or isolated infectious cases due to consumption of dairy products remain rare. The main objectif of this thesis was to evaluate the potential pathogenicity of STEC in dairy products. This work was divided into two main axes: (i) the genetic characterization of STEC isolated from dairy products and (ii) the inhibition of EHEC adhesion to intestinal tract due to Milk Fat Globule (MFG) of milk and raw milk cheeses. A collection of STEC strains from dairy products showed a hight genetic diversity by PFGE analysis. Virulence profil analysis by rt-qPCR showed that dairy STEC strains present genes implicated into disease enhancement, exception of stx1/2 genes for O26:H11 STEC and stx1, nleF et Z6065 genes for O157:H7 STEC. Interactions between STEC cells and MFG, in raw milk, were confirmed by epifluorescence microscopy. EHEC adherence inhibition property of MFG to enterocytes was demonstrated by an in vitro approach. EHEC adhesion test managed in streptomycin treated CD1 mice demonstrated that the presence of MFG in cheese matrices used to feed animals induced a lag of excretion of EHEC cells one day post-feeding. Moreover, MFG induced a shift of 6 cm of the primo-implantation site of EHEC. Our study provides knowledge about pathogenicity of STEC isolated from dairy products. However, further studies are needed to determine the pathogenicity of the isolated products STEC in raw milk cheeses and provide practical solutions to industrial and risk assessment managers to developed potential reglementations.