Le complexe Scar/WAVE génère la formation des lamellipodes par l'intermédiaire du complexe Arp2/3 responsable de la polymérisation de réseaux d'actine branchés. Dans le but d'identifier de nouveaux régulateurs du complexe Scar/WAVE, nous avons conduit un crible en cellules de Drosophiles combinant une approche protéomique à une approche de génomique fonctionnelle. La chaîne lourde de la clathrine a été identifiée au cours de ce crible comme une protéine interagissant avec le complexe Scar/WAVE et dont la déplétion affecte la formation des lamellipodes. Ce rôle de la clathrine dans la formation des lamellipodes peut être découplé de son rôle classique dans le transport vésiculaire en utilisant différentes approches. De plus, la clathrine est localisée au lamellipode en l'absence d'adapteurs et des protéines accessoires de l'endocytose. La surexpression de la clathrine affecte le recrutement membranaire du complexe WAVE réduisant ainsi la vélocité des protrusions membranaire et la migration cellulaire. Par opposition, lorsque la clathrine est envoyée artificiellement à la membrane plasmique par une fusion à une séquence myristoylée, on observe une augmentation du recrutement membranaire du complexe Scar/WAVE, de la vélocité des protrusions membranaires et de la migration cellulaire. L'ensemble de ces résultats montrent que la clathrine envoie le complexe Scar/WAVE à la membrane plasmique et donc contrôle la formation des lamellipodes en plus de son rôle plus classique dans le traffic membranaire.

Le complexe Scar/WAVE génère la formation des lamellipodes par l'intermédiaire du complexe Arp2/3 responsable de la polymérisation de réseaux d'actine branchés. Dans le but d'identifier de nouveaux régulateurs du complexe Scar/WAVE, nous avons conduit un crible en cellules de Drosophiles combinant une approche protéomique à une approche de génomique fonctionnelle. La chaîne lourde de la clathrine a été identifiée au cours de ce crible comme une protéine interagissant avec le complexe Scar/WAVE et dont la déplétion affecte la formation des lamellipodes. Ce rôle de la clathrine dans la formation des lamellipodes peut être découplé de son rôle classique dans le transport vésiculaire en utilisant différentes approches. De plus, la clathrine est localisée au lamellipode en l'absence d'adapteurs et des protéines accessoires de l'endocytose. La surexpression de la clathrine affecte le recrutement membranaire du complexe WAVE réduisant ainsi la vélocité des protrusions membranaire et la migration cellulaire. Par opposition, lorsque la clathrine est envoyée artificiellement à la membrane plasmique par une fusion à une séquence myristoylée, on observe une augmentation du recrutement membranaire du complexe Scar/WAVE, de la vélocité des protrusions membranaires et de la migration cellulaire. L'ensemble de ces résultats montrent que la clathrine envoie le complexe Scar/WAVE à la membrane plasmique et donc contrôle la formation des lamellipodes en plus de son rôle plus classique dans le traffic membranaire. / The Scar/Wave complex (SWC) generates lamellipodia through Arp2/3-dependent polymerization of branched actin networks. In order to identify new SWC regulators, we conducted a screen in Drosophila cells combining proteomics with functional genomics. This screen identified Clathrin Heavy Chain (CHC) as a protein that binds to the SWC and whose depletion affects lamellipodium formation. This role of CHC in lamellipodium formation can be uncoupled from its role in membrane traffic by several experimental approaches. Furthermore, CHC is detected in lamellipodia in the absence of the adaptor and accessory proteins of endocytosis. We found that CHC overexpression decreased membrane recruitment of the SWC, resulting in reduced velocity of protrusions and reduced cell migration. In contrast, when CHC was targeted to the membrane by fusion to a myristoylation sequence, we observed an increase in membrane recruitment of the SWC, in protrusion velocity and in cell migration. Together these data suggest that CHC brings the SWC to the plasma membrane, thereby controlling lamellipodium formation, in addition to its classical role in membrane traffic.

Dans une cellule en migration, la polymérisation d'actine permet de projeter la membrane plasmique dans une structure appelée le lamellipode. Dans le lamellipode, l'actine est polymérisée de manière branchée par le complexe Arp2/3. L'activation du complexe Arp2/3 au lamellipode est sous le contrôle du complexe WAVE. En réponse à une cascade d’activation moléculaire, une des sous-unités du complexe WAVE expose son domaine WCA (WH2-Connecteur-Acide) qui peut alors se lier au complexe Arp2/3 et l’activer afin d'initier la formation d’un nouveau filament d’actine. La voie d’activation du complexe Arp2/3 par le complexe WAVE a été bien étudiée. Cependant la migration cellulaire est finement régulée et cette unique voie de signalisation nous semblait insuffisante. Dans le but de trouver de nouveaux régulateurs de la migration et en particulier de nouvelles protéines se liant au complexe Arp2/3, nous avons réalisé un crible bioinformatique identifiant les protéines contenant un motif Acide. Ce dernier a abouti à l’identification d’une protéine non caractérisée. In vitro, cette protéine n'active pas le complexe Arp2/3. En revanche, elle est capable d'inhiber l'activation du complexe Arp2/3 induite par le domaine WCA d'un activateur et empêche la formation de branches par le complexe Arp2/3. Nous avons appelé cette nouvelle protéine Arpin pour « Arp2/3 Inhibitor ». De manière cohérente avec son rôle inhibiteur in vitro, la déplétion d'Arpin dans différents type de cellules, induit une augmentation de la vitesse de protrusion des lamellipodes et une demi-vie augmentée des lamellipodes. Ces effets se traduisent par une migration plus rapide et plus persistante en direction. Arpin joue donc le rôle d'un frein de la migration cellulaire et permet à la cellule de tourner. Pour jouer ce rôle-là, Arpin nécessite d’être régulée rigoureusement. Dans la cellule, Arpin est inactive et nécessite d’être activée par Rac. Cependant cette régulation n'est probablement pas directe. Pour mieux comprendre la régulation d'Arpin, nous avons donc recherché des protéines partenaires. Nous avons identifié Tankyrase comme protéine interagissant avec Arpin. De façon significative, le motif d’Arpin qui permet son interaction avec Tankyrase se superpose à la séquence Acide nécessaire à son interaction avec le complexe Arp2/3. Nous avons mis en évidence in vitro une compétition entre Tankyrase et le complexe Arp2/3 sur Arpin. Ces résultats suggèrent Tankyrase inhibe la protéine inhibitrice Arpin. En conclusion, nous avons découvert une nouvelle protéine Arpin, qui inhibe le complexe Arp2/3 et qui joue un rôle régulateur important dans la migration cellulaire. Nous avons identifié une protéine régulatrice de son activité, la Tankyrase. Nous nous attendons à ce qu’Arpin soit impliquée dans des nombreux processus physiologiques ou pathologiques, où la migration cellulaire joue un rôle important, en particulier lors de la formation de métastases dans le cancer. / In migrating cells, the Arp2/3 complex generates branched actin networks that power protrusion of the leading edge in a structure called lamellipodium. The Arp2/3 complex is activated at the leading edge by the Wave complex which is itself activated by the small GTPase Rac. WAVE which is in an inactive state, then exposes its WCA domain (WH2-Connector-Acidic) that can bind to the Arp2/3 complex and activate it to trigger the formation of a new daughter actin filament. This signalling pathway of the Arp2/3 complex has been well studied. However, cell migration is a fine-tuned process that is probably regulated in a more complex manner.To identify new regulators of cell migration, especially proteins that bind to the Arp2/3 complex, we performed a bioinformatics screen to identify proteins containing an acidic motif at its C-terminus, a characteristic motif of Arp2/3 activators. By this method we retrieved an uncharacterized protein. A combination of in vitro assays revealed, however, that this protein inhibits the Arp2/3 complex by competing with the activators. We called this protein Arpin for “Arp2/3 inhibitor”. Depletion of Arpin in different kind of cells, such as mammalian cells or amoeba, induces lamellipodia to protrude faster and to last longer, consistent with its inhibitory role on Arp2/3 complex activity. These effects observed lead to an increased velocity and a more directional migration in random migration assay. The function of the Arp2/3 inhibitory protein Arpin is thus to slow down and steer cell migration.In the cell, Arpin has been shown to be inactive until it is activated by Rac, most likely by an indirect manner. We identified Tankyrase as an interactor of Arpin. Interestingly, the binding motif of Arpin to Tankyrase overlaps the acidic motif required for the binding to the Arp2/3 complex. By a biochemistry approach, we showed a competition between Tankyrase and the Arp2/3 complex for the binding to Arpin. This observation suggests that Tankyrase inhibits the inhibitory protein Arpin in the cell. To conclude, we identified a new protein, Arpin which inhibits the Arp2/3 complex and plays an important role in the control of cell migration. We identified a protein which regulated its activity, Tankyrase. Thus, we can imagine that Arpin could be implicated in numerous physiological and pathological processes where cell migration is involved, particularly during metastases formation in cancer

La motilité cellulaire est un processus intégré essentiel à de nombreux phénomènes physiologiques tels que la formation du cône de croissance et la plasticité synaptique. Des dérégulations de la motilité cellulaire peuvent être à l’origine de la formation de métastases ou de pathologies neuropsychiatriques comme la schizophrénie et l'autisme. La compréhension des mécanismes régulant la migration cellulaire est donc un enjeu majeur. La motilité cellulaire repose sur la formation de diverses structures constituées de réseaux d’actine branchés telles que le lamellipode. La formation du lamellipode nécessite l’intervention de protéines régulatrices de l’actine telles que Rac1 et les complexes Wave et Arp2/3. Grâce à l’utilisation de suivi de protéine unique, nous avons pu comprendre comment la coordination spatio-temporelle de ces régulateurs contrôle la formation et la morphologie des lamellipodes de cellules migrantes. Nous avons ainsi découvert que l’activation et la localisation du complexe Wave étaient régulées de manière enzymatique mais également mécanique. Dans une première étude, nous avons montré que la RhoGTPase Rac1 active le complexe Wave spécifiquement à l’extrémité du lamellipode. Dans une seconde étude, nous avons révélé que la localisation du complexe Wave est régulée par la dynamique des filaments des réseaux branchés d’actine. Ces données soulignent l’importance du complexe Wave dans la formation du lamellipode et révèlent l’existence d’une régulation mécanique de la localisation du complexe Wave. / Cell motility is an integrated process involved in critical phenomena such as axonal pathfinding and synaptic plasticity. Dysregulation of cell motility can induce metastasis and abnormal spine shapes observed in neuropsychiatric disorders like autism and schizophrenia. Therefore it is essential to understand how cell motility is regulated. Cell motility requires the formation of branched actin networks propelled by actin polymerization that lead to the formation of membrane protrusions such as the lamellipodium. Several actin regulatory proteins are involved in this process, such as Rac1 and the WAVE and ARP2/3 complexes. Using single protein tracking, we revealed key phenomena concerning the spatio-temporal regulation of lamellipodium formation by actin regulatory proteins. We found that the localization and activation of the WAVE complex was enzymatically regulated, but also mechanically. First, we showed that the Rac1 RhoGTPase activates the WAVE complex specifically at the tip of the lamellipodium. We also showed that WAVE complex localization is regulated by the dynamics of branched-network actin filaments. This study confirms the crucial role of the WAVE complex in lamellipodium formation and reveals the existence of a mechanical regulation of the localization of this complex in the cell.

Le complexe actomyosine, formé de l’association de la myosine II avec les filaments d’actine, stabilise le cytosquelette d’actine et génère la contraction cellulaire nécessaire à plusieurs processus comme la motilité et l’apoptose dans les cellules non-musculaires. La myosine II est un hexamère formé d’une paire de chaînes lourdes (MHCs) et de deux paires de chaînes légères MLC20 et MLC17. La régulation de l’activité de la myosine II, c'est-à-dire son interaction avec les filaments d’actine, est directement liée à l’état de phosphorylation des MLC20, mais il reste beaucoup à découvrir sur l’implication des MHCs. Il existe trois isoformes de MHCs de myosine II, MHCIIA, MHCIIB et MHCIIC qui possèdent des fonctions à la fois communes et distinctes. Notre but est de mettre en évidence les différences de fonction entre les isoformes de myosine II, au niveau structurale, dans la stabilisation du cytosquelette d’actine, et au niveau de leur activité contractile, dans la génération des forces de tension. Nous nous sommes intéressés au rôle des isoformes des MHCs dans l’activité du complexe actomyosine qui est sollicité durant le processus de contraction cellulaire de l’apoptose. Dans quatre lignées cellulaires différentes, le traitement conjoint au TNFα et à la cycloheximide causait la contraction et le rétrécissement des cellules suivi de leur détachement du support de culture. Par Western blot, nous avons confirmé que la phosphorylation des MLC20 est augmentée suite au clivage de ROCK1 par la caspase-3, permettant ainsi l’interaction entre la myosine II et les filaments d’actine et par conséquent, la contraction des cellules apoptotiques. Cette contraction est bloquée par l’inhibition des caspases et de ROCK1. MHCIIA est dégradée suite à l’activation de la caspase-3 alors que MHCIIB n’est pas affectée. En utilisant une lignée cellulaire déficiente en MHCIIB, ou MHCIIB (-/-), nous avons observé que la contraction et le détachement cellulaires durant l’induction de l’apoptose se produisaient moins rapidement que dans la lignée de type sauvage (Wt) ce qui suggère que l’isoforme B est impliquée dans la contraction des cellules apoptotiques. Parallèlement, la kinase atypique PKCζ, qui phosphoryle MHCIIB et non MHCIIA, est activée durant l’apoptose. PKCζ joue un rôle important puisque son inhibition bloque la contraction des cellules apoptotiques. Par la suite, nous nous sommes intéressés à la modulation de la morphologie cellulaire par la myosine II. Les fibroblastes MHCIIB (-/-), présentent un large lamellipode dont la formation semble dû uniquement à l’absence de l’isoforme MHCIIB, alors que les fibroblastes Wt ont une morphologie cellulaire étoilée. La formation du lamellipode dans les fibroblastes MHCIIB (-/-) est caractérisée par l’association de la cortactine avec la membrane plasmique. L’observation en microscopie confocale nous indique que MHCIIA interagit avec la cortactine dans les fibroblastes Wt mais très peu dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Le bFGF active la voie des MAP kinases dans les fibroblastes Wt et MHCIIB (-/-) et induit des extensions cellulaires aberrantes dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Nos résultats montrent que l’implication de l’isoforme B de la myosine II dans la modulation de la morphologie cellulaire. L’ensemble de nos résultats participe à distinguer la fonction structurale et contractile de chacune des isoformes de myosine II dans la physiologie cellulaire. / We are interested in studying the modulation of the actomyosin complex which is involved in different cellular processes such as cell locomotion and apoptosis. The actomyosin complex is formed by the association of actin filaments and myosin II. The non-muscle myosin II is a hexamer formed by one pair of heavy chains (MHCs) and two pairs of light chain (MLC20 and MLC17). The actomyosin activity is dependent on MLC20 and MHCs phosphorylation. There are three isoforms of MHCs (MHCIIA, MHCIIB and MHCIIC) which have common but also distinctive roles in several cellular processes. Our aim is to clarify the structural and contractile functions of each isoforme of myosin II in different cellular processes, in particular, cell contraction and cell morphology. First, we studied the implication of myosin II isoforms in cell shrinkage and detachment during apoptosis which are both dependent on actomyosin contractility. We treated four different cell lines with TNFα in combination with cycloheximide (CHX) to trigger apoptosis. We confirmed that TNFα induced caspase-3 activation, ROCK1 cleavage and increased MLC20 phosphorylation. We showed that TNFα/CHX induced the caspase-dependent MHCIIA degradation, whereas MHCIIB levels and association with the actin cytoskeleton remained virtually unchanged. Cell shrinkage and detachment were blocked by caspase and ROCK1 inhibitors. Using the MHCIIB (-/-) cell line, we observed that the absence of MHCIIB did not affect cell death rate. However, MHCIIB (-/-) fibroblasts showed more resistance to TNFα-induced actin disassembly, cell shrinkage and detachment than wild type (Wt) fibroblasts, indicating the participation of MHCIIB in these events. PKCζ, which only phosphorylates MHCIIB, was cleaved during apoptosis, co-immunoprecipitated preferentially with MHCIIB and, interestedly, PKCζ inhibition blocked TNFα-induced shrinkage and detachment. Our results demonstrate that MHCIIB, together with MLC phosphorylation and actin, constitute the actomyosin cytoskeleton that mediates contractility during apoptosis. Second, we studied the involvement of myosin II isoforms in cell shape modulation. Fibroblasts MHCIIB (-/-) spontaneously formed lamellipodia whereas Wt fibroblasts presented a stellate shape. Cortactin was associated with the leading edge of lamellipodia in MHCIIB (-/-) fibroblasts, but it localised diffusely in the cytoplasm or at the end of fine cellular projections in Wt fibroblasts. The levels of cortactin and cortactin phosphorylated in Tyr421 associated with membrane in MHCIIB (-/-) fibroblasts were higher than in Wt fibroblasts. Confocal microscopy showed cortactin/MHCIIA colocalization in wild type but not in MHCIIB (-/-) fibroblasts. bFGF activates Erk1/2 in wild type and MHCIIB (-/-) fibroblasts and induces the formation of aberrant membrane projections in MHCIIB (-/-) fibroblasts. In conclusion, our results contribute to characterize the structural and contractile role of each myosin II isoforms in the physiology of the cell.

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