Das Kriechen von Zellen über Oberflächen spielt eine entscheidende Rolle bei lebenswichtigen Prozessen wie der Embryonalentwicklung, der Immunantwort und der Wundheilung, aber auch bei der Metastasenbildung. Die Zellbewegung erfolgt über die Bildung einer flachen Ausstülpung der Zellmembran, des Lamellipodiums. In dieser Arbeit wird ein mathematisches Modell entwickelt, das die Bildung, Stabilität und Stärke des Lamellipodiums, sowie die Dynamik der Zellvorderkante beschreibt. Dabei werden zwei Bereiche innerhalb des Lamellipodiums unterschieden. Im Hauptteil besteht es aus einem dichten Netzwerk von Aktinfilamenten, dem sogenannten Aktingel. An der Vorderkante wachsen die Enden der Aktinfilamente durch Polymerisation und bilden einen dynamischen Grenzbereich, die semiflexible Region. Das Gleichgewicht zwischen den Filamentkräften in der semiflexiblen Region und den viskosen sowie den äußeren Kräften bestimmt die Geschwindigkeit der Zellvorderkante. Eine Stabilitätsanalyse liefert Bedingungen für die Existenz stabiler Lamellipodien. Im Parameterbereich mit Filamentdichte Null können keine stabilen Lamellipodien existieren, aber aufgrund von Anregbarkeit trotzdem vorrübergehend gebildet werden. Hier beschreibt das Modell sehr gut das in Epithelzellen gemessene aufeinanderfolgende Vorschieben und Zurückziehen von Lamellipodien. Es zeigt, dass für die Zyklen prinzipiell keine Änderung in der Konzentration von Signalmolekülen innerhalb der Zelle notwendig ist. Das Modell wird auch auf die gemessene Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung von Fischkeratozyten angewandt. Aufgrund der guten Übereinstimmung zwischen Experiment und Simulationen wird ein Mechanismus vorgeschlagen, der die charakteristischen Merkmale der Beziehung erklärt. Es wird gezeigt, dass die gemessene Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung ein dynamisches Phänomen ist. Eine stationäre Beziehung, die unter der Bedingung gilt, dass die Zellen einer konstanten Kraft ausgesetzt sind, wird vorhergesagt. / Many cells move over surfaces during embryonic development, immune response, wound healing or cancer metastasis by protruding flat lamellipodia into the direction of migration. In this thesis, a mathematical model is developed that describes the formation of lamellipodia, their stability, strength and leading edge dynamics. Two regions inside the lamellipodium are distinguished in the model. The bulk contains a dense cross-linked actin filament network called actin gel. The newly polymerized tips of the actin filaments form a highly dynamic boundary layer at the leading edge called semiflexible region. The balance of filament forces on the membrane in the semiflexible region with viscous and external forces determines the velocity of the leading edge. A stability analysis defines criteria for the existence of stable lamellipodia. No stable lamellipodium can exist in the parameter regime with a filament density of zero. However, due to excitability, lamellipodia can still form transiently. The measured subsequent protrusions and retractions of lamellipodia in epithelial cells are very well reproduced by the excitable behavior. The modeling results show that in principle no signaling is necessary for cycles of protrusion and retraction. Furthermore, they are fitted to the force-velocity relation of keratocytes, which has been measured by placing a flexible cantilever into the cell''s path of migration. Due to the good agreement between experiment and simulations, a mechanism leading to the characteristic features of the force-velocity relation is suggested. Moreover, properties of the structure of the stable keratocyte lamellipodium, like the length of actin filaments and the branch point density, can be concluded. It is shown that the force-velocity relation measured with the cantilever is a dynamic phenomenon. A stationary force-velocity relation is predicted that should apply if cells experience a constant force, e.g. exerted by surrounding tissue.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第23610号 / 医科博第133号 / 新制||医科||9(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 松田 道行, 教授 林 康紀, 教授 安達 泰治 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Essentiell für die Blutstillung (Haemostase) ist die Thrombozyten- oder Blutplaettchen-Adhaesion und die Thrombus-Bildung. Beide Vorgaenge werden hauptsaechlich durch den Thrombozyten-Rezeptor Integrin alphaIIb-beta3 vermittelt. Nach Bindung des Liganden Fibrinogen aendert sich die Rezeptor-Konformation, Integrine assoziieren und ein intrazellulaeres Signalnetzwerk wird aktiviert, welches die Organisation des Aktin-Zytoskeletts steuert. Diese Zytoskelett-Reorganisationen sind Grundlage für zellulaere Adhaesions- und Aggregations-Prozesse. Die Signalvermittlung vom Integrin zum Zytoskelett wird durch die Protein-Tyrosinkinase Src eingeleitet, deren Aktivitaetszustand den Signalweg reguliert. Bei der Src-Aktivierung wird Tyrosin 418 durch Autokatalyse phosphoryliert. Die Kinase muss jedoch wieder inaktiviert werden. Dies übernimmt in Plaettchen ausschliesslich die Tyrosinkinase Csk (C-terminale Src Kinase) durch Phosphorylierung von Tyrosin 529 im C-terminalen Ende des Proteins. Die Csk-vermittelte Inaktivierung von Src stellt den entscheidenden Kontrollschritt des alphaIIb-beta3-vermittelten Signalwegs dar. Obwohl bekannt ist, dass die Src-Aktivierung bei der Zelladhaesion an den Zellraendern der Lamellipodien geschieht und man den Mechanismus und die Kinetik der Src-Csk Interaktion genauer versteht, ist bislang immer noch unbekannt, wo und wie Src inaktiviert wird bzw. welche Rolle der Src-Inaktivierung genau zukommt. FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ist ein physikalischer Effekt, mit dem Interaktionen beliebiger fluoreszenzmarkierter Proteine mikroskopisch detektiert werden koennen. Diese Technik wurde genutzt, um die Src-Csk-Interaktion waehrend der alphaIIb-beta3-vermittelten Fibrinogen-Adhaesion in einer etablierten Thrombozyten-Modellzelllinie (A5-CHO) direkt visualisierbar zu machen. Es zeigten sich starke Src-Csk Interaktionen (FRET-Signale) an den Zellraendern aktiver Lamellipodien und zusaetzlich in Fokalkontakten, wo beide Proteine mit Vinculin, einem Fokalkontakte-Marker, co-lokalisierten. Die Proteininteraktionen folgten einem hochdynamischen Ablauf. Nach der Akkumulation der Src-Csk Komplexe an den Zellraendern wanderten sie in Abstaenden von 2-3 Minuten nach innen, fragmentierten und bildeten schliesslich stabile Fokal-Adhaesionen. FRET-Signale an den Zellraendern fanden sich vor allem in ruhenden Lamellipodien bzw., waehrend des Lamellipodien-Rückzugs, in wachsenden Lamellipodien traten die FRET-Signale dort dagegen nicht auf. In unabhaengigen biochemischen Tests im Zeitfenster der FRET-Beobachtungen wurde ein spezifischer Anstieg der Src-Tyr529-Phosphorylierung (Inaktivierung) und eine parallele Abnahme der Src-Tyr418-Phosphorylierung (Aktivierung) gemessen. Weiterführende Ergebnisse lieferten Versuche mit Src- und Csk-Mutanten. Die Co-Expression von Wildtyp-Src mit Kinase-inaktivem CskK222R hatte weder einen Effekt auf die Adhaesion und Ausbreitung der Zellen noch auf die Praesenz von FRET, es aenderte sich jedoch drastisch die zellulaere Verteilung der FRET-Signale sowie das Wachstum und die Form der Lamellipodien. Die Co-Expression von Wildtyp-Csk mit konstitutiv aktivem SrcY529F verursachte dagegen eine stark verringerte Adhaesionsfaehigkeit und Hemmung der Lamellipodien-Bildung. Die Fokal-Adhaesionspunkte in diesen Zellen waren sehr schwach und ueberdimensioniert und lagen ungeordnet verteilt in der Adhaesionsebene. Zusaetzlich verursachte SrcY529F eine starke Ueberaktivierung des Zytoskeletts und das fast vollstaendige Verschwinden der FRET-Signale. Die ermittelten Daten zeigen, dass die enge Kontrolle der Src-Aktivitaet durch Csk eine bedeutende Rolle für die funktionelle Zell-Adhaesion and -Ausbreitung spielt. Co-Immunpraezipitations-Resultate und Messungen der Menge an markiertem Protein in Zellen, in welchen FRET detektierbar war, untermauern zusaetzlich unsere These, zum ersten Mal die Src-Regulation durch Csk in lebenden Zellen direkt beobachtbar gemacht zu haben. Dieser neue FRET-Ansatz kann auch als Reporter-System für Prozesse der Src-Inaktivierung in anderen Signalwegen und Zellen angewendet werden. Das Messprinzip kann weiterhin auf das Studium der Inaktivierung weiterer Mitglieder der Familie der Src-Kinasen (in verschiedensten Signalwegen) erweitert werden. / Platelet adhesion and thrombus formation required for functional hemostasis depends on integrin receptor mediated “outside-in” signaling to the cytoskeleton. Integrin alphaIIb-beta3 is the major integrin on the platelet surface and acts as a specific receptor for the plasma protein fibrinogen. Fibrinogen binding causes clustering of integrins within the plasma membrane activating the protein tyrosine kinase Src (signal initiation) by phosphorylation of tyrosine 418. Src, however, is negatively regulated by another tyrosine kinase, Csk (C-terminal Src kinase), which phosphorylates tyrosine 529. Although, in adhering cells, it is believed that Src is getting activated at lamellipodia leading edges, neither the cellular location nor the dynamics and exact role of Src inactivation is known to date. Here, we studied Src inactivation during alphaIIb-beta3-dependent adhesion to fibrinogen in the established platelet model cell line A5-CHO. Using a live cell FRET (fluorescence resonance energy transfer) microscopy technique with CFP and YFP label molecules (cyan and yellow fluorescent protein), we were able to image highly dynamic Src-Csk interactions at the leading edges of active lamellipodia. Every 2-3 minutes, signals detecting Src-Csk interactions (complexes) appeared at the cell periphery before they begin to move inward in the cell and reorganize while lamellipodia start to protrude (grow). FRET signals were also found in small accumulations at the fringe and also further to the centre of the adhesion plane (focal complexes and adhesions). Src and Csk co-localize with vinculin (a focal adhesion marker) within these regions. During the runtime of FRET observation a specific increase in Src-Tyr529 phosphorylation with a parallel decrease in Src-Tyr418 phosphorylation was observed supporting the idea that Src inactivation occurs within the cells. The role of Src-Csk interaction was studied in further detail using Src and Csk mutants. The data revealed that co-expression of inactive CskK222R did not alter the presence of FRET signals, but fundamentally changed its distribution within the cell. Furthermore it caused lamellipodia shape changes and a tendency of constant lamellipodia protrusion. Co-expression of constitutively active SrcY529F in turn caused a severe adhesion and spreading dysfunction. Adherent cells showed very weak, disorganized and oversized focal adhesions, a hyper-activated cytoskeleton (visible in fast-changing membrane blebs) and absence of FRET signals. Results from immunoprecipitation analyses and protein level determination within cells, in which FRET was detectable, further supported that we were able, for the first time, to directly visualize Src (and integrin) regulation by Csk control in live cells. The results show that Src control by Csk is ultimately required for lamellipodia and focal adhesion function and thus for cell anchorage and spreading. The novel FRET-approach reported here can be readily applied to other integrin and signaling pathways including the study of closely related Src family kinases (SFKs). Results may also contribute to a better understanding of the processes of tumor formation.

Le complexe Scar/WAVE génère la formation des lamellipodes par l'intermédiaire du complexe Arp2/3 responsable de la polymérisation de réseaux d'actine branchés. Dans le but d'identifier de nouveaux régulateurs du complexe Scar/WAVE, nous avons conduit un crible en cellules de Drosophiles combinant une approche protéomique à une approche de génomique fonctionnelle. La chaîne lourde de la clathrine a été identifiée au cours de ce crible comme une protéine interagissant avec le complexe Scar/WAVE et dont la déplétion affecte la formation des lamellipodes. Ce rôle de la clathrine dans la formation des lamellipodes peut être découplé de son rôle classique dans le transport vésiculaire en utilisant différentes approches. De plus, la clathrine est localisée au lamellipode en l'absence d'adapteurs et des protéines accessoires de l'endocytose. La surexpression de la clathrine affecte le recrutement membranaire du complexe WAVE réduisant ainsi la vélocité des protrusions membranaire et la migration cellulaire. Par opposition, lorsque la clathrine est envoyée artificiellement à la membrane plasmique par une fusion à une séquence myristoylée, on observe une augmentation du recrutement membranaire du complexe Scar/WAVE, de la vélocité des protrusions membranaires et de la migration cellulaire. L'ensemble de ces résultats montrent que la clathrine envoie le complexe Scar/WAVE à la membrane plasmique et donc contrôle la formation des lamellipodes en plus de son rôle plus classique dans le traffic membranaire. / The Scar/Wave complex (SWC) generates lamellipodia through Arp2/3-dependent polymerization of branched actin networks. In order to identify new SWC regulators, we conducted a screen in Drosophila cells combining proteomics with functional genomics. This screen identified Clathrin Heavy Chain (CHC) as a protein that binds to the SWC and whose depletion affects lamellipodium formation. This role of CHC in lamellipodium formation can be uncoupled from its role in membrane traffic by several experimental approaches. Furthermore, CHC is detected in lamellipodia in the absence of the adaptor and accessory proteins of endocytosis. We found that CHC overexpression decreased membrane recruitment of the SWC, resulting in reduced velocity of protrusions and reduced cell migration. In contrast, when CHC was targeted to the membrane by fusion to a myristoylation sequence, we observed an increase in membrane recruitment of the SWC, in protrusion velocity and in cell migration. Together these data suggest that CHC brings the SWC to the plasma membrane, thereby controlling lamellipodium formation, in addition to its classical role in membrane traffic.

Dans une cellule en migration, la polymérisation d'actine permet de projeter la membrane plasmique dans une structure appelée le lamellipode. Dans le lamellipode, l'actine est polymérisée de manière branchée par le complexe Arp2/3. L'activation du complexe Arp2/3 au lamellipode est sous le contrôle du complexe WAVE. En réponse à une cascade d’activation moléculaire, une des sous-unités du complexe WAVE expose son domaine WCA (WH2-Connecteur-Acide) qui peut alors se lier au complexe Arp2/3 et l’activer afin d'initier la formation d’un nouveau filament d’actine. La voie d’activation du complexe Arp2/3 par le complexe WAVE a été bien étudiée. Cependant la migration cellulaire est finement régulée et cette unique voie de signalisation nous semblait insuffisante. Dans le but de trouver de nouveaux régulateurs de la migration et en particulier de nouvelles protéines se liant au complexe Arp2/3, nous avons réalisé un crible bioinformatique identifiant les protéines contenant un motif Acide. Ce dernier a abouti à l’identification d’une protéine non caractérisée. In vitro, cette protéine n'active pas le complexe Arp2/3. En revanche, elle est capable d'inhiber l'activation du complexe Arp2/3 induite par le domaine WCA d'un activateur et empêche la formation de branches par le complexe Arp2/3. Nous avons appelé cette nouvelle protéine Arpin pour « Arp2/3 Inhibitor ». De manière cohérente avec son rôle inhibiteur in vitro, la déplétion d'Arpin dans différents type de cellules, induit une augmentation de la vitesse de protrusion des lamellipodes et une demi-vie augmentée des lamellipodes. Ces effets se traduisent par une migration plus rapide et plus persistante en direction. Arpin joue donc le rôle d'un frein de la migration cellulaire et permet à la cellule de tourner. Pour jouer ce rôle-là, Arpin nécessite d’être régulée rigoureusement. Dans la cellule, Arpin est inactive et nécessite d’être activée par Rac. Cependant cette régulation n'est probablement pas directe. Pour mieux comprendre la régulation d'Arpin, nous avons donc recherché des protéines partenaires. Nous avons identifié Tankyrase comme protéine interagissant avec Arpin. De façon significative, le motif d’Arpin qui permet son interaction avec Tankyrase se superpose à la séquence Acide nécessaire à son interaction avec le complexe Arp2/3. Nous avons mis en évidence in vitro une compétition entre Tankyrase et le complexe Arp2/3 sur Arpin. Ces résultats suggèrent Tankyrase inhibe la protéine inhibitrice Arpin. En conclusion, nous avons découvert une nouvelle protéine Arpin, qui inhibe le complexe Arp2/3 et qui joue un rôle régulateur important dans la migration cellulaire. Nous avons identifié une protéine régulatrice de son activité, la Tankyrase. Nous nous attendons à ce qu’Arpin soit impliquée dans des nombreux processus physiologiques ou pathologiques, où la migration cellulaire joue un rôle important, en particulier lors de la formation de métastases dans le cancer. / In migrating cells, the Arp2/3 complex generates branched actin networks that power protrusion of the leading edge in a structure called lamellipodium. The Arp2/3 complex is activated at the leading edge by the Wave complex which is itself activated by the small GTPase Rac. WAVE which is in an inactive state, then exposes its WCA domain (WH2-Connector-Acidic) that can bind to the Arp2/3 complex and activate it to trigger the formation of a new daughter actin filament. This signalling pathway of the Arp2/3 complex has been well studied. However, cell migration is a fine-tuned process that is probably regulated in a more complex manner.To identify new regulators of cell migration, especially proteins that bind to the Arp2/3 complex, we performed a bioinformatics screen to identify proteins containing an acidic motif at its C-terminus, a characteristic motif of Arp2/3 activators. By this method we retrieved an uncharacterized protein. A combination of in vitro assays revealed, however, that this protein inhibits the Arp2/3 complex by competing with the activators. We called this protein Arpin for “Arp2/3 inhibitor”. Depletion of Arpin in different kind of cells, such as mammalian cells or amoeba, induces lamellipodia to protrude faster and to last longer, consistent with its inhibitory role on Arp2/3 complex activity. These effects observed lead to an increased velocity and a more directional migration in random migration assay. The function of the Arp2/3 inhibitory protein Arpin is thus to slow down and steer cell migration.In the cell, Arpin has been shown to be inactive until it is activated by Rac, most likely by an indirect manner. We identified Tankyrase as an interactor of Arpin. Interestingly, the binding motif of Arpin to Tankyrase overlaps the acidic motif required for the binding to the Arp2/3 complex. By a biochemistry approach, we showed a competition between Tankyrase and the Arp2/3 complex for the binding to Arpin. This observation suggests that Tankyrase inhibits the inhibitory protein Arpin in the cell. To conclude, we identified a new protein, Arpin which inhibits the Arp2/3 complex and plays an important role in the control of cell migration. We identified a protein which regulated its activity, Tankyrase. Thus, we can imagine that Arpin could be implicated in numerous physiological and pathological processes where cell migration is involved, particularly during metastases formation in cancer

La motilité cellulaire est un processus intégré essentiel à de nombreux phénomènes physiologiques tels que la formation du cône de croissance et la plasticité synaptique. Des dérégulations de la motilité cellulaire peuvent être à l’origine de la formation de métastases ou de pathologies neuropsychiatriques comme la schizophrénie et l'autisme. La compréhension des mécanismes régulant la migration cellulaire est donc un enjeu majeur. La motilité cellulaire repose sur la formation de diverses structures constituées de réseaux d’actine branchés telles que le lamellipode. La formation du lamellipode nécessite l’intervention de protéines régulatrices de l’actine telles que Rac1 et les complexes Wave et Arp2/3. Grâce à l’utilisation de suivi de protéine unique, nous avons pu comprendre comment la coordination spatio-temporelle de ces régulateurs contrôle la formation et la morphologie des lamellipodes de cellules migrantes. Nous avons ainsi découvert que l’activation et la localisation du complexe Wave étaient régulées de manière enzymatique mais également mécanique. Dans une première étude, nous avons montré que la RhoGTPase Rac1 active le complexe Wave spécifiquement à l’extrémité du lamellipode. Dans une seconde étude, nous avons révélé que la localisation du complexe Wave est régulée par la dynamique des filaments des réseaux branchés d’actine. Ces données soulignent l’importance du complexe Wave dans la formation du lamellipode et révèlent l’existence d’une régulation mécanique de la localisation du complexe Wave. / Cell motility is an integrated process involved in critical phenomena such as axonal pathfinding and synaptic plasticity. Dysregulation of cell motility can induce metastasis and abnormal spine shapes observed in neuropsychiatric disorders like autism and schizophrenia. Therefore it is essential to understand how cell motility is regulated. Cell motility requires the formation of branched actin networks propelled by actin polymerization that lead to the formation of membrane protrusions such as the lamellipodium. Several actin regulatory proteins are involved in this process, such as Rac1 and the WAVE and ARP2/3 complexes. Using single protein tracking, we revealed key phenomena concerning the spatio-temporal regulation of lamellipodium formation by actin regulatory proteins. We found that the localization and activation of the WAVE complex was enzymatically regulated, but also mechanically. First, we showed that the Rac1 RhoGTPase activates the WAVE complex specifically at the tip of the lamellipodium. We also showed that WAVE complex localization is regulated by the dynamics of branched-network actin filaments. This study confirms the crucial role of the WAVE complex in lamellipodium formation and reveals the existence of a mechanical regulation of the localization of this complex in the cell.