Au cours de la réparation cutanée, l’étape de réépithélialisation est essentielle car son objectif est de restaurer la fonction barrière de la peau. Elle consiste en une série d’étapes coordonnées où les kératinocytes migrent, prolifèrent et se différencient jusqu’à restauration complète de l’épiderme. Régulée de façon simultanée au niveau intracellulaire mais également extracellulaire, elle dépend de la production de facteurs de croissance, de métalloprotéases matricielles (MMPs) et de protéines de la matrice extracellulaire sur lesquelles les kératinocytes adhèrent et migrent par l’intermédiaire de récepteurs de la famille des intégrines ou des syndécans. Parmi les ligands matriciels, la laminine 332 (LN332), qui est connue comme étant la protéine d’adhésion majeure des kératinocytes de l’épiderme, s’avère être également impliquée au cours de la réépithélialisation et jouer un rôle important dans les processus d’adhésion et de migration des kératinocytes, notamment par le biais de son domaine globulaire LG4/5 localisé à l’extrémité C-term de sa chaine 3. De récentes études ont montré que ce domaine LG4/5 induit la migration des kératinocytes normaux humains (NHK), impliquant des MMPs pro-migratoires MMP-1 et MMP-9. Puisque les domaines LG4/5 ont été montrés comme participant à la dynamique du cytosquelette et au mouvement cellulaire par le biais des récepteurs syndécan-1 et -4, mon laboratoire d’accueil a décidé d’étudier l’implication du récepteur syndécan-1 dans ce processus d’expression de la MMP-9. Les analyses PCR et les résultats de zymographie obtenus ont révélé que le syndécan-1 joue un rôle dans l’expression et l’activation de la MMP-9 induite par le domaine LG4/5. De plus, la déplétion de l’expression du syndécan-1 dans les NHK a confirmé ces résultats. De précédents résultats de mon laboratoire d’accueil ont montré que le domaine LG4/5 induit la formation de filopodes médiée par le syndécan-1 au niveau du front de migration des kératinocytes. De ce fait, nous avons effectué des zymographies de gélatine in situ chez des NHK en migration afin d’observer la localisation de la MMP-9 et de savoir si cette dernière était trouvée au niveau de ces structures d’adhésion protrusives. Nous avons observé des zones de digestion de gélatine sous les NHK ressemblant à des points de contact d’adhésion. Leur nombre est augmenté chez des NHK traités avec le domaine LG4/5 de la LN332. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des gélatinases et de la MMP-9 ont révélé que cette dernière est responsable de la formation de ces zones de digestion de gélatine. Parce que ces structures évoquent des podosomes, nous avons décidé de révéler leurs constituants majoritaires, à savoir la cortactine, la vinculine, l’-actinine, VASP, WASP ou encore Arp2/3. Dans le même temps nous avons également révélé le syndécan-1 afin de voir si ce dernier était présent dans ces structures. Nos résultats ont montré que tous les marqueurs des podosomes étaient localisés soit sous la forme d’un point à l’intérieur des zones de digestion pour les protéines régulatrices de l’actine, soit sous la forme d’un anneau entourant les zones de digestion pour les protéines d’adhésion et de signalisation associées à la membrane, confirmant donc que les structures observées sont bien des podosomes. Le syndécan-1 apparaît également sous une forme d’anneau, entourant les protéines régulatrices de l’actine et les zones de digestion laissant penser que le syndécan-1 serait impliqué dans ces structures. La diminution de l’expression du syndécan-1, en utilisant l’approche des petits ARN interférents dans des NHK, a montré que l’absence de syndécan-1 diminue de façon drastique le nombre et la surface des zones digérées. L’ensemble de nos résultats montre que le syndécan-1 serait un constituant des podosomes des kératinocytes, participant à leur formation et jouant un rôle dans le contrôle de l’expression de la MMP-9 / During skin repair, the reepithelialization step is essential to restore the skin barrier function. lt occurs by an orderly series of events whereby keratinocyte migrate, proliferate and differentiate until complete epidermal restoration. Keratinocyte migration determines the efficiency of the overall wound repair process. The keratinocyte's migratory behavior depends on the production of growth factors, matrix metalloproteinases (MMP) and on the dynamic interactions of the cells with extracellular components. Laminin 332 (LN332), known as a major adhesion substrate for keratinocytes, was shown to contribute to skin reepithelialization through its a3 chain C-terminal domains LG4/5. Recent studies have reported that LG4/5 induces keratinocyte migration, an event that relies on the involvement of the pro-migratory MMP-1 and MMP-9. As LG4/5 domains were shown to participate in cytoskeleton dynamic and cell movement through binding of the heparan sulfate proteoglycans syndecan-1 and -4, we analyzed the potential involvement of these receptors in this process. The PCR analysis and zymography results revealed that syndecan-1 plays a role in LG4/5 induced MMP-9 expression and activation. Down regulating or overexpressing syndecan-1 expression in cells confirmed these findings. As LG4/5 was shown to induce the formation of syndecan-1-mediated filopodia at the front of migrating cells, we performed in situ zymography experiments in migrating keratinocyte to analyze whether MMP-9 is found in these protrusive adhesion structures. Very interestingly, we found areas of digested gelatin resembling adhesion contacts underneath keratinocytes. Their number was increased in LG45-treated keratinocytes, a result in line with our previous data. The use of specific MMP inhibitors revealed that MMP-9 is responsible for the formation of these digested gelatin clusters. Further confocal microscope analysis revealed, at the cellular level, the presence of actin located within the digested areas, suggesting that an adhesion receptor would be involved in this process. Because these structures resemble podosomes, we revealed major podosome components, such as cortactin, vinculin, -actinin, VASP, WASP, Arp2/3 or dynamin and integrin. Our results showed all the podosome markers either within the digested areas (regulatory actin proteins) or organized as ring encircling the digested areas (signaling and adhesion proteins associated with plasma membrane), confirming that these structures are podosomes. Syndecan-1 also appears as a ring around the digested areas and encircling the regulatory actin proteins, suggesting that this receptor could be involved in these structures. The syndecan-1 depletion in normal human keratinocytes with specific siRNAs drastically decreased the digested areas surface. Taken together, our data demonstrate that syndecan-1 is a podosome components, participating in their formation and playing a role in MMP-9 expression and deposition. These results suggest that its re-distribution at the front edge of migrating keratinocyte may have a role to play in the cleavage or degradation of extracellular matrix proteins therefore facilitating their path through the fibrin clot

L’interaction du récepteur syndecan-1 de la famille des héparanes sulfates protéoglycanes avec le fragment carboxy-terminal alpha3LG4/5 de la protéine d’adhérence matricielle, la laminine 332, induit une réorganisation du cytosquelette de la cellule conduisant à la formation de filopodes et de microspicules, caractéristiques de la migration cellulaire. Notre laboratoire a mis en évidence que l’adhésion cellulaire syndecan-1 dépendante implique les chaînes d’héparanes sulfates et chondroïtine sulfate. Afin d’identifier le (les) zone(s) impliquée(s) dans l’interaction domaine LG4/5-syndécan-1, une approche de mutagenèse dirigée a été mise en place sur le fragment LG4/5 recombinant. Les résidus conservés parmi les laminines, identifiés dans la littérature comme liant l’héparine, aussi bien que des résidus basiques spécifiques à la chaine α3 identifiés par des approches prédictives, ont été remplacés par le résidu neutre glutamine. Toutes les protéines couplées avec l’étiquette 6-Histidine ont été produites dans des cellules de mammifère, purifiées par chromatographie d'affinité et caractérisées biochimiquement et par dichroïsme circulaire. L’évaluation de l’affinité des protéines produites pour l’héparine nous a permis d’identifier un site d’interaction majeur avec les glycosaminoglycanes dans le domaine LG4/5, entouré par des résidus à mineur affinité. La technique de résonance plasmonique de surface et des tests d’adhérence cellulaire nous ont permis de confirmer ce résultat puisque l’absence du site d’interaction majeur avec l’héparine a produit une inhibition totale de l’adhérence. Des expériences de pull-down nous ont montré que ce site est aussi impliqué dans l’interaction avec le syndecan-4, indiquant que cette séquence pourrait ainsi jouer un rôle dans différents processus cellulaires. Une collaboration avec des bio-informaticiens nous a permis de proposer un modèle structural du domaine LG4/5 et de montrer que la zone identifiée est localisée dans une boucle exposée à l’extérieure du module LG4, entourée par des résidus à plus faible affinité / The HSPG receptor syndecan-1 interacts with the carboxy-terminal LG4/5 domain in laminin 332 to participate in keratinocyte migration by inducing formation of cytoskeleton related protrusive structures. We have shown that syndecan-1 mediated cell adhesion occurs in heparan sulphate and chondroitin sulphate dependent manner and that these two glycosaminoglycan (GAG) chains bind independently to LG4/5 with different affinities. To identify residues involved in the interaction of the LG4/5 domain with syndecan-1 and to apprehend the molecular basis of the GAGs interaction specificity, we have used a site-directed mutagenesis approach of the recombinant LG4/5 fragment. The residues identified as conserved heparin binding residues throughout laminins, as well as “candidate” basic residues identified through predictive approaches, have been replaced by the neutral residue glutamine. All LG4/5 proteins carrying a hexa-histidine tag at their C-terminal end were expressed in mammalian cells. The produced proteins were purified and characterized biochemically. Circular dichroism studies performed on all mutagenised proteins showed that the overall structure of each mutant is comparable to that of the wild type protein. Heparin affinity chromatography analysis allowed us to identify a major heparin binding site in the LG4/5 domain surrounded by several minor GAG binding sites. Surface plasmon resonance analysis of mutated LG4/5 proteins-heparan sulphate interaction confirmed these results. These findings were well correlated with our in cellulo syndecan-1 mediated cell adhesion as the lack of this major heparin binding site totally abrogated cell adhesion. Pull down experiments allowed us to show that this heparin binding site sequence is responsible not only for the interaction of the receptors syndecan-1 but also for syndecan-4 suggesting that additional cellular functions may be carried by this sequence. Our structural predictions suggest that the LG4/5 in laminin 332 encompasses a major GAG binding site surrounded by a track of converging positively charged residues