L'homéostasie épidermique repose sur différents paramètres dont les propriétés mécaniques du tissu de soutien, le derme, et les tensions intrinsèques dans le tissu épithélial. Lors de la cicatrisation, l'augmentation de la rigidité cutanée résultante peut perturber les conditions initiales de l'homéostasie. Afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires dans ce contexte physiopathologique, et l'incidence des propriétés mécaniques du derme sur le comportement du kératinocyte humain, des cellules primaires ont été cultivés à la surface d'hydrogels de polyacrylamide de différentes rigidités, et sur le plastique (> GPa), condition in vitro classiquement utilisée. Nos résultats ont mis en évidence que les substrats les plus mous favorisent un arrêt de prolifération et un profil phénotypique similaire à un kératinocyte différencié, alors que les substrats les plus rigides facilitent l'adhérence et la prolifération au détriment de la capacité de différenciation, et ce de façon graduelle. L'analyse transcriptomique par séquençage haut débit a permis d'identifier un récepteur membranaire orphelin couplé à la protéine G, GPRC5A (G Protein-Coupled Receptor Class C Group 5 Member A) et une protéine du cytosquelette, la spectrine beta III, dont les augmentations d'expression sont corrélées à l'augmentation de la rigidité. In vivo, GPRC5A est exclusivement localisé dans les berges de la plaie, lieu des kératinocytes en migration. Ces observations ont été confirmées par l'utilisation d'outils d'ARN interférence (siRNA et shRNA) dirigés contre GPRC5A dans les kératinocytes humains, montrant l'implication de ce récepteur dans l'adhérence et la migration cellulaire. De plus, les résultats montrent que la diminution de GPRC5A entraine un défaut de différenciation et d'organisation du feuillet épidermique, conduisant notamment à une mort cellulaire accrue, dans un modèle d'épiderme reconstruit. En parallèle, par des approches similaires d'ARN interférence dirigée contre le gène SPTBN2 (spectrin beta non-erythrocytic 2) codant pour la spectrine beta III, les résultats mettent en évidence un rôle fonctionnel de la spectrine beta III dans la prolifération cellulaire, l'étalement, la migration des kératinocytes et participe à la mécanotransduction en réponse à la rigidité en permettant la survie cellulaire. L'ensemble des résultats de la thèse montrent une adaptation phénotypique des kératinocytes dépendante de la rigidité du substrat sur lequel ils se trouvent et positionne GPRC5A et la spectrine beta III comme des acteurs clés dans la réponse du kératinocyte primaire humain aux changements mécaniques. Ces résultats permettent d'ouvrir de nouvelles voies stratégiques pour le traitement de la cicatrisation et plus largement dans les pathologies affectant la mécanique cutanée / Epidermal homeostasis is determined by several characteristics, including dermis mechanical properties. During skin wound healing, dermis mechanical properties are modified and can alter epidermal integrity. Accordingly, it is essential to understand how keratinocytes respond and adapt to mechanical changes; however, these mechanisms remain unclear. To investigate how mechanical properties of cell microenvironment affect the human keratinocyte, primary cells were seeded on polyacrylamide hydrogels of different compliances (soft: 4 kPa, medium: 14 kPa, rigid: 45 kPa) in comparison with glass coverslip (> GPa). The results showed that on the softer hydrogel, keratinocyte spreading and proliferation were strongly decreased, while a strong increase in the expression of late differentiation markers was observed. On the contrary, the stiffer substrates promote adhesion and proliferation. Moreover, a transcriptomic profiling analysis reveals G protein-coupled receptor, class C, group 5, member A (GPRC5A) and spectrin beta non-erythrocytic 2 (SPTBN2) as potential mechanosensors for substrate adaptation of the keratinocyte. Actually, GPRC5A and SPTBN2 gene expression levels are associated with stiffness increase. We have characterized a dynamic relocation of GPRC5A during keratinocyte adhesion. Furthermore, the knockdown of GPRC5A increased cell adhesion and reduced cell migration. These results were confirmed by GPRC5A immunostaining in healing wounds from mice skin, showing a transient and specific expression of GPRC5A at wound leading edges, a site of cell migration, thus strengthening a role of GPRC5A in the keratinocyte migration process. Concerning SPTBN2, the knockdown of SPTBN2 decreased cell proliferation, spreading and migration, indicating a functional role in keratinocyte processes. Moreover, SPTBN2 knockdown induced keratinocyte death on soft substrate. In conclusion, we demonstrated an adaptive response of keratinocytes depending on substrate stiffness. We also found a new function of GPRC5A in keratinocyte process during skin wound healing and a mechanosensor role of SPTBN2 in keratinocyte. All of these results place GPRC5A and SPTBN2 as key regulators in the response to mechanical changes. These results pave new strategic pathways in skin wound healing treatment, and more widely in the pathologies affecting cutaneous mechanics

Un réseau de cytokine complexe a été décrit dans le psoriasis mettant en évidence le rôle central des cytokines proinflammatoires dans la physiopathologie de cette maladie. Notre tentative de modéliser l'inflammation cutanée a montré que la combinaison de l'IL-17A, IL-22, IL-1α, oncostatine M (OSM) et le TNFα, augmente de manière synergique l'expression de chimiokines et de peptides antimicrobiens, reflétant certaines caractéristiques du psoriasis. D'autres caractéristiques de cette maladie sont l'acanthose et le blocage de la différenciation des kératinocytes. Notre premier objectif était d'étudier le rôle respectif de ces cytokines sur la différenciation des kératinocytes en comparaison avec les lésions de patients psoriasiques. Toutes ces cytokines inhibent l'expression des marqueurs de différentiation des kératinocytes, parmi lesquelles l’IL-22 et l’OSM sont les plus puissantes et le mélange M5 présente des effets synergiques. Si l'IL-22 et l'OSM déclenchent plus spécifiquement l'hyperplasie épidermique et le blocage de la différenciation, l’IL-1α, IL-17A et le TNFα sont plutôt impliqués dans l'activation de l'immunité innée. Le rôle fonctionnel de chacune de ces cytokines in vivo a été étudié dans un modèle d'inflammation cutanée de type psoriasique induit par l'imiquimod (IMQ), un agoniste TLR7, en utilisant des souris déficientes en cytokines. L'absence de l'OSM ou de l'OSMRβ n'a pas modifié le développement des lésions inflammatoires induites par l’IMQ. Une hypothèse est que d'autres cytokines peuvent avoir des effets redondants avec l'OSM. L'absence de l'IL-22 chez la souris diminue partiellement les lésions cutanées induites par l'IMQ, démontrant que son retrait du réseau cytokinique rompt une partie des effets synergiques des cytokines in vivo comme présenté dans le modèle M5. L'absence de l'IL-1α ou de l'IL-1β ne modifie pas l'inflammation cutanée induite par l'IMQ, ce qui n'est pas surprenant au vu des activités redondantes de ces deux cytokines. La diminution partielle de l'inflammation en absence d'IL-1α ET d'IL-1β OU de la chaine réceptrice commune IL-1RI confirme ces observations. A long terme ces études devraient permettre de proposer des stratégies anti-cytokine ciblées et combinées pour tenter de rompre la synergie et diminuer ainsi toutes les composantes de la réponse inflammatoire cutanée. / A complex cytokine network has been described in psoriasis and highlighted a central role of proinflammatory cytokines produced by infiltrated immune cells. Our attempt to model skin inflammation showed that the combination of IL-17A, IL-22, IL-1α, OSM and TNFα (Mix M5) synergistically increases chemokines and antimicrobial-peptides expression, recapitulating some features of psoriasis. Other characteristics of psoriasis are acanthosis and down-regulation of keratinocyte differentiation markers. Our aim was to characterize the specific roles of these cytokines on keratinocyte differentiation, and to compare with psoriatic lesion features. All cytokines decrease keratinocytes differentiation markers expression, but IL-22 and OSM were the most powerful, and the M5 strongly synergized the effects. If IL-22 and OSM more specifically drive epidermal hyperplasia and differentiation loss, IL-1α, IL-17A and TNFα were more involved in the activation of innate immunity. Functional role of these cytokines in vivo was studied in imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation by using knockout mice. Imiquimod (IMQ) is a TLR7 ligand. The absence of OSM or OSMRβ did not affect skin lesions after IMQ treatment. We supposed that other cytokines might be redundant with the OSM effects. The absence of IL-22 in mice partially reduced skin lesions induced by IMQ, demonstrating that removal of IL-22 in cytokine network break synergistic effects of cytokines in vivo as observed in in vitro with M5. The absence of IL-1α or IL-1β did not affect skin lesions after IMQ treatment, supporting the potential redundant activity of these cytokines, since the response is attenuated in mice deficient for both IL-1α and IL-1β or for IL-1RI. In the long term these studies should propose strategies targeted and combined anti-cytokine in order to break the synergy and thus reduce all components of the inflammatory skin response.

Ces dernières décennies, les populations, civiles en général et professionnelles en particulier, ont été soumises à une exposition croissante aux champs électriques (EF) et magnétiques (MF) d'extrêmement basses fréquences (ELF). Différentes réponses biologiques ont été observées sur différents types de cellules et de tissus exposés à des courants et des champs ELF. Ces études permettent une meilleure connaissance de notre environnement électromagnétique mais les mécanismes biologiques précis et les implications des fréquences ELF sur la santé restent peu connus. Il est nécessaire de développer des protocoles de recherche pour répondre à ces questions. La revue exhaustive de la littérature met clairement en avant :- le manque de connaissance des mécanismes cellulaires activés après stimulation ELF;- l'importance de leur étude pour toutes recherches liées à l'utilisation de la stimulation ELF;- l'efficacité des techniques omiques qui permettent l'identification de ces mécanismes cellulaires;- l'importance du choix des modèles expérimentaux utilisés afin de faciliter l'extrapolation des résultats chez l'homme.Pour répondre à ces observations, nous avons recherché les gènes et les mécanismes cellulaires impliqués lors de la stimulation ELF sur un modèle de culture d'explants de kératinocytes humains mis en culture sur support dermique dévitalisé et stimulé par un courant électrique pulsé. Nous pensons que la recherche sur un modèle humain in vitro permet d'obtenir des résultats plus intéressants pouvant être extrapolés plus facilement aux études épidémiologiques ou cliniques.Les résultats préliminaires obtenus sur ce modèle de culture par Hinsenkamp et al. aboutissent à la même conclusion que leurs études des effets des champs sur le tissu osseux. Ils ont observés à partir de différents modèles, une maturation plus rapide de la matrice cartilagineuse associée à une accélération de l'ossification des tissus embryonnaires. Les analyses microarrays ont été réalisées sur 288 explants d'épiderme provenant de 3 cultures cellulaires indépendantes utilisant l'épiderme de 3 sujets différents. La première analyse des résultats montre que, pour un certain nombre de sondes, la valeur du taux d'expression est différente lorsque l'on compare deux à deux les conditions d'échantillonnage. Cette observation est valable pour l'évolution naturelle au cours du temps des cultures témoins (J4T/J1T :296 sondes; J7T/J1T :702 sondes; J12T/J1T :1006 sondes) ou des cultures stimulées (J4S/J1T :941 sondes; J7S/J1T :625 sondes; J12S/J1T :946 sondes) ainsi que pour la comparaison d'un temps stimulé à son temps témoin (J4S/J4T :304 sondes; J7S/J7T :220 sondes; J12S/J12T :496 sondes).L'analyse de l'évolution des résultats au cours du temps (comparaison de Jx à J1) pour le groupe témoin et stimulé montre que, si la stimulation augmente ou diminue la régulation de certains gènes par rapport à J1 (témoin), la variation n'est généralement pas suffisante pour statistiquement inverser le sens de la régulation naturellement observée dans le temps. Seuls 3 gènes (EPS8, ADAMTS1, NOS1) ne suivent pas cette règle.De plus, la comparaison des listes de gènes aux 3 temps d'échantillonnage J4, J7 et J12, montre que 3 gènes sont systématiquement exprimés dans les trois groupes stimulés comparés à leur témoin respectif :TXNRD1, ATF3 et MME. Ils sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération, la différenciation et la mitose. L'analyse du rôle joué par DKK1 et MACF1 au temps J4 montre que la sur-expression de DKK1 et la sous-expression de MACF1 ont pour effet l'inhibition du "pathway Wnt" ce qui provoque une diminution de la prolifération et une augmentation de la différenciation terminale. Parmi les variations intéressantes, BMP-2 est sur-exprimée au temps J12. Cette protéine est connue pour jouer un rôle important dans l'ostéogenèse, l'angiogenèse et la maturation cellulaire.Une analyse par triangulation montre que la stimulation par un courant ELF pulsé accélère la sur- ou la sous-expression de certains gènes qui, dans des circonstances normales (groupe témoin non stimulé), auraient suivi la même tendance (sur- ou sous-régulation) mais de manière plus lente. Parmi ces gènes, CHEK1, DKK1, NDRG4, SPRR3 sont connus pour jouer un rôle dans la prolifération et la différenciation; UBE2D3 est actif dans la voie de signalisation de la BMP-2; les autres gènes sont actifs dans la mitose, le développement cellulaire et la réplication de l'ADN.Nous avons ensuite utilisé des outils informatiques qui permettent une analyse sans apriori des résultats :L'analyse du graphe orienté acyclique généré par WebGestalt sur base des données de GO a mis en évidence les processus biologiques impliquant les gènes présents dans nos résultats et dont la régulation a été modifiée. Ces gènes ont des fonctions dans les mécanismes du cycle cellulaire, de la mitose, de la prolifération ou de la différenciation. Ces résultats sont cohérents avec les résultats macroscopiques précédents et les premières observations présentées ci-dessus.Pour mettre en évidence les voies de signalisation actives dans les processus biologiques, nous avons utilisé KEGG qui indique que les voies "cycle cellulaire" et "voie de signalisation de p53" utilisent un nombre statistiquement significatif de gènes présents dans nos résultats. Le cycle cellulaire et la mitose sont impliqués dans la prolifération cellulaire. La différenciation a également besoin de cette étape proliférative puisque ce sont les cellules filles qui deviendront des cellules matures. La "voie de signalisation p53" est également active dans le cycle cellulaire, la différenciation, l'apoptose et le maintien de l'intégrité cellulaire. L'analyse des voies connexes à "p53" et à "cycle cellulaire", utilisant des gènes présents dans nos résultats, a mis en avant plusieurs cascades dont certaines utilisent des gènes actuellement connus pour n'avoir de rôle que dans une seule cascade. Ces gènes sont des candidats potentiels à la fonction de marqueur de la stimulation ELF. On y retrouve entre autre FoxO :régulé par JNK (membre des MAPK), actif avec TGF-β1 dans la migration cellulaire et la diminution de l'apoptose; Jak/STAT qui active la voie "cytokine-cytokine receptor interaction" utile lors de la prolifération, différenciation, migration, apoptose et survie cellulaire; Wnt qui régule la prolifération, la différenciation ainsi que la mobilité cellulaire. D'autres voies d'intérêt mais n'utilisant pas de gène ayant une fonction unique ont été listées :PI3K/Akt, en partie régulée par la phosphorylation de FoxO, a une fonction dans la prolifération cellulaire.Les différentes analyses réalisées avec Pathway studio confirment qu'une grande majorité des gènes présents dans nos résultats sont actifs dans les processus de prolifération, différenciation, croissance cellulaire, cycle cellulaire, mitose, apoptose, migration et survie cellulaire. Plusieurs gènes et mécanismes discutés précédemment (ADAMTS1, ATF3, BMP-2, DKK1, DUSP4, MACF1, MME, PDGFRA, SFRP1, TXNRD1, WNT) ont été isolés par le programme. La recherche des mécanismes utilisant les gènes isolés lors de l'analyse par triangulation les relie à la prolifération, la différenciation, l'adhésion cellulaire, la réplication de l'ADN et la mort cellulaire.Pathway Studio nous a permis de localiser dans la cellule les protéines qui devraient finalement être traduites suite à la modification de l'expression de leurs gènes. Cette analyse permet d'étudier les interactions entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule ainsi que rechercher les protéines stimulant un grand nombre d'autres protéines ou recevant un grand nombre de stimuli. La protéine extracellulaire Endothelin 1 (ET-1), codée par le gène EDN1, agit sur 9 protéines membranaires différentes :EGFR par l'intermédiaire de la signalisation des MAPK; PDGFRA; GLUT-3 (exprimé à partir du gène SLC2A3); COX-2 (exprimée à partir du gène PTGS2); EP4 (exprimée à partir du gène PTGER4); PLAUR et les gènes IER3, CD44 et IL6ST qui seront traduits en protéines membranaires. Neuregulin 1, codée par le gène NRG1, est la seconde protéine extracellulaire la plus active vers les protéines membranaires différentes. L'analyse des résultats met en évidence 840 interactions entre une protéine extracellulaire et une protéine nucléaire en incluant une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique. Les protéines membranaires recevant des informations du plus grand nombre de protéines extracellulaires sont EGFR et FAS. C'est également EGFR, une des voies de signalisation les plus importantes de la régulation de la croissance, la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire, qui transmet le plus d'informations aux protéines cytoplasmiques. FAS est capable de réguler l'apoptose et la prolifération en fonction du taux de fixation de son ligand.A l'aide d'un screening par la technique des microarrays de l'expression des gènes réalisé sur des échantillons témoins et stimulés, nous avons :- vérifié la cohérence des résultats avec les études historiques;- mis en évidence les processus biologiques responsables de la réponse cellulaire observée;- isolé une liste de gènes "marqueurs potentiels" impliqués spécifiquement dans ces mécanismes:- vérifié l'hypothèse que la stimulation ELF accélère dans le temps l'apparition de phénomènes qui seraient apparus naturellement mais avec une latence plus longue.Les observations faites dans le cadre de cette étude ont mis en évidence un nombre important d'informations. Plusieurs d'entre elles nécessitent des recherches complémentaires afin de préciser et de confirmer les résultats. Il serait intéressant :- de comparer et de grouper les résultats de la littérature montrant des effets similaires même si la stimulation ou le modèle de culture sont différents;- de développer les techniques de microdosimétrie afin de connaître avec précision la stimulation reçue par la cellule;- de développer l'étude des signaux afin de découvrir la composante active qui déclenche la réaction de la cellule;- de mettre en place un protocole étudiant la voie métabolique Wnt sur des cellules sanguines en incluant un dosage de la β-caténine pour étudier l'effet de la stimulation sur la leucémie infantile. Il faudra vérifier que les gènes exprimés dans nos résultats soient finalement traduits en protéines actives afin de confirmer leur rôle comme marqueurs de la stimulation ELF. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules souches de l’épiderme interfolliculaire humain, appelées cellules souches kératinocytaires (CSK), assurent l’homéostasie et le renouvellement du tissu durant toute la vie d’un individu grâce à leur importante capacité d’autorenouvellement. Ma thèse de doctorat a porté sur l’étude des effecteurs moléculaires impliqués dans la balance entre prolifération et quiescence dans un modèle in vitro de CSK, isolées de manière clonale et définies par le terme holoclone. Je me suis tout d’abord intéressée à la réponse des holoclones à l’effet d’un régulateur important de la prolifération et de la quiescence des cellules souches adultes : le facteur de croissance TGF β1. Mon travail s’est ensuite focalisé sur l’étude d’un gène agissant en aval de la voie de signalisation TGF β, le facteur de transcription Klf4, et dont le rôle dans la biologie des cellules souches adultes reste largement méconnu. Klf4 est en effet surtout décrit pour son rôle dans la reprogrammation des cellules somatiques en cellules iPS. Le maintien de la sensibilité des holoclones aux signaux inhibiteurs de la croissance constitue un gage de la normalité des CSK. Notre étude de la réponse des holoclones à l’effet antiprolifératif du TGF β1 montre que les holoclones, dotés d’un fort potentiel de croissance, caractéristique des CSK, conservent leur sensibilité à l’effet du TGF β1. Ces résultats nous ont permis de valider les holoclones comme constituant un modèle pertinent pour caractériser la biologie normale des CSK et décrypter les contrôles moléculaires de l’état souche. Le modèle des holoclones a été exploité dans le cadre d’une approche de génomique fonctionnelle visant à déterminer le rôle du facteur de transcription Klf4 dans les CSK. L’utilisation de vecteurs lentiviraux exprimant un shARN dirigé contre l’ARNm de Klf4 nous a permis d’étudier l’impact d’une modulation fine du niveau d’expression de Klf4 sur les propriétés des holoclones. La répression transcriptionelle de Klf4, d’environ un facteur 2, favorise de manière significative l’expansion du compartiment clonogénique au sein des holoclones. Ce gain de fonction concerne à la fois les potentiels de croissance et de reconstruction épidermique des holoclones. Un aspect important de ce travail a concerné la recherche des réseaux moléculaires régulés par Klf4 dans les holoclones. Une analyse du transcriptome nous a permis de montrer que Klf4 participe au contrôle des mécanismes de cycle cellulaire et de différenciation. Klf4 interviendrait également dans la régulation des voies de signalisation TGF β/BMP et Wnt, connues pour exercer des rôles clés dans la biologie des cellules souches. Klf4 constituerait donc un censeur de l’activité du compartiment immature dans l’épiderme interfolliculaire. Il participerait aux mécanismes de régulation du cycle cellulaire et serait susceptible d’intervenir dans le contrôle de l’autorenouvellement du compartiment souche. / Stem cells present within the human interfollicular epidermis, which are defined as keratinocytes stem cells (KSC), ensure the homeostasis and renewal of the tissue throughout the whole individual life. These functions are related to their important self-renewal capacity. My PhD project was focused on the knowledge of the molecular effectors involved in the control of the balance between proliferation and quiescence in KSC. This scientific question was investigated in an in vitro model of KSC which were clonally derived and characterized as holoclones. Holoclones are controlled by mitogenic growth factors and also by antiproliferative signals. One of these regulators is the growth factor TGF β1 which plays an important role in the control of quiescence and cell proliferation within several adult stem cell systems. In the context of growth inhibition by TGF β1, I have studied the role of a downstream gene of the TGF β pathway, the transcription factor Klf4, whose role in adult stem cell biology remains unclear. In fact, Klf4 is mostly described for its involvement in the reprogramming process of somatic cells into iPS cells. The maintenance of holoclone sensitivity to cell growth inhibitors is a critical parameter of KSC normal physiology. Holoclones possess an extensive growth capacity, which is characteristic of KSC. Despite this high proliferation rate, holoclones are still responsive to the antiproliferative effect of TGF β1. These results allowed us to validate the use of holoclone as a relevant model of non-transformed KSC suitable for the characterization of the role of candidate stemness genes in KSC biology, such as Klf4. The holoclone model was exploited to perform a functional genomic approach to investigate the role of Klf4 in KSC. We have developed a shRNA-based gene knock-down method using lentiviral vectors to assess the impact of Klf4 down-modulation on holoclone functional properties. Our results show that Klf4 down modulation controls the expansion of the clonogenic compartment present within holoclone progeny. This gain-of-function, which is maintained at the long term level, leads to an increase in holoclone 3D epidermis reconstruction capacity. A major point of this project was to elucidate the molecular networks controlled by Klf4 in holoclones. Microarray data show that Klf4 regulates the expression of several genes related to pathways involved in the control of stem cell fate. In particular, we identified many transcripts related to TGF β/BMP and Wnt signallings. Interestingly, the majority of the modulated transcripts are involved in the regulation of cell cycle and in keratinocyte differentiation process. All together these results suggest a critical role Klf4 as a stemness censor of the most immature compartment activity. Klf4 is likely to be involved in cell cycle regulation of KSC compartment and in the control of KSC self-renewal process.

Au cours de la réparation cutanée, l’étape de réépithélialisation est essentielle car son objectif est de restaurer la fonction barrière de la peau. Elle consiste en une série d’étapes coordonnées où les kératinocytes migrent, prolifèrent et se différencient jusqu’à restauration complète de l’épiderme. Régulée de façon simultanée au niveau intracellulaire mais également extracellulaire, elle dépend de la production de facteurs de croissance, de métalloprotéases matricielles (MMPs) et de protéines de la matrice extracellulaire sur lesquelles les kératinocytes adhèrent et migrent par l’intermédiaire de récepteurs de la famille des intégrines ou des syndécans. Parmi les ligands matriciels, la laminine 332 (LN332), qui est connue comme étant la protéine d’adhésion majeure des kératinocytes de l’épiderme, s’avère être également impliquée au cours de la réépithélialisation et jouer un rôle important dans les processus d’adhésion et de migration des kératinocytes, notamment par le biais de son domaine globulaire LG4/5 localisé à l’extrémité C-term de sa chaine 3. De récentes études ont montré que ce domaine LG4/5 induit la migration des kératinocytes normaux humains (NHK), impliquant des MMPs pro-migratoires MMP-1 et MMP-9. Puisque les domaines LG4/5 ont été montrés comme participant à la dynamique du cytosquelette et au mouvement cellulaire par le biais des récepteurs syndécan-1 et -4, mon laboratoire d’accueil a décidé d’étudier l’implication du récepteur syndécan-1 dans ce processus d’expression de la MMP-9. Les analyses PCR et les résultats de zymographie obtenus ont révélé que le syndécan-1 joue un rôle dans l’expression et l’activation de la MMP-9 induite par le domaine LG4/5. De plus, la déplétion de l’expression du syndécan-1 dans les NHK a confirmé ces résultats. De précédents résultats de mon laboratoire d’accueil ont montré que le domaine LG4/5 induit la formation de filopodes médiée par le syndécan-1 au niveau du front de migration des kératinocytes. De ce fait, nous avons effectué des zymographies de gélatine in situ chez des NHK en migration afin d’observer la localisation de la MMP-9 et de savoir si cette dernière était trouvée au niveau de ces structures d’adhésion protrusives. Nous avons observé des zones de digestion de gélatine sous les NHK ressemblant à des points de contact d’adhésion. Leur nombre est augmenté chez des NHK traités avec le domaine LG4/5 de la LN332. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des gélatinases et de la MMP-9 ont révélé que cette dernière est responsable de la formation de ces zones de digestion de gélatine. Parce que ces structures évoquent des podosomes, nous avons décidé de révéler leurs constituants majoritaires, à savoir la cortactine, la vinculine, l’-actinine, VASP, WASP ou encore Arp2/3. Dans le même temps nous avons également révélé le syndécan-1 afin de voir si ce dernier était présent dans ces structures. Nos résultats ont montré que tous les marqueurs des podosomes étaient localisés soit sous la forme d’un point à l’intérieur des zones de digestion pour les protéines régulatrices de l’actine, soit sous la forme d’un anneau entourant les zones de digestion pour les protéines d’adhésion et de signalisation associées à la membrane, confirmant donc que les structures observées sont bien des podosomes. Le syndécan-1 apparaît également sous une forme d’anneau, entourant les protéines régulatrices de l’actine et les zones de digestion laissant penser que le syndécan-1 serait impliqué dans ces structures. La diminution de l’expression du syndécan-1, en utilisant l’approche des petits ARN interférents dans des NHK, a montré que l’absence de syndécan-1 diminue de façon drastique le nombre et la surface des zones digérées. L’ensemble de nos résultats montre que le syndécan-1 serait un constituant des podosomes des kératinocytes, participant à leur formation et jouant un rôle dans le contrôle de l’expression de la MMP-9 / During skin repair, the reepithelialization step is essential to restore the skin barrier function. lt occurs by an orderly series of events whereby keratinocyte migrate, proliferate and differentiate until complete epidermal restoration. Keratinocyte migration determines the efficiency of the overall wound repair process. The keratinocyte's migratory behavior depends on the production of growth factors, matrix metalloproteinases (MMP) and on the dynamic interactions of the cells with extracellular components. Laminin 332 (LN332), known as a major adhesion substrate for keratinocytes, was shown to contribute to skin reepithelialization through its a3 chain C-terminal domains LG4/5. Recent studies have reported that LG4/5 induces keratinocyte migration, an event that relies on the involvement of the pro-migratory MMP-1 and MMP-9. As LG4/5 domains were shown to participate in cytoskeleton dynamic and cell movement through binding of the heparan sulfate proteoglycans syndecan-1 and -4, we analyzed the potential involvement of these receptors in this process. The PCR analysis and zymography results revealed that syndecan-1 plays a role in LG4/5 induced MMP-9 expression and activation. Down regulating or overexpressing syndecan-1 expression in cells confirmed these findings. As LG4/5 was shown to induce the formation of syndecan-1-mediated filopodia at the front of migrating cells, we performed in situ zymography experiments in migrating keratinocyte to analyze whether MMP-9 is found in these protrusive adhesion structures. Very interestingly, we found areas of digested gelatin resembling adhesion contacts underneath keratinocytes. Their number was increased in LG45-treated keratinocytes, a result in line with our previous data. The use of specific MMP inhibitors revealed that MMP-9 is responsible for the formation of these digested gelatin clusters. Further confocal microscope analysis revealed, at the cellular level, the presence of actin located within the digested areas, suggesting that an adhesion receptor would be involved in this process. Because these structures resemble podosomes, we revealed major podosome components, such as cortactin, vinculin, -actinin, VASP, WASP, Arp2/3 or dynamin and integrin. Our results showed all the podosome markers either within the digested areas (regulatory actin proteins) or organized as ring encircling the digested areas (signaling and adhesion proteins associated with plasma membrane), confirming that these structures are podosomes. Syndecan-1 also appears as a ring around the digested areas and encircling the regulatory actin proteins, suggesting that this receptor could be involved in these structures. The syndecan-1 depletion in normal human keratinocytes with specific siRNAs drastically decreased the digested areas surface. Taken together, our data demonstrate that syndecan-1 is a podosome components, participating in their formation and playing a role in MMP-9 expression and deposition. These results suggest that its re-distribution at the front edge of migrating keratinocyte may have a role to play in the cleavage or degradation of extracellular matrix proteins therefore facilitating their path through the fibrin clot

Les microARNs sont de petits ARN non codants régulant négativement l'expression génique au niveau post-transcriptionnel. Ils interviennent dans de nombreux processus biologiques et leur rôle dans la régulation de l'homéostasie cutanée est clairement démontrée. Cependant, leur fonction durant le vieillissement épidermique n'a jamais été étudiée. Nous avons donc réalisé une analyse exhaustive du miRnome épidermique durant son vieillissement afin d'identifier les microARNs différentiellement exprimés avec l'âge dans ce tissu. Plusieurs microARNs significativement modulés dans des kératinocytes âgés, nous ont permis d'établir une signature du vieillissement épidermique. Parmi eux, les deux brins du microARN miR-30a sont induits dans les épidermes âgés. La construction d'un lentivirus permettant la surexpression stable et inductible de ce microARN a facilité son étude fonctionnelle dans un modèle organotypique d'épiderme reconstruit. Nous avons observé que la surexpression de ce microARN dans un modèle de culture tridimensionnelle induit un phénotype épidermique présentant des similitudes avec celui observé durant son vieillissement chronologique et caractérisé par une forte altération de la différenciation des kératinocytes, par une perturbation de sa fonction barrière et par une augmentation de l'abondance des cellules apoptotiques. Ce projet de thèse a permis l'identification de 3 cibles directes de miR-30a dans les kératinocytes. Il s'agit de LOX, codant pour la lysyl oxydase qui intervient dans la balance prolifération/différenciation des kératinocytes, d'AVEN, un inhibiteur de caspase et d'IDH1, codant pour l'isocitrate déshydrogénase, enzyme du métabolisme énergétique. Ainsi, ce projet de thèse a révélé un nouveau microARN acteur du vieillissement épidermique et a permis de de mettre à jour de nouveaux mécanismes moléculaires expliquant certaines altérations phénotypiques observées dans l'épiderme avec l'âge / MicroRNAs are small non-coding RNA that negatively regulate gene expression at the post-transcriptional level. There are involved in many biological processes and play a key role in the regulation of skin homeostasis. However, their function during epidermal aging has never been studied. We performed an exhaustive analysis of the epidermal miRnome during its aging in order to identify microRNAs differentially expressed with age in this tissue. Several microRNAs significantly modulated in elderly keratinocytes, allowed us to establish a signature of epidermal aging. Among them, the two strands of the microRNA miR-30a are induced in aged epidermis. The construction of a lentivirus allowing inducible and stable overexpression of this microRNA facilitated its functional study in an organotypic model of reconstructed epidermis. We observed that the overexpression of this microRNA in a three-dimensional culture model induces an epidermal phenotype similar of those observed during its chronological aging characterized by a strong alteration of keratinocyte differentiation, by a disturbance of its barrier function and by an increase in the abundance of apoptotic cells. This thesis project allowed the identification of three miR-30a targets in keratinocytes : LOX encoding lysyl oxidase, which plays a role in proliferation/differentiation balance of keratinocytes, AVEN encoding a caspase inhibitor and IDH1 encoding isocitrate deshydrogenase, a key enzyme of cellular metabolism.Our work revealed a new miRNA actor and deciphered new molecular mechanisms to explain some alterations observed in epidermis during aging, especially those concerning keratinocytes differentiation and apoptotic death

Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la guérison est fréquemment problématique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le développement d’un tissu de granulation exubérant ou « bouton de chair », qui mène à une cicatrisation excessive due à la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non épithélialisé, est caractérisé par une occlusion au niveau de la microcirculation due à l’hypertrophie des cellules endothéliales, qui laisse supposer la présence d’hypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prédisposées au développement de tissu de granulation exubérant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une étude thermographique a révélé un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau moléculaire, la littérature rapporte que le facteur de transcription «hypoxia inducible factor» (HIF) est à l’origine de plusieurs changements dans les niveaux d’expression de divers gènes régulés par l’hypoxie. L’objectif du présent projet de recherche était de définir la contribution de l’hypoxie à la guérison cutanée chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait à mesurer l’expression protéique temporelle du HIF1A dans des échantillons tissulaires en provenance de plaies cutanées guérissant normalement et d’autres développant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les résultats obtenus suggèrent que la mesure de HIF1A, dans les échantillons pluricellulaires de cette étude, reflète l’épithélialisation de la plaie plutôt que les niveaux d’oxygène tissulaire. En effet, le HIF1A semble réguler l’homéostasie et la prolifération des kératinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques équins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou d’hypoxie (à 1% d’O2 ou à l’aide d’un mimétique, le CoCl2) afin d’en étudier le comportement (capacités de prolifération et de synthèse protéique). Les résultats obtenus soutiennent une contribution de l’hypoxie à la cicatrisation extensive chez le cheval puisque l’hypoxie favorise la prolifération des fibroblastes en plus d’encourager la synthèse de collagène de type 1 et de diminuer la synthèse de la métalloprotéinase de type 2. Les changements observés semblent dépendre de facteurs extrinsèques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de façon similaire indépendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de l’étude ont permis d’élucider une part des mécanismes sous-jacents à la formation du tissu de granulation exubérant lors de guérison cutanée chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mènera à une meilleure compréhension de la pathologie et ainsi, permettra de développer des méthodes de traitement spécifiques à la condition. / The horse is often victim of traumatic wounds for which healing can be problematic, mainly when the wound occurs on the limb. The development of exuberant granulation tissue, also known clinically as “proud flesh”, leads to extensive scarring characterized by overproduction of fibrous tissue and the absence of an epithelial cover. This scar tissue suffers from occlusion of the microcirculation within the residual granulation tissue, due to endothelial cell hypertrophy, suggesting tissue hypoxia. The presence of relative hypoxia in limb wounds of horses was recently confirmed using near infrared spectroscopy. Additionally, thermography showed decreased perfusion in limb wounds. Abundant literature incriminates "hypoxia inducible factor” (HIF) in the regulation of expression of a number of genes in response to hypoxia. The overall objective of this research project was to define the contribution of hypoxia to problematic wound healing in horses. The first phase of the project (in vivo) aimed to measure the temporal expression of HIF1A protein in tissue samples taken from skin wounds healing normally and others developing exuberant granulation tissue and subsequent extensive scarring, according to various anatomical sites (trunk, limb). Results suggest that the expression of HIF1A within the pluricellular tissue samples of this study reflects wound epithelialization rather than tissue oxygen levels. Indeed, HIF1A appears to regulate the homeostasis and proliferation of skin keratinocytes. The second phase of the project (in vitro) consisted in the culture of equine dermal fibroblasts from the body or the limb, under conditions of normoxia or hypoxia (1% O2 or using a mimetic, CoCl2) in an effort to study their behavior (proliferation and protein synthesis). Results corroborate the contribution of hypoxia to over-scarring in the horse since hypoxia promotes both the proliferation of dermal fibroblasts and the synthesis of collagen type 1 while decreasing the synthesis of matrix metalloproteinase 2. Extrinsic factors (environmental) appear to govern the behavior of equine dermal fibroblasts since these cells behave similarly regardless of their anatomic origin (body or limb). In summary, the two phases of the study contributed to the elucidation of a portion of the mechanisms underlying the development of exuberant granulation tissue during wound healing in horses. Further research in this area will provide a better understanding of the pathology and thus aid in the design and development of targeted therapies.

Le cheval est souvent victime de plaies traumatiques, dont la guérison est fréquemment problématique, et ce, principalement quand la plaie survient sur le membre. Il est courant de voir chez le cheval le développement d’un tissu de granulation exubérant ou « bouton de chair », qui mène à une cicatrisation excessive due à la surproduction de tissu fibreux. Ce tissu cicatriciel, non épithélialisé, est caractérisé par une occlusion au niveau de la microcirculation due à l’hypertrophie des cellules endothéliales, qui laisse supposer la présence d’hypoxie tissulaire. Une hypoxie relative a effectivement été mesurée par spectroscopie dans le proche infrarouge au niveau des plaies appendiculaires prédisposées au développement de tissu de granulation exubérant, par rapport aux plaies corporelles. De plus, une étude thermographique a révélé un patron spatial similaire de la perfusion. Au niveau moléculaire, la littérature rapporte que le facteur de transcription «hypoxia inducible factor» (HIF) est à l’origine de plusieurs changements dans les niveaux d’expression de divers gènes régulés par l’hypoxie. L’objectif du présent projet de recherche était de définir la contribution de l’hypoxie à la guérison cutanée chez le cheval. Le premier volet (in vivo) du projet visait à mesurer l’expression protéique temporelle du HIF1A dans des échantillons tissulaires en provenance de plaies cutanées guérissant normalement et d’autres développant une cicatrisation excessive, selon divers sites anatomiques (tronc, membre). Les résultats obtenus suggèrent que la mesure de HIF1A, dans les échantillons pluricellulaires de cette étude, reflète l’épithélialisation de la plaie plutôt que les niveaux d’oxygène tissulaire. En effet, le HIF1A semble réguler l’homéostasie et la prolifération des kératinocytes. Le second volet (in vitro), consistait en la mise en culture de fibroblastes dermiques équins provenant du tronc ou du membre, en condition de normoxie ou d’hypoxie (à 1% d’O2 ou à l’aide d’un mimétique, le CoCl2) afin d’en étudier le comportement (capacités de prolifération et de synthèse protéique). Les résultats obtenus soutiennent une contribution de l’hypoxie à la cicatrisation extensive chez le cheval puisque l’hypoxie favorise la prolifération des fibroblastes en plus d’encourager la synthèse de collagène de type 1 et de diminuer la synthèse de la métalloprotéinase de type 2. Les changements observés semblent dépendre de facteurs extrinsèques (environnementaux) car les fibroblastes dermiques se comportent de façon similaire indépendamment de la provenance anatomique. En somme, les deux volets de l’étude ont permis d’élucider une part des mécanismes sous-jacents à la formation du tissu de granulation exubérant lors de guérison cutanée chez le cheval. La poursuite des recherches dans ce domaine mènera à une meilleure compréhension de la pathologie et ainsi, permettra de développer des méthodes de traitement spécifiques à la condition. / The horse is often victim of traumatic wounds for which healing can be problematic, mainly when the wound occurs on the limb. The development of exuberant granulation tissue, also known clinically as “proud flesh”, leads to extensive scarring characterized by overproduction of fibrous tissue and the absence of an epithelial cover. This scar tissue suffers from occlusion of the microcirculation within the residual granulation tissue, due to endothelial cell hypertrophy, suggesting tissue hypoxia. The presence of relative hypoxia in limb wounds of horses was recently confirmed using near infrared spectroscopy. Additionally, thermography showed decreased perfusion in limb wounds. Abundant literature incriminates "hypoxia inducible factor” (HIF) in the regulation of expression of a number of genes in response to hypoxia. The overall objective of this research project was to define the contribution of hypoxia to problematic wound healing in horses. The first phase of the project (in vivo) aimed to measure the temporal expression of HIF1A protein in tissue samples taken from skin wounds healing normally and others developing exuberant granulation tissue and subsequent extensive scarring, according to various anatomical sites (trunk, limb). Results suggest that the expression of HIF1A within the pluricellular tissue samples of this study reflects wound epithelialization rather than tissue oxygen levels. Indeed, HIF1A appears to regulate the homeostasis and proliferation of skin keratinocytes. The second phase of the project (in vitro) consisted in the culture of equine dermal fibroblasts from the body or the limb, under conditions of normoxia or hypoxia (1% O2 or using a mimetic, CoCl2) in an effort to study their behavior (proliferation and protein synthesis). Results corroborate the contribution of hypoxia to over-scarring in the horse since hypoxia promotes both the proliferation of dermal fibroblasts and the synthesis of collagen type 1 while decreasing the synthesis of matrix metalloproteinase 2. Extrinsic factors (environmental) appear to govern the behavior of equine dermal fibroblasts since these cells behave similarly regardless of their anatomic origin (body or limb). In summary, the two phases of the study contributed to the elucidation of a portion of the mechanisms underlying the development of exuberant granulation tissue during wound healing in horses. Further research in this area will provide a better understanding of the pathology and thus aid in the design and development of targeted therapies.

Les HAP sont des polluants ubiquitaires de l'environnement. Certains d'entre eux, comme le benzo[a]pyrène (B[a]P) sont cancérigènes pour l'homme. Il est donc primordial d'évaluer l'exposition des individus au B[a]P. Pour cela, la mesure des adduits de l'ADN est d'un intérêt majeur puisqu'elle permet de quantifier la dose génotoxique. Deux voies métaboliques du B[a]P conduisent à la formation de divers adduits de l'ADN. Afin de définir de nouveaux biomarqueurs d'exposition, nous avons cherché à identifier la nature chimique des adduits majoritairement formés dans des modèles cellulaires de kératinocytes et d'hépatocytes humains exposés au B[a]P. Pour cela, une méthode analytique par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en mode tandem a été mise au point pour permettre le dosage spécifique de sept adduits, avec une limite de détection de l'ordre de 1 adduit/108 nucléosides normaux. Les adduits majoritaires sont les adduits stables du diol-époxyde du B[a]P (BPDE), et les cinétiques de formation et de réparation sont différentes entre les deux types cellulaires. Chez l'homme, la méthode analytique développée ne nous a pas permis de mettre en évidence ces adduits que ce soit dans l'urine de sujets exposés professionnellement aux HAP ou dans l'ADN lymphocytaire de sujets fumeurs. De plus les nucléosides oxydés dans l'urine s'avèrent ne pas être de bons biomarqueurs d'effet des HAP. Les adduits stables du BPDE apparaissent donc comme des biomarqueurs pertinents de l'exposition au B[a]P, mais il est nécessaire d'améliorer la limite de détection de notre méthode pour permettre leur dosage chez l'homme.

La combretastatine A-4 (CA-4), produit naturel isolé d’un arbuste d’Afrique du sud (Combretum caffrum K.), a montré des propriétés antitumorales intéressantes. Grâce à sa capacité à empêcher la polymérisation de la tubuline, ce stilbénoïde possède des propriétés cytostatiques sélectives à l’égard de différentes lignées cellulaires cancéreuses. Certains dérivés hydrosolubles de la CA-4 comme la CA-4P (fosbretabuline) et le composé AVE8062 (ombrabuline) sont actuellement en essais cliniques pour le traitement de différents cancers. Trois séries de dérivés de la CA-4 ont été synthétisées : les Z-stilbènes, les 1,2- diaryl-1,2-éthanediones et les 5,6-diaryl-2,3-dihydropyrazines. Dans ces composés, le cycle B est remplacé par divers hétérocycliques (indole, benzofurane, benzothiophène, thiophène) attachés à la position C2. Ces dérivés ont été évalués pour leur capacité à inhiber l'assemblage de la tubuline. Le produit Z-stilbènes portant un noyau benzo[b]thiophène a montré une activité antitubuline comparable à celle de la colchicine et de la deoxypodophyllotoxine. L’effet sur l'organisation intracellulaire des microtubules et les propriétés antimitotiques de ce composé ont été ensuite testés sur les lignées cellulaires de kératinocytes SKv-a et HaCaT. Enfin, des essais préliminaires de vectorisation de ce composé dans des nanoparticules lipidiques solides (SLN) ont été réalisés / Combretastatin A-4 (CA-4), a natural product first isolated from the South African bush willow tree (Combretum caffrum K.), possesses interesting antitumor properties. Due to its capacity to inhibit tubulin polymerization, this stilbenoid shows selective cytostatic activities against various cancer cell lines. Some water-soluble CA-4 derivatives such as CA-4P (fosbretabuline) and AVE8062 (ombrabuline) are currently undergoing clinical trials for the treatment of various cancers. Three series of CA-4 analogues, Z-stilbenes, 1,2-diaryl-1,2-ethanediones and 5,6-diaryl-2,3-dihydropyrazines, were synthesized. In these compounds, the B ring is replaced by various heterocycles (indole, benzofurane, benzothiophene or thiophene) attached at the C2 position. These derivatives were evaluated for their ability to inhibit tubulin assembly. Compound Z- stilbenes bearing a benzo[b]thiophene ring showed an antitubulin activity comparable to that of colchicine and deoxypodophyllotoxine. Its effect on the intracellular organization of microtubules and antimitotic properties were then tested on two keratinocyte cell lines HaCaT and SKV-a. Finally, preliminary essays to the vectorization of this compound in solid lipid nanoparticles (SLN) were carried out