O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma técnica de nested-PCR para a detecção de ADN do vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) utilizando primers que amplificam uma região do gene que codifica a glicoproteína E viral. A técnica padronizada amplificou amostras isoladas e de campo, mostrando alta sensibilidade e especificidade tomando o isolamento em ovos embrionados SPF como técnica de referência. O seqüenciamento de uma amostra positiva por nested-PCR confirmou a identidade do produto amplificado. Foram submetidas a nested-PCR padronizada amostras de traquéia, pulmão e conjuntiva de 51 granjas de poedeiras comerciais procedentes da região de Bastos, Estado de São Paulo, que apresentou um surto caracterizado por sinais respiratórios, queda na produção de ovos e aumento da mortalidade. Vinte e três granjas foram positivas a nested-PCR e vinte e duas amostras foram isoladas. Considerando os resultados das duas técnicas, vinte e quatro granjas resultaram positivas. Não foram detectados os vírus das doenças de Newcastle, pneumovirose aviaria, nem Mycoplasma gallisepticum. O vírus da bronquite infecciosa das galinhas foi detectado em uma granja, e Mycoplasma synoviae em oito. A alta freqüência de ocorrência do VLTI, a alta concordância entre o quadro clínico observado e detecção do VLTI e o resultados do diagnóstico diferencial demonstram que o VLTI foi o agente etiológico causador de um surto de doença respiratória observado na região de Bastos, Estado de São Paulo. / The present work describes the development of a nested-PCR technique for the detection of Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) DNA using primers to amplify a region that encodes the glycoprotein E. The standardized technique amplified isolated and from clinical strains, offering high sensitivity and specificity, using the isolation in SPF chicken embryos such as reference test. The identity of the amplified product of the nested-PCR was confirmed by DNA sequencing. Trachea, lung and conjunctiva samples from fifty-one commercial layer farms from Bastos region, São Paulo State, which showed an outbreak characterized by respiratory signs, decreased egg production and increased mortality, were tested by the standardized nested-PCR. Twenty-three farms were positive by nested-PCR and samples of twenty-two farms were isolated. Twenty-four farms were positives when the results of both techniques were considered. Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Mycoplasma gallisepticum were not detected. Infectious bronchitis virus was detected in one farm and Mycoplasma synoviae was detected in eight farms. The high frequency of occurrence of ILTV, the high agreement between clinical signs observed and ILTV detection and the results of differential diagnosis demonstrate that ILTV was the etiological agent of an outbreak respiratory disease observed in Bastos region, São Paulo State.

O presente trabalho descreve o desenvolvimento de uma técnica de nested-PCR para a detecção de ADN do vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) utilizando primers que amplificam uma região do gene que codifica a glicoproteína E viral. A técnica padronizada amplificou amostras isoladas e de campo, mostrando alta sensibilidade e especificidade tomando o isolamento em ovos embrionados SPF como técnica de referência. O seqüenciamento de uma amostra positiva por nested-PCR confirmou a identidade do produto amplificado. Foram submetidas a nested-PCR padronizada amostras de traquéia, pulmão e conjuntiva de 51 granjas de poedeiras comerciais procedentes da região de Bastos, Estado de São Paulo, que apresentou um surto caracterizado por sinais respiratórios, queda na produção de ovos e aumento da mortalidade. Vinte e três granjas foram positivas a nested-PCR e vinte e duas amostras foram isoladas. Considerando os resultados das duas técnicas, vinte e quatro granjas resultaram positivas. Não foram detectados os vírus das doenças de Newcastle, pneumovirose aviaria, nem Mycoplasma gallisepticum. O vírus da bronquite infecciosa das galinhas foi detectado em uma granja, e Mycoplasma synoviae em oito. A alta freqüência de ocorrência do VLTI, a alta concordância entre o quadro clínico observado e detecção do VLTI e o resultados do diagnóstico diferencial demonstram que o VLTI foi o agente etiológico causador de um surto de doença respiratória observado na região de Bastos, Estado de São Paulo. / The present work describes the development of a nested-PCR technique for the detection of Infectious laryngotracheitis virus (ILTV) DNA using primers to amplify a region that encodes the glycoprotein E. The standardized technique amplified isolated and from clinical strains, offering high sensitivity and specificity, using the isolation in SPF chicken embryos such as reference test. The identity of the amplified product of the nested-PCR was confirmed by DNA sequencing. Trachea, lung and conjunctiva samples from fifty-one commercial layer farms from Bastos region, São Paulo State, which showed an outbreak characterized by respiratory signs, decreased egg production and increased mortality, were tested by the standardized nested-PCR. Twenty-three farms were positive by nested-PCR and samples of twenty-two farms were isolated. Twenty-four farms were positives when the results of both techniques were considered. Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Mycoplasma gallisepticum were not detected. Infectious bronchitis virus was detected in one farm and Mycoplasma synoviae was detected in eight farms. The high frequency of occurrence of ILTV, the high agreement between clinical signs observed and ILTV detection and the results of differential diagnosis demonstrate that ILTV was the etiological agent of an outbreak respiratory disease observed in Bastos region, São Paulo State.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de frango. Doenças respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à condenação de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. Dentre estes problemas, o vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) tem adquirido grande importância nos últimos anos, devido a surtos da doença clínica, como em Bastos (SP) em 2002. Mais recentemente, VLTI vem sendo isolado de galinhas e perus das regiões Sudeste-Sul do Brasil. Dando continuidade aos trabalhos desenvolvidos no laboratório, um isolado de peru foi inoculado experimentalmente em galinhas e perus susceptíveis reproduzindo a doença de forma branda em ambas as espécies. Também foram testados diferentes cultivos celulares de linhagem CER, CEC-32, HD11, Vero e um primário de embrião de galinha para a efetiva replicação do ILTV, com o propósito de aumentar o título viral e a qualidade do DNA viral extraído. O cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha foi o cultivo mais eficiente na replicação do ILTV dentre todos os estudados. Isolados de perus e galinhas foram seqüenciados a partir das regiões genômicas da timidina kinase e glicoproteína C, e alinhados com uma cepa vacinal e amostras de referência, obtidas no GenBank, demonstrando alta similaridade entre as amostras, sugerindo uma origem comum recente. Com o propósito de desenvolvimento de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o objetivo de atenuar a virulência do ILTV, foi concluído um cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da glicoproteína E e um gene marcador EGFP. / Actually, Brazil is the second major poultry producer and exporting country. Respiratory diseases comprising the most important sanitary problems that leads to condemnation of many poultry carcass and productivity losses. Between these problems, the laryngotracheitis virus (ILTV) is displaying great importance following by outbreaks of the disease, such as that occured in Bastos (SP), 2002, Brazil. Epidemiological studies showed the presence of antibodies from avian flocks and the existence of carrier birds without clear clinical signs. More recently, the ILTV has been isolated from chicken and turkeys of the southest-south of Brazil. Continuing the works at laboratory, a turkey isolate was inoculated experimentally in susceptible chicken and turkeys and the reproducible of a mild disease was displayed in both species. Also, different line cell cultures CER, CEC-32, HD11, Vero and a primary fibroblast cell culture were tested for the effective propagation of ILTV with the propose to get greatest titers and the quality of viral DNA extracted. The primary fibroblast cell culture was the most efficient to replicate ILTV. Turkey and chicken isolates was sequenced from de regions of thymidine kinase and glycoprotein C and were alignment with a vaccine strain and reference strains (GenBank) displaying high homology between them, suggesting a common origin. A cloning cassette containing the regions flanking glycoprotein E and a marker gene EGFP was constructed with the purpose to develop a recombinant with deletion of the glycoprotein E.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de frango. Doenças respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à condenação de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. Dentre estes problemas, o vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) tem adquirido grande importância nos últimos anos, devido a surtos da doença clínica, como em Bastos (SP) em 2002. Mais recentemente, VLTI vem sendo isolado de galinhas e perus das regiões Sudeste-Sul do Brasil. Dando continuidade aos trabalhos desenvolvidos no laboratório, um isolado de peru foi inoculado experimentalmente em galinhas e perus susceptíveis reproduzindo a doença de forma branda em ambas as espécies. Também foram testados diferentes cultivos celulares de linhagem CER, CEC-32, HD11, Vero e um primário de embrião de galinha para a efetiva replicação do ILTV, com o propósito de aumentar o título viral e a qualidade do DNA viral extraído. O cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha foi o cultivo mais eficiente na replicação do ILTV dentre todos os estudados. Isolados de perus e galinhas foram seqüenciados a partir das regiões genômicas da timidina kinase e glicoproteína C, e alinhados com uma cepa vacinal e amostras de referência, obtidas no GenBank, demonstrando alta similaridade entre as amostras, sugerindo uma origem comum recente. Com o propósito de desenvolvimento de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o objetivo de atenuar a virulência do ILTV, foi concluído um cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da glicoproteína E e um gene marcador EGFP. / Actually, Brazil is the second major poultry producer and exporting country. Respiratory diseases comprising the most important sanitary problems that leads to condemnation of many poultry carcass and productivity losses. Between these problems, the laryngotracheitis virus (ILTV) is displaying great importance following by outbreaks of the disease, such as that occured in Bastos (SP), 2002, Brazil. Epidemiological studies showed the presence of antibodies from avian flocks and the existence of carrier birds without clear clinical signs. More recently, the ILTV has been isolated from chicken and turkeys of the southest-south of Brazil. Continuing the works at laboratory, a turkey isolate was inoculated experimentally in susceptible chicken and turkeys and the reproducible of a mild disease was displayed in both species. Also, different line cell cultures CER, CEC-32, HD11, Vero and a primary fibroblast cell culture were tested for the effective propagation of ILTV with the propose to get greatest titers and the quality of viral DNA extracted. The primary fibroblast cell culture was the most efficient to replicate ILTV. Turkey and chicken isolates was sequenced from de regions of thymidine kinase and glycoprotein C and were alignment with a vaccine strain and reference strains (GenBank) displaying high homology between them, suggesting a common origin. A cloning cassette containing the regions flanking glycoprotein E and a marker gene EGFP was constructed with the purpose to develop a recombinant with deletion of the glycoprotein E.

Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor e exportador mundial de frango. Doenças respiratórias compreendem o principal problema sanitário e levam à condenação de um grande número de carcaças, além de perdas na produtividade. Dentre estes problemas, o vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) tem adquirido grande importância nos últimos anos, devido a surtos da doença clínica, como em Bastos (SP) em 2002. Mais recentemente, VLTI vem sendo isolado de galinhas e perus das regiões Sudeste-Sul do Brasil. Dando continuidade aos trabalhos desenvolvidos no laboratório, um isolado de peru foi inoculado experimentalmente em galinhas e perus susceptíveis reproduzindo a doença de forma branda em ambas as espécies. Também foram testados diferentes cultivos celulares de linhagem CER, CEC-32, HD11, Vero e um primário de embrião de galinha para a efetiva replicação do ILTV, com o propósito de aumentar o título viral e a qualidade do DNA viral extraído. O cultivo primário de fibroblasto de embrião de galinha foi o cultivo mais eficiente na replicação do ILTV dentre todos os estudados. Isolados de perus e galinhas foram seqüenciados a partir das regiões genômicas da timidina kinase e glicoproteína C, e alinhados com uma cepa vacinal e amostras de referência, obtidas no GenBank, demonstrando alta similaridade entre as amostras, sugerindo uma origem comum recente. Com o propósito de desenvolvimento de um recombinante com deleção da glicoproteína E, com o objetivo de atenuar a virulência do ILTV, foi concluído um cassete de clonagem contendo as regiões flanqueadoras da glicoproteína E e um gene marcador EGFP. / Actually, Brazil is the second major poultry producer and exporting country. Respiratory diseases comprising the most important sanitary problems that leads to condemnation of many poultry carcass and productivity losses. Between these problems, the laryngotracheitis virus (ILTV) is displaying great importance following by outbreaks of the disease, such as that occured in Bastos (SP), 2002, Brazil. Epidemiological studies showed the presence of antibodies from avian flocks and the existence of carrier birds without clear clinical signs. More recently, the ILTV has been isolated from chicken and turkeys of the southest-south of Brazil. Continuing the works at laboratory, a turkey isolate was inoculated experimentally in susceptible chicken and turkeys and the reproducible of a mild disease was displayed in both species. Also, different line cell cultures CER, CEC-32, HD11, Vero and a primary fibroblast cell culture were tested for the effective propagation of ILTV with the propose to get greatest titers and the quality of viral DNA extracted. The primary fibroblast cell culture was the most efficient to replicate ILTV. Turkey and chicken isolates was sequenced from de regions of thymidine kinase and glycoprotein C and were alignment with a vaccine strain and reference strains (GenBank) displaying high homology between them, suggesting a common origin. A cloning cassette containing the regions flanking glycoprotein E and a marker gene EGFP was constructed with the purpose to develop a recombinant with deletion of the glycoprotein E.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-10Bitstream added on 2014-06-13T20:44:09Z : No. of bitstreams: 1 buchala_fg_dr_jabo.pdf: 2239800 bytes, checksum: 45318e9bad370d2fed0afb87b5d25d4f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A suspeita de Laringotraqueíte Infecciosa Aviária (LTI) em galinhas de postura de ovos comerciais da região de Bastos, Estado de São Paulo, foi notificada em 27/12/2002 ao Serviço de Defesa Sanitária Animal. A Coordenadoria de Defesa Agropecuária instituiu um programa de saúde animal para o controle da doença, com base no planejamento de fases que foram implantadas durante o seu desenvolvimento e amparadas por instrumentos legais especificamente elaborados para esta finalidade. A Portaria CDA no 2, de 10 de janeiro de 2003, proibiu o trânsito interestadual de aves de descarte da região e deu início à fase preparatória. A Resolução SAA no 27, de 30 de setembro de 2003, caracterizou a fase de execução com a delimitação da área infectada, denominada “Bolsão” de Bastos. A Portaria CDA no 4, de 20 de janeiro de 2004, estabeleceu um programa compulsório de vacinação contra a LTI. A partir de junho de 2004, nenhum novo caso de LTI foi observado no “Bolsão”. A Resolução SAA no 43, de 17 de novembro de 2005, declarou a LTI controlada com vacinação, dando início à fase de consolidação das medidas de profilaxia implantadas. Com a Resolução SAA no 55, de 20 de dezembro de 2006, e a Portaria CDA no 58, de 29 de dezembro de 2006, o programa evoluiu para a fase de manutenção. Todas as fases foram complementadas por medidas de biosseguridade implantadas pelos avicultores. / A suspect of Avian Infectious Laryngotracheitis (ILT) in layer hens from Bastos region, São Paulo State, was communicated on December 27, 2002, to the Official Service of Animal Health. The Coordenadoria de Defesa Agropecuária (CDA) instituted an animal health program for the control of the disease, based on the planning of phases established during the development of the program and supported by legal instruments especially developed for this aim. The Portaria CDA Nº 2 on January 10, 2003 forbade interstate traffic of adult layer poultry from the region and started the preparatory phase. The Resolução SAA no 27 on September 30, 2003, characterized the execution phase by the delimitation of the infectious zone identified as “Bolsão” of Bastos. The Portaria CDA no 4 on January 20, 2004, established a compulsory program of vaccination against ILT. From the month of June, 2004, no new case was observed in the “Bolsão”. The Resolução SAA no 43 on November 17, 2005, declared the ILT controlled with vaccination, and started the phase of consolidation of the implanted prophylactic measures. From the Resolução SAA no 55 on December 20, 2006, and the Portaria CDA no 58 on December 29, 2006, the program evolved to the phase of maintenance. All the phases were complemented by biosecurity measures implanted by the owners of the layer hens.

Este estudo teve como objetivo detectar e caracterizar molecularmente isolados de campo do vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) detectados de aves comerciais com e sem sintomatologia da doença de diferentes regiões do Estado de São Paulo. O estudo incluiu amostras coletadas durante e após o primeiro surto epidêmico da laringotraqueíte infecciosa (LTI) no Brasil, região de Bastos, e de outras localidades durante o período de 2002-2008. A caracterização molecular foi realizada através da técnica de polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) de produtos da reação em cadeia pela polimerase (PCR) dos genes da glicoproteína E, G, proteína quinase (TK) e da proteína reguladora da transcrição (ICP4), assim como pela análise de seqüências dos genes TK e ICP4. Para seqüenciamento do gene ICP4 foram desenvolvidas duas reações de PCR que amplificam dois diferentes fragmentos do gene ICP4. As técnicas de PCR-RFLP e seqüenciamento de DNA mostraram resultados idênticos, diferenciando os isolados de campo das cepas vacinais de origem de cultivo celular (TCO) e de embrião de galinha (CEO). Os resultados mostraram que o surto clínico na região de Bastos foi causado por uma cepa não vacinal e de alta virulência (cepa Bastos), embora também tenha sido possível detectar dois isolados relacionados à cepa CEO circulando durante o surto. Verificou-se que a cepa causadora do surto severo na região de Bastos continua circulando na região apesar do uso de vacinas atenuadas. Além disso, foram isoladas amostras relacionadas às cepas CEO e à cepa Bastos apartir de granjas comerciais de poedeiras localizadas fora da região de Bastos e que estão envolvidas em quadros clínicos da doença. Este estudo mostra (1): a persistência do vírus selvagem de campo na região de Bastos (cepa Bastos) apesar das medidas de controle e do uso de vacinas atenuadas, (2): a disseminação da cepa Bastos e das cepas vacinais CEO para outras regiões, e (3): a eficacia da estratégia padronizada neste estudo para a caracterização e diferenciação de isolados de campo e de cepas vacinais. / The objective of this study was the molecular detection and characterization of field isolates of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) detected from commercial chickens with and without clinical signs of the disease from regions of the São Paulo state. The study included samples collected during and after of the first epidemic infectious laryngotracheitis (ILT) outbreak in Brazil, Bastos region, and from other regions during 2002-2008. The molecular characterization was developed by restriction fragment length polymorphic analysis (RFLP) of polymerase chain reaction (PCR) products of glycoprotein E, G, thymidine kinase (TK) and regulatory protein of transcription (ICP4) gene, and by sequence analysis of TK and ICP4 gene. For ICP4 gene sequencing, two PCR assays have been developed for amplification of two different fragments of ICP4 gene. The PCR-RFLP and DNA sequencing techniques showed identical results, they could differentiate the field isolates from vaccine strains, tissue culture origin (TCO) and chicken embryo origin (CEO). The results showed that the severe outbreak in Bastos region was caused by a non-vaccine and virulent strain (Bastos strain); however it was possible to detect two isolates closely related to the CEO vaccine strain circulating during the outbreak. This study showed that the strain, which it caused the severe outbreak in Bastos region continue circulating in these region despite of the use of attenuate vaccines. In addition, the present research showed that isolates related to CEO and Bastos strains are circulating in commercial layer flocks located outside the Bastos region, and were involving in clinical cases of the disease. This study shows (1) the persistence of the wild field strain in Bastos region (Bastos strain) despite of the control measures and the use of attenuate vaccines, (2) the dissemination of the Bastos and CEO strains to other regions, and (3) the efficacy of the strategy standardized in this study to characterization and differentiation of field isolates and vaccine strain.

Este estudo teve como objetivo detectar e caracterizar molecularmente isolados de campo do vírus da laringotraqueíte infecciosa (VLTI) detectados de aves comerciais com e sem sintomatologia da doença de diferentes regiões do Estado de São Paulo. O estudo incluiu amostras coletadas durante e após o primeiro surto epidêmico da laringotraqueíte infecciosa (LTI) no Brasil, região de Bastos, e de outras localidades durante o período de 2002-2008. A caracterização molecular foi realizada através da técnica de polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) de produtos da reação em cadeia pela polimerase (PCR) dos genes da glicoproteína E, G, proteína quinase (TK) e da proteína reguladora da transcrição (ICP4), assim como pela análise de seqüências dos genes TK e ICP4. Para seqüenciamento do gene ICP4 foram desenvolvidas duas reações de PCR que amplificam dois diferentes fragmentos do gene ICP4. As técnicas de PCR-RFLP e seqüenciamento de DNA mostraram resultados idênticos, diferenciando os isolados de campo das cepas vacinais de origem de cultivo celular (TCO) e de embrião de galinha (CEO). Os resultados mostraram que o surto clínico na região de Bastos foi causado por uma cepa não vacinal e de alta virulência (cepa Bastos), embora também tenha sido possível detectar dois isolados relacionados à cepa CEO circulando durante o surto. Verificou-se que a cepa causadora do surto severo na região de Bastos continua circulando na região apesar do uso de vacinas atenuadas. Além disso, foram isoladas amostras relacionadas às cepas CEO e à cepa Bastos apartir de granjas comerciais de poedeiras localizadas fora da região de Bastos e que estão envolvidas em quadros clínicos da doença. Este estudo mostra (1): a persistência do vírus selvagem de campo na região de Bastos (cepa Bastos) apesar das medidas de controle e do uso de vacinas atenuadas, (2): a disseminação da cepa Bastos e das cepas vacinais CEO para outras regiões, e (3): a eficacia da estratégia padronizada neste estudo para a caracterização e diferenciação de isolados de campo e de cepas vacinais. / The objective of this study was the molecular detection and characterization of field isolates of infectious laryngotracheitis virus (ILTV) detected from commercial chickens with and without clinical signs of the disease from regions of the São Paulo state. The study included samples collected during and after of the first epidemic infectious laryngotracheitis (ILT) outbreak in Brazil, Bastos region, and from other regions during 2002-2008. The molecular characterization was developed by restriction fragment length polymorphic analysis (RFLP) of polymerase chain reaction (PCR) products of glycoprotein E, G, thymidine kinase (TK) and regulatory protein of transcription (ICP4) gene, and by sequence analysis of TK and ICP4 gene. For ICP4 gene sequencing, two PCR assays have been developed for amplification of two different fragments of ICP4 gene. The PCR-RFLP and DNA sequencing techniques showed identical results, they could differentiate the field isolates from vaccine strains, tissue culture origin (TCO) and chicken embryo origin (CEO). The results showed that the severe outbreak in Bastos region was caused by a non-vaccine and virulent strain (Bastos strain); however it was possible to detect two isolates closely related to the CEO vaccine strain circulating during the outbreak. This study showed that the strain, which it caused the severe outbreak in Bastos region continue circulating in these region despite of the use of attenuate vaccines. In addition, the present research showed that isolates related to CEO and Bastos strains are circulating in commercial layer flocks located outside the Bastos region, and were involving in clinical cases of the disease. This study shows (1) the persistence of the wild field strain in Bastos region (Bastos strain) despite of the control measures and the use of attenuate vaccines, (2) the dissemination of the Bastos and CEO strains to other regions, and (3) the efficacy of the strategy standardized in this study to characterization and differentiation of field isolates and vaccine strain.