Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Inibidores de protease são moléculas que têm a capacidade de controlar proteases por bloqueio da atividade catalítica. As proteases participam de importantes eventos fisiológicos tais como a digestão dos alimentos, coagulação sangüínea, e apoptose. A ação dos inibidores é essencial para garantir a homeostase. Artrópodes como insetos e aracnídeos são ricas fontes desses inibidores. O objetivo desse trabalho foi isolar inibidores de proteases presentes na hemolinfa da aranha Lasiodora sp. Hemolinfa foi coletada através de punção cardíaca na presença de anticoagulante. Após centrifugação (800g) o plasma foi separado e utilizado para a detecção de inibidor de tripsina, trombina, fator Xa e XIIa. Cromatografia de afinidade em tripsina-Sepharose resultou no inibidor purificado, porém sem atividade inibitória. Isolamento do inibidor de tripsina foi realizado por cromatografia em coluna de Sephadex G-100 e a preparação contendo atividade inibitória de tripsina foi denominada: inibidor de tripsina bruto. Cromatografia em Mono Q isolou a partir do inibidor de tripsina bruto, o inibidor de tripsina LPTI (do inglês Lasiodora plasma trypsin inhibitor) e uma proteína anticoagulante LPA (do inglês Lasiodora plasma anti-coagulant). Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de sulfato sódico de dodecila revelou massa molecular de 72 kDa para LPTI e LPA. Avaliação de atividade inibitória sobre proteases e do efeito na coagulação através de determinação do tempo de recalcificação, tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) revelou que LPTI não interfere na coagulação e LPA, sem atividade inibitória de tripsina, interfere no TTPA. De acordo com nosso conhecimento LPTI e LPA correspondem ao primeiro inibidor de tripsina e a primeira proteína anticoagulante isolados da hemolinfa de aranha. LPTI e LPA podem participar no mecanismo de coagulação da hemolinfa através do controle da produção da protease fenoloxidase, que dispara a cascata, e do controle da atividade de proteases da cascata de coagulação

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:09Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3133_1.pdf: 692705 bytes, checksum: c929f680ef1b8218746f406e8cd9cac5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os artrópodes se protegem das infecções através da imunidade inata, dividida em reações celular e humoral. As células do sangue de invertebrados, os hemócitos, são identificadas com base na morfologia, ultraestrutura e função fisiológica. Sendo a fagocitose de corpos estranhos, como microorganismos, uma das funções celulares desempenhadas pelos hemócitos durante a imunidade inata; enquanto que a defesa humoral geralmente envolve componentes liberados pelos hemócitos, incluindo os peptídeos antimicrobianos, proteases e inibidores de proteases. Os últimos desempenham um papel importante como moduladores de vários processos biológicos, em especial, a ativação da fenoloxidase e coagulação. A aranha brasileira Lasiodora sp, amplamente distribuída na Região Nordeste do Brasil, é conhecida pelo nome trivial de caranguejeira. Estes animais têm mais tempo de vida do que os outros artrópodes e esta longevidade pode ser atrubuída aos hemócitos e suas funções (imunidade inata). A maioria dos estudos de caracterização funcional e bioquímica de hemócitos de artrópodes foram realizados em insetos, com uma limitada literatura sobre outros grupos. O presente estudo relata, pela primeira vez, o isolamento e caracterização de inibidor de elastase de neutrófilos humanos presente nos hemócitos de Lasiodora sp (EILaH, do inglês Elastase Inhibitor of Lasiodora sp Hemocytes ) e a caracterização dos hemócitos quanto a morfologia e função fagocitária. EILaH foi purificado por cromatografia de afinidade em coluna de tripsina-sepharose seguida por cromatografia de fase reversa. Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de sulfato sódico de dodecila reveleou a massa molecular de 8 kDa e espectrometria de massa (MALDITOF) revelou a massa molecular de 8274 Da. A seqüência amino terminal determinada foi LPCP(F)PYQQELTC e a constante de inibição (Ki) para elastase de neutrófilos humanos foi 0,32 nM. Seis tipos celulares de hemócitos foram determinados e caracterizados quanto a presença de atividade fagocítica in vivo e in vitro. O estudo contribui para a caracterização inédita do gênero e para a elucidação do papel bioquímico de inibidores de proteases em hemócitos de aranhas