Neste trabalho foi empregada uma metodologia rápida e eficiente para a identificação de metabólitos fitotóxicos produzidos por microrganismos. O isolamento do composto bioativo foi guiado através de bioensaio com Lemna minor. A espectrometria de massas, em especial o LC-MS, foi utilizada para acelerar o processo de identificação do composto ativo. As bactérias estudadas eram simbióticas do fungo fitopatogênico Sclerotium rolfsii. Seus respectivos extratos orgânicos obtidos de culturas em meio BD (batata dextrose) foram submetidos ao ensaio de fitotoxicidade com Lemna minor. Entre cinco bactérias foi selecionada a bactéria Burkholderia sp, a qual apresentou maior atividade no ensaio de fitotoxicidade. O fracionamento por cromatografia em coluna de sílica propiciou a identificação de uma fração ativa. A fitotoxina foi caracterizada como sendo um macropentólido de 20 membros. O composto pertence à classe dos polihidroxibutiratos (PHBs). Sua estrutura foi determinada por RMN 1H, RMN 13C, HMQC, HMBC, IV, ESI-MS/MS e também por comparação com dados da literatura. Esse composto nunca foi isolado de fontes naturais. Foi descrito na literatura uma rota sintética para sua obtenção, porém esta é a primeira vez que sua atividade fitotóxica é relatada. Este trabalho mostra uma nova perspectiva para o emprego de PHBs de baixo peso molecular e apresenta uma proposta de estrutura de composto fitotóxico que pode servir de modelo para a síntese de novos herbicidas. / In this work a quick and efficient methodology was employed for the identification of phytotoxic metabolites produced by microorganisms. The isolation of the bioactive compound was guided by Lemna minor bioassay. Mass spectrometry, especially LC-MS, was used to accelerate the process of identification of the phytotoxin. All bacteria were symbiotic to the phytopatogenic fungi Sclerotium rolfsii.. The bacterium Burkholderia sp was selected among the five bacteria analyzed, due to its greater phytotoxic activity in the bioassay. The phytotoxin was characterized as a 20 member macropentolide. This compound belongs to the polyhidroxybutirates (PHBs) chemical class. Its structure was determined by NMR1H, NMR 13C, HMQC, HMBC, IV, ESI-MS/MS and HRMS. It has never been isolated from natural sources before. Although a synthetic route has been proposed in the literature this is the first time that its phytotoxic activity is reported. This work leads to a new perspective for the application of low molecular weight PHBs and propose a phytotoxic structure that can be used as a model for the synthesis of new herbicide class.

Alogliptina (ALG) é um hipoglicemiante oral, que inibe a enzima dipeptidil peptidase – 4 (DPP-4) com alta seletividade e aumenta a secreção de insulina prevenindo a hiperglicemia prandial. Como ALG não está descrita nas farmacopeias, este trabalho objetivou caracterizar a matéria-prima (Capítulo I), desenvolver métodos analíticos (Capítulo II) e avaliar sua estabilidade (Capítulo III), auxiliando no controle de qualidade. No capítulo I, a ALG foi caracterizada através de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) acoplada a espectrômetro de raios X por dispersão de energia (EDS). A compatibilidade entre a ALG e os excipientes presentes nos comprimidos foi avaliada por DSC, TGA, infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), difração de raios-X de pó (XRPD) e microscopia com estágio de aquecimento. ALG apresentou pureza próxima a 99%, com faixa de fusão entre 179,4 e 187,2 °C (pico em 183,3 °C), seguida por decomposição que iniciou em 198,0 °C. Na SEM/EDS, os cristais de ALG mostraram-se predominantemente irregulares e foram detectados traços de impurezas (chumbo e cobre). Alterações na temperatura de fusão da ALG com manitol, estearato de magnésio e nos comprimidos comerciais foram observadas. A microscopia com aquecimento demonstrou que a interação entre manitol e ALG e nos comprimidos é devida à solubilização do fármaco no excipiente fundido, enquanto que na mistura com o estearato de magnésio é devida à fusão do excipiente e do fármaco que ocorrem separadamente, onde o excipiente funde antes que o fármaco. FTIR e XRPD das misturas não detectaram incompatibilidades, somente o aparecimento de bandas adicionais relacionadas aos excipientes. ALG foi compatível com todos os excipientes testados. Estes resultados são importantes para caracterizar, conhecer a estabilidade e a compatibilidade do fármaco. No capítulo II, foram desenvolvidos e validados métodos de cromatografia líquida (LC) indicativos de estabilidade utilizando dois detectores, ultravioleta (UV) e detector de aerossol carregado (CAD) para análise de ALG em comprimidos. Foi utilizada uma coluna C8 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) em modo isocrático, fluxo de 0,8 mL min-1, utilizando acetonitrila e tampão acetato de amônio 10 mM pH 3,5 ajustado com ácido acético (90:10, v/v) como fase móvel e detecção no UV em 275 nm. Os métodos foram lineares no intervalo de 25 - 200 μg mL-1 em ambos os detectores. Os limites de detecção foram de 2,65 e 6,25 μg mL-1 e os de quantificação de 8,84 e 20,85 μg mL-1, respectivamente, para UV e CAD. Os métodos foram precisos e exatos, com desvio padrão relativo menor que 3% e percentuais de recuperação próximos a 100%. Nenhum dos excipientes, ou produtos de degradação interferiu na detecção do fármaco durante os estudos de especificidade. No ensaio de robustez, pequenas alterações no fluxo de fase móvel, pH e concentração de solvente orgânico não afetou significativamente os resultados. O doseamento dos comprimidos obtido com ambos detectores não mostrou diferenças entre si. Os métodos podem ser considerados intercambiáveis e podem ser aplicados como ferramentas para o controle de qualidade de rotina de comprimidos de ALG. No capítulo III foi avaliada a estabilidade térmica da ALG utilizando TGA isotérmica e não isotérmica, e degradação em estufa, analisando as amostras por LC-UV. Na TGA isotérmica a ALG foi submetida a 150, 155, 160, 165, 170 °C, até perda de massa de 10% e os dados foram analisados pelo método de Arrhenius. Na TGA não isotérmica variaram-se as razões de aquecimento, utilizando 2,5, 5,0, 10,0 e 15,0 °C/min até 500 °C. Os dados foram analisados pelo método de Ozawa e de Kissinger. Na degradação em estufa o fármaco foi submetido as temperaturas de 130, 140, 150, 155, 160 e 170 °C. Os parâmetros cinéticos foram obtidos por Arrhenius. ALG segue degradação de zero ordem, onde a velocidade de degradação independe da concentração do reagente. A perda de massa está relacionada à perda química. Os parâmetros cinéticos variaram de acordo com o modelo matemático aplicado. A energia de ativação variou de 26 a 45 kcal/mol. O fármaco degradado demonstrou ser menos tóxico em ensaio de citotoxicidade em células CRIB do que o fármaco não degradado. Os métodos desenvolvidos e a caracterização realizada mostram-se úteis para o adequado controle de qualidade do fármaco. / Alogliptin (ALG) is an oral hypoglycemic agent, which inhibits the enzyme dipeptidyl peptidase - 4 (DPP-4) with high selectivity and increase insulin secretion, preventing postprandial hyperglycemia. ALG is not described in any pharmacopeia. In this context, this study aimed to characterize the active pharmaceutical ingredient (Chapter I), to developed assay methods (Chapter II) and to evaluate the stability (Chapter III), assuring the adequate quality control. In Chapter I, ALG was characterized by differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TGA) and scanning electron microscopy (SEM) coupled with energy dispersive spectrometer X-ray (EDS). The compatibility between ALG and the excipients present in the commercial tablets was evaluated by DSC, TGA, Fourier transform infrared (FTIR), X-ray powder diffraction (XRPD) and hot stage microscopy. ALG presented purity close to 99%, with a melting range between 179.4 to 187.2 °C (peak at 183.33 °C), followed by decomposition which began at 198 °C. In the SEM/EDS the crystals of ALG were predominantly irregulars and it were detected traces of impurities (lead and copper). Alterations in melting temperature of ALG with mannitol, magnesium stearate and in tablets were observed. The hot stage microscopy showed that the interactions between mannitol and ALG and in the tablets were due to the solubilization of the drug in the fused excipient, and in the mixture with magnesium stearate, it was due to the melting of the drug and excipient separately, where the excipient started the melting prior of the drug. FTIR and XRPD of the mixtures did not detect incompatibilities, only the appearance of additional bands related to the excipients. ALG was compatible with all excipients tested. These results are important to characterize, to know the drug stability and compatibility. In Chapter II, liquid chromatography (LC) methods indicative of stability were developed and validated using two detectors, ultraviolet (UV) and charged aerosol detector (CAD) for ALG tablets. It was used a C8 column (250 mm x 4.6 mm, 5 um) in isocratic mode, flow rate of 0.8 ml min-1 using acetonitrile and ammonium acetate buffer 10 mM, pH 3.5 adjusted with acid acetic acid (90:10, v/v) as mobile phase and UV detection at 275 nm. The methods were linear in the range of 25 - 200 μg ml-1 in both detectors. Limits of detection were 2.65 and 6.25 μg mL-1, and of quantification were 8.84 and 20.85 μg mL-1, respectively, for UV and CAD. The methods were accurate and precise, with a relative standard deviation lower than 3% and recovery close to 100%. None of the excipients or degradation products showed interference in the drug detection during specificity studies. In the robustness test, small changes in the mobile phase flow, pH and organic solvent concentration did not significantly affect the results. The results for tablets obtained with both detectors showed no differences. The methods may be considered interchangeable, and they can be used as tools for routine quality control of ALG tablets. In Chapter III the thermal stability of the ALG was evaluated using isothermal and non-isothermal TGA, as well as oven, and samples were analyzed by LC-UV. In the isothermal TGA the ALG was subjected to 150, 155, 160, 165, 170 °C until a mass loss of 10% and the data were analyzed by the Arrhenius method. In non-isothermal TGA the heating rates were varied using 2.5, 5.0, 10.0 and 15.0 °C/min until 500 °C. Data were analyzed by the Ozawa and Kissinger method. In oven the drug was subjected to 130, 140, 150, 155, 160, and 170 °C. The kinetic parameters were obtained by Arrhenius. ALG follows zero-order degradation, where the rate of degradation is independent of the concentration of any reagent. Mass loss is related to chemical reactions. The kinetic parameters varied according to the applied mathematical model. The activation energy ranged from 26 to 45 kcal / mol. The degraded drug was shown to be less toxic in cytotoxicity assay using CRIB cells than the non-degraded drug. The methods developed and the characterization performed proved to be useful for adequate quality control tests of the drug.

Metabólitos secundários produzidos por Streptomyces com atividade antibiótica apresentam relevante importância biotecnológica para as indústrias farmacêuticas e agroquímicas. Dentre estes metabólitos, podemos destacar a nigericina, um antibiótico poliéter usado como aditivo em ração animal atuando como promotor de crescimento e no tratamento de algumas doenças, como a malária, em carcinoma nasofaríngeo, a vaccínia, entre outras. Neste trabalho foram avaliadas duas cepas de actinobactérias potenciais produtoras de nigericina, a EUCAL 26 e a EUCAL 74. As duas actinobatérias foram fermentadas em cinco meios de cultivo diferentes (BD, Czapek, ISP2, M29 e TSB). A cepa EUCAL 26 foi a mais promissora na produção de nigericina em meio Czapeck. A partir da EUCAL 26, foi feito um estudo da máxima produção de nigericina em meio Czapek variando o pH do meio, temperatura de fermentação, e período de fermentação. As melhores condições encontradas foram em pH 7,0 a 25 °C por 27 dias. Foi realizado também um estudo de otimização de aumento de escala de fermentação, de um volume de meio Czapeck de 50 mL, para um volume de 4 L. Também foram avaliados dois resíduos agroindustriais (Farmal e Melaço de Soja) para a produção de nigericina. O meio de Melaço de Soja aumento a produção em aproximadamente 300x quando comparado com o meio Czapeck padrão. Os efeitos dos nutrientes do meio Czapeck também foram avaliados. A retida do K2HPO4 do meio produziu um aumento de 50x na produção de nigericina, quando comparado com o meio Czapeck controle. Também foi avaliado o efeito da adição de -butirolactonas sintéticas, moléculas de sinalização hormonal, para a produção de nigericina. Das 15 -butirolactonas testadas, a DP21A foi a mais eficiente, pois além de aumentar a produção de nigericina em 23x, também diminui o período máximo de sua produção. Todas as analises realizadas neste trabalho para o monitoramento da produção de nigericina, foram feitas empregando a espectrometria de massas sequencial acoplada à cromatografia liquida de ultra eficiência. / Secondary metabolites produced by Streptomyces with antibiotic activity have significant biotechnological importance for the pharmaceutical and agrochemical industries. Among them, nigericin stands out as an antibiotic polyether used as growth promoter in animal feed and for treatment of some diseases such as malaria, nasopharyngeal carcinoma, and vaccinia. In this study, two actinobacteria strains considered potential producers of nigericin named EUCAL 26 and 74 were tested. The two actinobacteria were fermented in five different culture media (BD, Czapek, ISP2, M29 and TSB). EUCAL 26 strain was the most promising in producing nigericin in amid Czapeck media. For EUCAL 26, a study of maximum production of nigericin in Czapek medium at varying the pH, fermentation temperature and fermentation period have been performed. As a result, the best conditions were pH 7.0, at 25 °C for 27 days. In addition, an optimization study for scale-up fermentation have been done, where a volume of 50 mL Czapeck medium have been expanded to 4 L, in order to obtain the highest production of nigericin. Two agroindustrial residues (FARMAL and Honey Soy) have also been evaluated for nigericin production. The honey soy medium increased nigericin production in the rate of 300 when compared with standard Czapeck medium. The effects of nutrients from Czapeck medium have also been evaluated. Removal of K2HPO4 from culture medium resulted in an increase of 50 times when compared with the control Czapeck medium. The effect of adding synthetics -butyrolactones (hormone signaling molecules) for the production of nigericin have also been evaluated. From 15 tested -butyrolactones, DP21A was the most efficient. In addition to increase nigericin yield in 23x it also reduced the period for its maximum production. All analyzes performed in this study to monitor the nigericin production were performed using tandem mass spectrometry coupled to ultra high performance liquid chromatography.

Alogliptina (ALG) é um hipoglicemiante oral, que inibe a enzima dipeptidil peptidase – 4 (DPP-4) com alta seletividade e aumenta a secreção de insulina prevenindo a hiperglicemia prandial. Como ALG não está descrita nas farmacopeias, este trabalho objetivou caracterizar a matéria-prima (Capítulo I), desenvolver métodos analíticos (Capítulo II) e avaliar sua estabilidade (Capítulo III), auxiliando no controle de qualidade. No capítulo I, a ALG foi caracterizada através de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) acoplada a espectrômetro de raios X por dispersão de energia (EDS). A compatibilidade entre a ALG e os excipientes presentes nos comprimidos foi avaliada por DSC, TGA, infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), difração de raios-X de pó (XRPD) e microscopia com estágio de aquecimento. ALG apresentou pureza próxima a 99%, com faixa de fusão entre 179,4 e 187,2 °C (pico em 183,3 °C), seguida por decomposição que iniciou em 198,0 °C. Na SEM/EDS, os cristais de ALG mostraram-se predominantemente irregulares e foram detectados traços de impurezas (chumbo e cobre). Alterações na temperatura de fusão da ALG com manitol, estearato de magnésio e nos comprimidos comerciais foram observadas. A microscopia com aquecimento demonstrou que a interação entre manitol e ALG e nos comprimidos é devida à solubilização do fármaco no excipiente fundido, enquanto que na mistura com o estearato de magnésio é devida à fusão do excipiente e do fármaco que ocorrem separadamente, onde o excipiente funde antes que o fármaco. FTIR e XRPD das misturas não detectaram incompatibilidades, somente o aparecimento de bandas adicionais relacionadas aos excipientes. ALG foi compatível com todos os excipientes testados. Estes resultados são importantes para caracterizar, conhecer a estabilidade e a compatibilidade do fármaco. No capítulo II, foram desenvolvidos e validados métodos de cromatografia líquida (LC) indicativos de estabilidade utilizando dois detectores, ultravioleta (UV) e detector de aerossol carregado (CAD) para análise de ALG em comprimidos. Foi utilizada uma coluna C8 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) em modo isocrático, fluxo de 0,8 mL min-1, utilizando acetonitrila e tampão acetato de amônio 10 mM pH 3,5 ajustado com ácido acético (90:10, v/v) como fase móvel e detecção no UV em 275 nm. Os métodos foram lineares no intervalo de 25 - 200 μg mL-1 em ambos os detectores. Os limites de detecção foram de 2,65 e 6,25 μg mL-1 e os de quantificação de 8,84 e 20,85 μg mL-1, respectivamente, para UV e CAD. Os métodos foram precisos e exatos, com desvio padrão relativo menor que 3% e percentuais de recuperação próximos a 100%. Nenhum dos excipientes, ou produtos de degradação interferiu na detecção do fármaco durante os estudos de especificidade. No ensaio de robustez, pequenas alterações no fluxo de fase móvel, pH e concentração de solvente orgânico não afetou significativamente os resultados. O doseamento dos comprimidos obtido com ambos detectores não mostrou diferenças entre si. Os métodos podem ser considerados intercambiáveis e podem ser aplicados como ferramentas para o controle de qualidade de rotina de comprimidos de ALG. No capítulo III foi avaliada a estabilidade térmica da ALG utilizando TGA isotérmica e não isotérmica, e degradação em estufa, analisando as amostras por LC-UV. Na TGA isotérmica a ALG foi submetida a 150, 155, 160, 165, 170 °C, até perda de massa de 10% e os dados foram analisados pelo método de Arrhenius. Na TGA não isotérmica variaram-se as razões de aquecimento, utilizando 2,5, 5,0, 10,0 e 15,0 °C/min até 500 °C. Os dados foram analisados pelo método de Ozawa e de Kissinger. Na degradação em estufa o fármaco foi submetido as temperaturas de 130, 140, 150, 155, 160 e 170 °C. Os parâmetros cinéticos foram obtidos por Arrhenius. ALG segue degradação de zero ordem, onde a velocidade de degradação independe da concentração do reagente. A perda de massa está relacionada à perda química. Os parâmetros cinéticos variaram de acordo com o modelo matemático aplicado. A energia de ativação variou de 26 a 45 kcal/mol. O fármaco degradado demonstrou ser menos tóxico em ensaio de citotoxicidade em células CRIB do que o fármaco não degradado. Os métodos desenvolvidos e a caracterização realizada mostram-se úteis para o adequado controle de qualidade do fármaco. / Alogliptin (ALG) is an oral hypoglycemic agent, which inhibits the enzyme dipeptidyl peptidase - 4 (DPP-4) with high selectivity and increase insulin secretion, preventing postprandial hyperglycemia. ALG is not described in any pharmacopeia. In this context, this study aimed to characterize the active pharmaceutical ingredient (Chapter I), to developed assay methods (Chapter II) and to evaluate the stability (Chapter III), assuring the adequate quality control. In Chapter I, ALG was characterized by differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TGA) and scanning electron microscopy (SEM) coupled with energy dispersive spectrometer X-ray (EDS). The compatibility between ALG and the excipients present in the commercial tablets was evaluated by DSC, TGA, Fourier transform infrared (FTIR), X-ray powder diffraction (XRPD) and hot stage microscopy. ALG presented purity close to 99%, with a melting range between 179.4 to 187.2 °C (peak at 183.33 °C), followed by decomposition which began at 198 °C. In the SEM/EDS the crystals of ALG were predominantly irregulars and it were detected traces of impurities (lead and copper). Alterations in melting temperature of ALG with mannitol, magnesium stearate and in tablets were observed. The hot stage microscopy showed that the interactions between mannitol and ALG and in the tablets were due to the solubilization of the drug in the fused excipient, and in the mixture with magnesium stearate, it was due to the melting of the drug and excipient separately, where the excipient started the melting prior of the drug. FTIR and XRPD of the mixtures did not detect incompatibilities, only the appearance of additional bands related to the excipients. ALG was compatible with all excipients tested. These results are important to characterize, to know the drug stability and compatibility. In Chapter II, liquid chromatography (LC) methods indicative of stability were developed and validated using two detectors, ultraviolet (UV) and charged aerosol detector (CAD) for ALG tablets. It was used a C8 column (250 mm x 4.6 mm, 5 um) in isocratic mode, flow rate of 0.8 ml min-1 using acetonitrile and ammonium acetate buffer 10 mM, pH 3.5 adjusted with acid acetic acid (90:10, v/v) as mobile phase and UV detection at 275 nm. The methods were linear in the range of 25 - 200 μg ml-1 in both detectors. Limits of detection were 2.65 and 6.25 μg mL-1, and of quantification were 8.84 and 20.85 μg mL-1, respectively, for UV and CAD. The methods were accurate and precise, with a relative standard deviation lower than 3% and recovery close to 100%. None of the excipients or degradation products showed interference in the drug detection during specificity studies. In the robustness test, small changes in the mobile phase flow, pH and organic solvent concentration did not significantly affect the results. The results for tablets obtained with both detectors showed no differences. The methods may be considered interchangeable, and they can be used as tools for routine quality control of ALG tablets. In Chapter III the thermal stability of the ALG was evaluated using isothermal and non-isothermal TGA, as well as oven, and samples were analyzed by LC-UV. In the isothermal TGA the ALG was subjected to 150, 155, 160, 165, 170 °C until a mass loss of 10% and the data were analyzed by the Arrhenius method. In non-isothermal TGA the heating rates were varied using 2.5, 5.0, 10.0 and 15.0 °C/min until 500 °C. Data were analyzed by the Ozawa and Kissinger method. In oven the drug was subjected to 130, 140, 150, 155, 160, and 170 °C. The kinetic parameters were obtained by Arrhenius. ALG follows zero-order degradation, where the rate of degradation is independent of the concentration of any reagent. Mass loss is related to chemical reactions. The kinetic parameters varied according to the applied mathematical model. The activation energy ranged from 26 to 45 kcal / mol. The degraded drug was shown to be less toxic in cytotoxicity assay using CRIB cells than the non-degraded drug. The methods developed and the characterization performed proved to be useful for adequate quality control tests of the drug.

Alogliptina (ALG) é um hipoglicemiante oral, que inibe a enzima dipeptidil peptidase – 4 (DPP-4) com alta seletividade e aumenta a secreção de insulina prevenindo a hiperglicemia prandial. Como ALG não está descrita nas farmacopeias, este trabalho objetivou caracterizar a matéria-prima (Capítulo I), desenvolver métodos analíticos (Capítulo II) e avaliar sua estabilidade (Capítulo III), auxiliando no controle de qualidade. No capítulo I, a ALG foi caracterizada através de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) acoplada a espectrômetro de raios X por dispersão de energia (EDS). A compatibilidade entre a ALG e os excipientes presentes nos comprimidos foi avaliada por DSC, TGA, infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), difração de raios-X de pó (XRPD) e microscopia com estágio de aquecimento. ALG apresentou pureza próxima a 99%, com faixa de fusão entre 179,4 e 187,2 °C (pico em 183,3 °C), seguida por decomposição que iniciou em 198,0 °C. Na SEM/EDS, os cristais de ALG mostraram-se predominantemente irregulares e foram detectados traços de impurezas (chumbo e cobre). Alterações na temperatura de fusão da ALG com manitol, estearato de magnésio e nos comprimidos comerciais foram observadas. A microscopia com aquecimento demonstrou que a interação entre manitol e ALG e nos comprimidos é devida à solubilização do fármaco no excipiente fundido, enquanto que na mistura com o estearato de magnésio é devida à fusão do excipiente e do fármaco que ocorrem separadamente, onde o excipiente funde antes que o fármaco. FTIR e XRPD das misturas não detectaram incompatibilidades, somente o aparecimento de bandas adicionais relacionadas aos excipientes. ALG foi compatível com todos os excipientes testados. Estes resultados são importantes para caracterizar, conhecer a estabilidade e a compatibilidade do fármaco. No capítulo II, foram desenvolvidos e validados métodos de cromatografia líquida (LC) indicativos de estabilidade utilizando dois detectores, ultravioleta (UV) e detector de aerossol carregado (CAD) para análise de ALG em comprimidos. Foi utilizada uma coluna C8 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) em modo isocrático, fluxo de 0,8 mL min-1, utilizando acetonitrila e tampão acetato de amônio 10 mM pH 3,5 ajustado com ácido acético (90:10, v/v) como fase móvel e detecção no UV em 275 nm. Os métodos foram lineares no intervalo de 25 - 200 μg mL-1 em ambos os detectores. Os limites de detecção foram de 2,65 e 6,25 μg mL-1 e os de quantificação de 8,84 e 20,85 μg mL-1, respectivamente, para UV e CAD. Os métodos foram precisos e exatos, com desvio padrão relativo menor que 3% e percentuais de recuperação próximos a 100%. Nenhum dos excipientes, ou produtos de degradação interferiu na detecção do fármaco durante os estudos de especificidade. No ensaio de robustez, pequenas alterações no fluxo de fase móvel, pH e concentração de solvente orgânico não afetou significativamente os resultados. O doseamento dos comprimidos obtido com ambos detectores não mostrou diferenças entre si. Os métodos podem ser considerados intercambiáveis e podem ser aplicados como ferramentas para o controle de qualidade de rotina de comprimidos de ALG. No capítulo III foi avaliada a estabilidade térmica da ALG utilizando TGA isotérmica e não isotérmica, e degradação em estufa, analisando as amostras por LC-UV. Na TGA isotérmica a ALG foi submetida a 150, 155, 160, 165, 170 °C, até perda de massa de 10% e os dados foram analisados pelo método de Arrhenius. Na TGA não isotérmica variaram-se as razões de aquecimento, utilizando 2,5, 5,0, 10,0 e 15,0 °C/min até 500 °C. Os dados foram analisados pelo método de Ozawa e de Kissinger. Na degradação em estufa o fármaco foi submetido as temperaturas de 130, 140, 150, 155, 160 e 170 °C. Os parâmetros cinéticos foram obtidos por Arrhenius. ALG segue degradação de zero ordem, onde a velocidade de degradação independe da concentração do reagente. A perda de massa está relacionada à perda química. Os parâmetros cinéticos variaram de acordo com o modelo matemático aplicado. A energia de ativação variou de 26 a 45 kcal/mol. O fármaco degradado demonstrou ser menos tóxico em ensaio de citotoxicidade em células CRIB do que o fármaco não degradado. Os métodos desenvolvidos e a caracterização realizada mostram-se úteis para o adequado controle de qualidade do fármaco. / Alogliptin (ALG) is an oral hypoglycemic agent, which inhibits the enzyme dipeptidyl peptidase - 4 (DPP-4) with high selectivity and increase insulin secretion, preventing postprandial hyperglycemia. ALG is not described in any pharmacopeia. In this context, this study aimed to characterize the active pharmaceutical ingredient (Chapter I), to developed assay methods (Chapter II) and to evaluate the stability (Chapter III), assuring the adequate quality control. In Chapter I, ALG was characterized by differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TGA) and scanning electron microscopy (SEM) coupled with energy dispersive spectrometer X-ray (EDS). The compatibility between ALG and the excipients present in the commercial tablets was evaluated by DSC, TGA, Fourier transform infrared (FTIR), X-ray powder diffraction (XRPD) and hot stage microscopy. ALG presented purity close to 99%, with a melting range between 179.4 to 187.2 °C (peak at 183.33 °C), followed by decomposition which began at 198 °C. In the SEM/EDS the crystals of ALG were predominantly irregulars and it were detected traces of impurities (lead and copper). Alterations in melting temperature of ALG with mannitol, magnesium stearate and in tablets were observed. The hot stage microscopy showed that the interactions between mannitol and ALG and in the tablets were due to the solubilization of the drug in the fused excipient, and in the mixture with magnesium stearate, it was due to the melting of the drug and excipient separately, where the excipient started the melting prior of the drug. FTIR and XRPD of the mixtures did not detect incompatibilities, only the appearance of additional bands related to the excipients. ALG was compatible with all excipients tested. These results are important to characterize, to know the drug stability and compatibility. In Chapter II, liquid chromatography (LC) methods indicative of stability were developed and validated using two detectors, ultraviolet (UV) and charged aerosol detector (CAD) for ALG tablets. It was used a C8 column (250 mm x 4.6 mm, 5 um) in isocratic mode, flow rate of 0.8 ml min-1 using acetonitrile and ammonium acetate buffer 10 mM, pH 3.5 adjusted with acid acetic acid (90:10, v/v) as mobile phase and UV detection at 275 nm. The methods were linear in the range of 25 - 200 μg ml-1 in both detectors. Limits of detection were 2.65 and 6.25 μg mL-1, and of quantification were 8.84 and 20.85 μg mL-1, respectively, for UV and CAD. The methods were accurate and precise, with a relative standard deviation lower than 3% and recovery close to 100%. None of the excipients or degradation products showed interference in the drug detection during specificity studies. In the robustness test, small changes in the mobile phase flow, pH and organic solvent concentration did not significantly affect the results. The results for tablets obtained with both detectors showed no differences. The methods may be considered interchangeable, and they can be used as tools for routine quality control of ALG tablets. In Chapter III the thermal stability of the ALG was evaluated using isothermal and non-isothermal TGA, as well as oven, and samples were analyzed by LC-UV. In the isothermal TGA the ALG was subjected to 150, 155, 160, 165, 170 °C until a mass loss of 10% and the data were analyzed by the Arrhenius method. In non-isothermal TGA the heating rates were varied using 2.5, 5.0, 10.0 and 15.0 °C/min until 500 °C. Data were analyzed by the Ozawa and Kissinger method. In oven the drug was subjected to 130, 140, 150, 155, 160, and 170 °C. The kinetic parameters were obtained by Arrhenius. ALG follows zero-order degradation, where the rate of degradation is independent of the concentration of any reagent. Mass loss is related to chemical reactions. The kinetic parameters varied according to the applied mathematical model. The activation energy ranged from 26 to 45 kcal / mol. The degraded drug was shown to be less toxic in cytotoxicity assay using CRIB cells than the non-degraded drug. The methods developed and the characterization performed proved to be useful for adequate quality control tests of the drug.

Metabólitos secundários produzidos por Streptomyces com atividade antibiótica apresentam relevante importância biotecnológica para as indústrias farmacêuticas e agroquímicas. Dentre estes metabólitos, podemos destacar a nigericina, um antibiótico poliéter usado como aditivo em ração animal atuando como promotor de crescimento e no tratamento de algumas doenças, como a malária, em carcinoma nasofaríngeo, a vaccínia, entre outras. Neste trabalho foram avaliadas duas cepas de actinobactérias potenciais produtoras de nigericina, a EUCAL 26 e a EUCAL 74. As duas actinobatérias foram fermentadas em cinco meios de cultivo diferentes (BD, Czapek, ISP2, M29 e TSB). A cepa EUCAL 26 foi a mais promissora na produção de nigericina em meio Czapeck. A partir da EUCAL 26, foi feito um estudo da máxima produção de nigericina em meio Czapek variando o pH do meio, temperatura de fermentação, e período de fermentação. As melhores condições encontradas foram em pH 7,0 a 25 °C por 27 dias. Foi realizado também um estudo de otimização de aumento de escala de fermentação, de um volume de meio Czapeck de 50 mL, para um volume de 4 L. Também foram avaliados dois resíduos agroindustriais (Farmal e Melaço de Soja) para a produção de nigericina. O meio de Melaço de Soja aumento a produção em aproximadamente 300x quando comparado com o meio Czapeck padrão. Os efeitos dos nutrientes do meio Czapeck também foram avaliados. A retida do K2HPO4 do meio produziu um aumento de 50x na produção de nigericina, quando comparado com o meio Czapeck controle. Também foi avaliado o efeito da adição de -butirolactonas sintéticas, moléculas de sinalização hormonal, para a produção de nigericina. Das 15 -butirolactonas testadas, a DP21A foi a mais eficiente, pois além de aumentar a produção de nigericina em 23x, também diminui o período máximo de sua produção. Todas as analises realizadas neste trabalho para o monitoramento da produção de nigericina, foram feitas empregando a espectrometria de massas sequencial acoplada à cromatografia liquida de ultra eficiência. / Secondary metabolites produced by Streptomyces with antibiotic activity have significant biotechnological importance for the pharmaceutical and agrochemical industries. Among them, nigericin stands out as an antibiotic polyether used as growth promoter in animal feed and for treatment of some diseases such as malaria, nasopharyngeal carcinoma, and vaccinia. In this study, two actinobacteria strains considered potential producers of nigericin named EUCAL 26 and 74 were tested. The two actinobacteria were fermented in five different culture media (BD, Czapek, ISP2, M29 and TSB). EUCAL 26 strain was the most promising in producing nigericin in amid Czapeck media. For EUCAL 26, a study of maximum production of nigericin in Czapek medium at varying the pH, fermentation temperature and fermentation period have been performed. As a result, the best conditions were pH 7.0, at 25 °C for 27 days. In addition, an optimization study for scale-up fermentation have been done, where a volume of 50 mL Czapeck medium have been expanded to 4 L, in order to obtain the highest production of nigericin. Two agroindustrial residues (FARMAL and Honey Soy) have also been evaluated for nigericin production. The honey soy medium increased nigericin production in the rate of 300 when compared with standard Czapeck medium. The effects of nutrients from Czapeck medium have also been evaluated. Removal of K2HPO4 from culture medium resulted in an increase of 50 times when compared with the control Czapeck medium. The effect of adding synthetics -butyrolactones (hormone signaling molecules) for the production of nigericin have also been evaluated. From 15 tested -butyrolactones, DP21A was the most efficient. In addition to increase nigericin yield in 23x it also reduced the period for its maximum production. All analyzes performed in this study to monitor the nigericin production were performed using tandem mass spectrometry coupled to ultra high performance liquid chromatography.

Neste trabalho foi empregada uma metodologia rápida e eficiente para a identificação de metabólitos fitotóxicos produzidos por microrganismos. O isolamento do composto bioativo foi guiado através de bioensaio com Lemna minor. A espectrometria de massas, em especial o LC-MS, foi utilizada para acelerar o processo de identificação do composto ativo. As bactérias estudadas eram simbióticas do fungo fitopatogênico Sclerotium rolfsii. Seus respectivos extratos orgânicos obtidos de culturas em meio BD (batata dextrose) foram submetidos ao ensaio de fitotoxicidade com Lemna minor. Entre cinco bactérias foi selecionada a bactéria Burkholderia sp, a qual apresentou maior atividade no ensaio de fitotoxicidade. O fracionamento por cromatografia em coluna de sílica propiciou a identificação de uma fração ativa. A fitotoxina foi caracterizada como sendo um macropentólido de 20 membros. O composto pertence à classe dos polihidroxibutiratos (PHBs). Sua estrutura foi determinada por RMN 1H, RMN 13C, HMQC, HMBC, IV, ESI-MS/MS e também por comparação com dados da literatura. Esse composto nunca foi isolado de fontes naturais. Foi descrito na literatura uma rota sintética para sua obtenção, porém esta é a primeira vez que sua atividade fitotóxica é relatada. Este trabalho mostra uma nova perspectiva para o emprego de PHBs de baixo peso molecular e apresenta uma proposta de estrutura de composto fitotóxico que pode servir de modelo para a síntese de novos herbicidas. / In this work a quick and efficient methodology was employed for the identification of phytotoxic metabolites produced by microorganisms. The isolation of the bioactive compound was guided by Lemna minor bioassay. Mass spectrometry, especially LC-MS, was used to accelerate the process of identification of the phytotoxin. All bacteria were symbiotic to the phytopatogenic fungi Sclerotium rolfsii.. The bacterium Burkholderia sp was selected among the five bacteria analyzed, due to its greater phytotoxic activity in the bioassay. The phytotoxin was characterized as a 20 member macropentolide. This compound belongs to the polyhidroxybutirates (PHBs) chemical class. Its structure was determined by NMR1H, NMR 13C, HMQC, HMBC, IV, ESI-MS/MS and HRMS. It has never been isolated from natural sources before. Although a synthetic route has been proposed in the literature this is the first time that its phytotoxic activity is reported. This work leads to a new perspective for the application of low molecular weight PHBs and propose a phytotoxic structure that can be used as a model for the synthesis of new herbicide class.

L’homéostasie du fer est régulée par l’hepcidine, peptide hyposidérémiant d’origine essentiellement hépatique, qui agit par inhibition de l’absorption intestinale du fer et de son recyclage par les macrophages. Ce travail propose de mettre en évidence l’intérêt d’une approche du rôle et de la régulation de l’hepcidine en pathologie, à partir de sa quantification dans la circulation. Après une mise point du dosage par spectrométrie de masse en tandem et une validation dans des modèles pathologiques chez l’homme et la souris, nous avons étudié les anomalies du métabolisme du fer dans plusieurs pathologies. Dans un modèle murin d’obésité, nous avons montré qu’une augmentation de l’hepcidine circulante due à la contribution du tissu adipeux permet d’expliquer les phénotypes décrits chez l’homme, une carence martiale et/ou une surcharge en fer, tout en ouvrant la perspective d’une nouvelle voie de régulation. Cependant une diminution de l’absorption intestinale en fer serait en partie indépendante de l’hepcidine. Chez des patients atteints de maladie de Gaucher, l’absence de modulation de l’hepcidine sérique, malgré une hyperferritinémie fréquemment observée, a révélé une séquestration locale de fer. Enfin, la variation des taux d’hepcidine sérique dans un modèle murin d’hémolyse chronique selon le fond génétique a permis d’illustrer l’impact de l’hepcidine circulante sur le phénotype de surcharge martiale. Au travers de ces différentes applications nous avons montré comment la quantification de l’hepcidine sérique peut aider à la compréhension d’anomalies de l’homéostasie du fer chez l’homme et l’animal. / Iron homeostasis is regulated by hepcidin, a negative iron regulator peptide, mainly produced by hepatocytes, which acts by inhibiting the intestinal iron absorption and its recycling by macrophages. This work proposes to highlight the interest of approach to the role and regulation of hepcidin in pathology, from its quantification in blood. After developing a tandem mass spectrometry assay and validating it in human and mice disease patterns, we studied iron metabolism disorders in several pathologies. In a mouse model of obesity, we showed that an increase of circulating hepcidin due to the adipose tissue contribution helps explaining phenotypes described in humans, iron deficiency and / or iron overload, while opening the prospect of a new regulatory pathway. However a decrease in intestinal iron absorption is partly independent of hepcidin. In Gaucher disease patients, the absence of modulation in serum hepcidin despite frequently high ferritinemia observed, revealed a local iron sequestration. Finally, the change in serum hepcidin levels in a chronic hemolysis mouse model, according to the genetic background, has illustrated the impact of circulating hepcidin on iron overload phenotype. Through these different applications we showed how quantification of serum hepcidin may help understanding iron homeostasis abnormalities in humans and animals.

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This thesis is about the story of the development of Adult Literacy and Numeracy policy and practice in Scotland. It includes some of my personal experiences over the past thirty years working in the field of adult education and particularly in literacies. However, the focus is primarily on the years 2000 –2006 when major developments took place in this field of adult learning. One of the tenets of the ‘new literacies’ policy and practice is that it is predicated on a social practice model. This thesis explores whether this assertion is rhetoric or reality. In the process the thesis outlines what the term social practice means to theorists, academics and those involved in the direct delivery of literacies. It examines the policy documents and the practices of managers and tutors and learner outcomes. The thesis argues that, while a learner centred approach is integral to any good adult education practice, it does not equate to the use of a social practice model and more requires to be done before it can be claimed that Scotland truly operates a social practice model in the delivery of Adult Literacy and Numeracy. The first five chapters of the thesis outline the historical context of literacies development in Scotland, locate my methodological approach, explore what is meant by social practices, sketch the development of policy and practice in Scotland and describe the methods used to gather data. The following three chapters explore the responses of the managers, tutors and learners that informed the outcomes of the research. The final chapters analyse the data and address three pertinent questions. Firstly, is it possible/likely that a full social practice model can become the norm in Scotland, secondly, whether it is possible to develop this model at a national level anywhere considering the current global situation and thirdly, how can the good practice recorded in this research be sustained.