Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-02-11T15:19:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoProduçãoVacina.pdf: 1373045 bytes, checksum: b2b1f1d6c6a072fb1d3e7addbdcb321e (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-02-11T17:49:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoProduçãoVacina.pdf: 1373045 bytes, checksum: b2b1f1d6c6a072fb1d3e7addbdcb321e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-11T17:49:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AvaliaçãoProduçãoVacina.pdf: 1373045 bytes, checksum: b2b1f1d6c6a072fb1d3e7addbdcb321e (MD5) Previous issue date: 2011 / No Brasil, o controle da leishmaniose visceral (LV) tem sido baseado num “tripé” de ações que preconiza o tratamento de casos humanos, o combate ao vetor e a eliminação de cães soropositivos, que infelizmente não tem alcançado bons resultados na redução dos casos de LV humana e canina. Assim, a imunoprofilaxia surge como uma das alternativas mais importantes para o controle da LV. Considerando que até o momento ainda não existem vacinas que sejam comprovadamente protetoras, nosso grupo de pesquisa tem empregado esforços no desenvolvimento de protótipos vacinais contra leishmaniose visceral canina (LVC). Um destes protótipos é a vacina LBSapSal, composta por antígenos de Leishmania braziliensis associada ao extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) e ao adjuvante saponina. Estudos prévios em cães vacinados com a vacina LBSapSal revelaram a indução de forte imunogenicidade, marcada pelo aumento de linfócitos T CD8+ circulantes, dos níveis de óxido nítrico séricos e por uma produção balanceada de isotipos de IgG (IgG1/IgG2) indicando uma resposta imune mista do tipo 1 e tipo 2. Tais resultados indicam que a vacina LBSapSal induz uma resposta imune protetora anti-LVC. Desta forma o presente trabalho tem como objetivo central avaliar a capacidade imunoprofilática da vacina LBSapSal através de estudos de proteção após o desafio experimental com promastigotas de Leishmania chagasi. Foram utilizados 20 cães, com idade de 210 dias, sem raça definida que foram subdivididos em quatro grupos experimentais com cinco animais cada um, entre os quais: (i), grupo CID, (ii) grupo Sal, (iii) grupo LBSal e (iv) grupo LBSapSal. Foram ministradas três aplicações vacinais subcutâneas em intervalos de 30 dias. Após 3 meses do último inóculo, os cães foram desafiados com 1x107 promastigotas de L. chagasi associadas ao conteúdo de cinco ácinos de glândula salivar de L. longipalpis por via intradérmica. Estes animais foram acompanhados por um período de 885 dias após o desafio, onde foi coletado material biológico para a realização de análise parasitológica da proteção vacinal. Coletas de tecidos de pele e baço foram realizadas para uma investigação da presença do parasito e da carga parasitária nestes órgãos. Nesta investigação foi realizado o isolamento do parasito pela técnica de esplenocultura utilizando o meio NNN/LIT e avaliação do parasitismo por meio de imunohistoquímica anti-Leishmania, análise de imprints de tecidos por microscopia óptica (Giemsa) e reação de PCR em Tempo Real (qPCR) nos tecidos. Dentre as metodologias parasitológicas, a qPCR apresentou alta sensibilidade para detectar L. chagasi na pele e no baço de cães que apresentam baixa carga parasitária. Os resultados de qPCR nos permitiu observar o aumento dos níveis de eficácia vacinal experimental, em relação ao grupo controle (CID) ao se incorporar antígeno de saliva (Sal) e saliva mais antígeno de Leishmania (LBSal). Adicionalmente, aumento dos níveis de proteção e eficácia foram obtidos pela incorporação do adjuvante saponina aos antígenos de saliva de flebotomíneo e de Leishmania (LBSapSal). Neste sentido, os resultados mostraram que a vacina LBSapSal conferiu 80% de proteção na pele, enquanto que todos os cães apresentaram parasitismo no baço. Nossos dados nos permite supor o potencial que a vacina LBSapSal tem em proteger a pele contra a infecção por L. chagasi Desta forma, nos animais imunizados com LBSapSal, a redução da frequência do parasitismo cutâneo poderia implicar na redução da transmissão de Leishmania para o inseto vetor, podendo contribuir no controle deste parasito. __________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Brazil, control of visceral leishmaniasis (VL) has been based on a "tripod" of action that addresses the treatment of human cases, the vector control and elimination of seropositive dogs, which unfortunately hasn´t achieved good results in reducing cases of human and canine VL. Thus, immunoprophylaxis appears as one of the most important alternative for the control of VL. Considering that so far there are still no proven vaccines that are protective, our research group has used efforts in developing prototypes vaccine against canine visceral leishmaniasis (CVL). One of these prototypes is LBSapSal vaccine consisting of antigens of Leishmania braziliensis associated with salivary gland extract of Lutzomyia longipalpis (SGE) and the saponin adjuvant. Previous studies in dogs vaccinated with LBSapSal revealed the induction of strong immunogenicity, marked by increased levels of CD8 + T circulating cells, of serum nitric oxide and a balanced production of IgG isotypes (IgG1/IgG2), indicating a mixed immune response type 1 and type 2. These results indicate that the vaccine LBSapSal induces an immune response anti-LVC. Thus the present work is mainly aimed to assess the immunoprophylactic ability of the vaccine LBSapSal through studies of protection after experimental challenge with promastigotes of Leishmania chagasi. We used 20 mongrel dogs, aged 210 days, that were divided into four groups with five animals each, including: (i), group CID, (ii) Sal group, (iii) group LBSal and (iv) group LBSapSal. Three vaccine subcutaneous applications were given at intervals of 30 days. After three months of last inoculum, the animals were challenged, intradermally, with 1x107 promastigotes of L. chagasi associated with five lobes of the salivary gland of L. longipalpis. These animals were followed for a period of 885 days after the challenge, wich was collected biological material to perform parasitological analyses of vaccine protection. Samples of skin and spleen were performed to investigate the presence of a parasite and the parasite burden in this organs. In this investigation we performed the isolation of the parasite in spleen samples using NNN/LIT medium, and to evaluate the parasitism by immunohistochemical anti-Leishmania, analysis of tissues imprints by optical microscopy (Giemsa) and by PCR Real-Time (qPCR). Among the parasitological methods, the qPCR presented high sensitivity to detect L. chagasi in the skin and spleen of dogs presenting low parasite burden. The results allowed us to observe the increased levels in the experimental vaccine efficacy in comparission to the control group (CID) by incorporating saliva (Sal) and saliva more Leishmania antigen (LBSal). Additionally, increased levels of protection and efficacy were obtained by incorporation of saponin adjuvant to Leishmania an sand fly saliva antigens (LBSapSal). In this sense, the results shoed that the LBSapSal vaccine elicited 80% of protection in the skin, whereas all dogs presented parasitism in the spleen. Our data allows us hypothesize the potencial that LBSapSal vaccine has in protect the skin againts L. chagasi. Thus, in the animals immunized with LBSapSal the reduction of the frequency of parasitism in the skin could result in the reduction of Leishmania transmission to the insect vector, which may contribute to control this parasite.