Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-12-05T17:32:40Z No. of bitstreams: 1 Manoel Leoncio da Penha Filho Anticorpos monoclonais... 2003.pdf: 40157874 bytes, checksum: a8a843890d6d1f967434db64a38014bb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-05T17:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manoel Leoncio da Penha Filho Anticorpos monoclonais... 2003.pdf: 40157874 bytes, checksum: a8a843890d6d1f967434db64a38014bb (MD5) Previous issue date: 2003 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O diagnóstico de certeza da leishmaniose visceral (LV) só é conseguido através da demonstração do parasito diretamente ou em cultura o que implica em procedimentos demoradc» envolvendo certo risco e/ou dor. Este estudo tem como objetivos a produção de AcMc diVí^ã-Leishmania chagasi, padronização de um ensaio de imunohistoquímica para visualização de amastigotas de Leíshmania utilizando AcMc e verificação do potencial de um ELISA de inibição utilizando AcMc em quantificar amastigotas de Leishmania. [MATERIAIS E MÉTODOS] Camundongos BALB/c foram imunizados com antígeno de amastigotas de L chagasi ou com a proteína recombinante Lc-13 cujo gene foi clonado de uma biblioteca de cDNA de L chagasi. Os esplenócitos destes animais foram fundidos com células SP 2-0 através de polietilenoglicol. Estes, juntamente com um AcMc já disponível, o 5A9H8, foram usados em um ensaio de imunohistoquímica utilizando fígado de hamster infectado com L chagasi parafinado fixado em formalina, testando-se diferentes protocolos de exposição de epitopos. Também com os mesmos AcMc foi realizado um ELISA de inibição a fim de quantificar amastigotas de /.e/s/?/nan/a.[RESULTADOS] Foram encontrados dois clones reativos em cada fusão; o 10B4/6 e o 10D8 na primeira e o 2C10D5 e o 11E8H7 na segunda. Os AcMc 10B4/6 e o 10D8 são ambos lgG1, reconhecem antígenos com peso molecular entre 47 e 57 kDa e são possivelmente idênticos. Foi encontrada marcação de amastigotas, em tecidos infectados, com os seguintes AcMc: 5A9H8, em seções pré-tratadas com calor, e o 10B4/6 e o 10D8, em seções pré-tratadas com pronase. No ELISA de inibição o AcMc 5A9H8 mostrou-se capaz de detectar no mínimo 10® parasitos por poço de placa de microtitulação. / The certainty of diagnosis in visceral leishmaniasis is only achieved through the direct demonstration of parasites in culture, implying in long procedures and in risks and/or pain for the patients. The objectives of this study is the production of anti-Leishmania chagasi monoclonal antibodies (mAb), standardization of an immunohistochemical assay for allowing the visualization of Leishmania amastigotes using the mAb, and finding out the potential of a mAb-based inhibition ELISA for quantifying Leishmania amastigotes. [MATERIAL & METHODS] BALB/c mice were immunized with L chagasi amastigote antigens or with a recombinant protein denominated Lc13, the gene of which was cloned from a L chagasi amastigote cDNA library. Splenocytes from these animals were obtained and fused with SP 2-0 myeloma cells by using polyethylene glycol. The mAb produced by the hybrid cells, together with an available mAb (5A9H8), were used in an immunohistochemical assay, using paraffin sections of infected hamster liver. Different protocols for the exposition of epitopes were evaluated. One of the mAb was also used in an inhibition ELISA to quantify Leishmania amastigotes. [RESULTS] Two anti-amastigote mAb-producing clones were obtained in each fusion, the 10B4/6 and the 10D8 mAb in the first and the 2C10D5 and the 11E8H7 mAb in the second. The 10B4/6 and the 10D8 mAb, obtained from the fusion of myeloma with splenocytes of an animal immunized with lysed amastigotes, were both lgG1, recognized the same antigens, with molecular weights ranging from 47 to 57 kDa, and were possibly identical, o 10B4/6 e o 10D8 na primeira e o 2C10D5 e o 11E8H7 na segunda. The following mAb stained amastigotes in infected tissues in an im mu noperoxidase reaction: the 5A9H8, using heat-treated sections, and the 10B4/6 and the 10D8, in pronase-treated sections. The 5A9H8 mAb detected a minimum of 10® parasites per well In the inhibition ELISA.