Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alexander Sibajev.pdf: 606940 bytes, checksum: 9c6a8d6a72194ece920cce39baa6aa55 (MD5) Previous issue date: 2005-12-14 / The determination of the prevailing species responsible for American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) and the detection at species level of the varieties of the protozoan parasite agent of this endemic disease at the Amazon region are important for determination of the clinical evolution and to better indicate the therapeutic conduct due to the different responses to chemotherapeutic drugs by the Leishmania species. By now we are not aware of an available test to Leishmania (Viannia) guyanensis capable of detecting its intra-specific varieties obtained from human clinical presentations or from vertebrate and invertebrate hosts. We succeed to discriminate Leishmania (V.) guyanensis from Leishmania (V.) braziliensis and also from Leishmania (V.) panamensis through a polimerase chain reaction direct genomic DNA amplification aimed at the transcribed internal spacer (ITS) of the ribosomal RNA gene (rDNA). The positive reaction is visualized at the agarose gel electrophoresis by the presence of an aproximatedly 229 nucleotides size band for L. guyanensis that is absent for the two other species L. braziliensis and L. panamensis. The diagnosis can be done using culture material, skin biopsy or squashing the sand fly vector and having the DNA extracted. In a second step of the investigation, the ITS rDNA was sequenced in L. lainsoni; L. naiffi and four L. guyanensis strains, two of them presenting a muco-cutaneous form of Leishmaniasis. These sequences were compared to others available at the Genbank Database, confirming the previous data from multilocus enzyme electrophoresis and ITS restriction fragment lenght polymorphisms analysis, positioning L. lainsoni and L. naiffi as more divergent species as compared to L. braziliensis, L. panamensis and L. guyanensis species inside de Viannia sub-genus. A correlation was observed in grouping nearer the two L. guyanensis strains, respectively IM4243 and IM4235, responsible for the muco-cutaneous form. This protozoan belonging to sub-genus Viannia show clinical and epidemiological importance in South America north region, particularly the Amazon region and this study can be considered an advance in providing a tool to better understand the parasite species silvatic cycle and in providing tools to characterize the main species responsible for the clinical form presentation of tegumentary leishmaniasis in the human population at this region. / A determinação da espécie responsável pela Leishmaniose Tegumentar Americana e a detecção específica das variedades do protozoário agente dessa doença endêmica na Amazônia, é importante para determinação do comportamento clínico e indicação da conduta terapêutica, devido as diversas respostas aos quimioterápicos pelas espécies de Leishmania. No momento se desconhece um teste disponível para a Leishmania (Viannia) guyanensis, que seja capaz também de incluir suas variedades intra-específicas obtidas de casos humanos e de hospedeiros e vetores silvestres. Neste trabalho se conseguiu discriminar alguns isolados de Leishmania (Viannia) guyanensis, de Leishmania (Viannia) braziliensis e também de Leishmania (Viannia) panamensis através da reação em cadeia da polimerase direcionada para a amplificação do espaçador transcrito interno (ITS) do gene do RNA ribossomal. A reação positiva é dada pela visualização de um fragmento amplificado de cerca de 229 nucleotídeos, para L. (V.) guyanensis e ausente para as outras duas espécies. O diagnóstico pode ser feito com o DNA extraído de cultivo do parasita, diretamente das amastigotas da borda de lesão cutânea ulcerada ou do vetor infectado pela promastigota de Leishmania. Numa etapa seguinte a região ITS do rDNA foi sequenciada para L. lainsoni, L. naiffi e quatro cepas de L. guyanensis em que duas apresentavam forma muco-cutânea e duas outras a forma cutânea da leishmaniose. Essas sequências foram comparadas com as disponíveis em banco de dados como o Genbank, resultando na confirmação dos dados obtidos de variabilidade genética por outros autores, quando utilizada a técnica de isoenzimas e ITS-RFLP. O posicionamento de L. lainsoni e L. naiffi se mostrou mais divergente que L. guyanensis, L. braziliensis e L. panamensis, dentro do subgênero Viannia. Foi também encontrada uma relação de proximidade entre os isolados de L. guyanensis IM4243 e IM4235 apresentando lesão cutâneo-mucosa. As leishmânias do sub-gênero Viannia apresentam importância epidemiológica na América do Sul, sobretudo na região amazônica e esse estudo poder ser considerado importante ao desenvolver meios de diagnóstico específico do parasita, detectando sua presença em vetores e reservatórios silvestres em certas áreas e servindo como marcador para a principal espécie responsável pelas formas clínicas de leishmaniose nessa região.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-08T18:20:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoVitroInfectividade.pdf: 46258236 bytes, checksum: e26a9da2a5c61477542b2e8eb278c3ba (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-04-10T15:22:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoVitroInfectividade.pdf: 46258236 bytes, checksum: e26a9da2a5c61477542b2e8eb278c3ba (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-10T15:22:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_EstudoVitroInfectividade.pdf: 46258236 bytes, checksum: e26a9da2a5c61477542b2e8eb278c3ba (MD5) Previous issue date: 2003 / Os parasitos do gênero Leishmania apresentam variações de infectividade intra e inter específicas. Entretanto, são escassas as informações a respeito da infectividade das espécies de Leishmania do Novo Mundo, principalmente, daquelas encontradas na região Amazônica brasileira, onde, até o presente momento são conhecidas seis espécies pertencentes ao subgênero Viannia causadoras de LTA. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi investigar, in vitro, o comportamento da infectividade de 5 espécies de Leishmania do subgênero Viannia em macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c e sua correlação com a produção de óxido nítrico pelos macrófagos infectados. Trinta cepas de Leishmania foram distribuídas em seis grupos iguais, de acordo com as espécies seguintes: I- L. (V) braziliensis/LCL, II- L. (V) braziliensis/LCM, III- L. (V) guyanensis, IV- L. (V) shawi, V -L. (V) naiffi e VI- L. (V) lainsoni. As cepas foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-gentamicina, até atingir a fase estacionária de cultivo, quando foram usadas para infectar macrófagos na proporção de 4 parasitos/macrófago. As culturas foram incubadas a 35°C e 5% de CO2 e após 24h, as lamínulas foram coradas com Giemsa para contagem do número de parasitos e determinação do índice de infecção, enquanto a concentração de NO (nitrito) foi calculada pelo método de Griess. Observou-se que as cepas de L. (V) braziliensis/LCM apresentaram o maior índice de infecção (385), sendo este significativamente maior (P<0,005) que as cepas de L. (V) braziliensis/LCL (264), L. (V) naiffi (215) e L. (V) lainsoni (272), porém, não significativamente maior que os índices das espécies L. (V) shawi (292) e L. (V) guyanensis (300). Quanto aos níveis de NO (nitrito), detectou-se maior concentração para a espécie L. (V) naiffi (4,1µM e menor concentração para as cepas de L. (V) braziliensis/LCM (2,15µM). As demais espécies tiveram concentrações de: L. (v:) lainsom (3,14µM), L. (V) shawi (2,96µM), L. (V) guyanensis (2,76µM) e cepas de L. (V) braziliensis/LCL (3,1µM). Diante do exposto, concluímos que cepas de L. (V) braziliensis/LCM são mais infectivas do que as demais espécies estudadas e, também, mais infectivas que cepas homólogas isoladas de casos clínicos de LCL. Além disso, observou-se menor infectividade da espécie L. (V) naiffi. Desse modo, notou-se que os níveis de NO produzidos pelos macrófagos infectados foram inversamente proporcionais ao grau do parasitismo. / Parasites ofthe genus Leishmania show both intra- and inter-specific variations of infectivity. There is little available information, however, regarding the infective behavior of New World species particularly those of the Amazon Region of Brazil, where there occur at six species of the subgenus Viannia causing human cutaneous leishmaniasis (ACL). The aim of the present study was to investigate the infectivity of 5 of these species for the peritoneal macrophages of BALB/c mice, and their role in the host-cell's production of nitric oxide (NO). Thirty strains of Leishmania were divided into 6 groups of the fol1owing species: I-L. (V.) braziliensis (from cases of localized skin lesions-LCL); II- L. (V.) braziliensis (from cases of mucocutaneous lesions- LeM); III- L. (V.) guyanensis; IV- L. (V.) shawi; V- L. (V.) naiffi and VI- L. (V.) lainsoni. They were cultivated in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/gentamicin, until reaching the stationary phase of development. These promastigotes were used to infect the macrophage cell cultures, in the proportion of 4 flagellates/macrophage. The cultures were then incubated at 35°C with 5% CO2 and, after 24 hours following inoculation, the corvelips were stained by Giemsa's method to determine the infection index. The nitric oxide (nitrite) concentration was measured in the culture supernatant by Griess' s method to determine the infection index. The nitric oxide (nitrite) concentration was measured in the culture supernatant by Griess' s method. It was found that LCM strains of L. (V.) braziliensis showed the highest infection index (385), significance p<0.05,compared with L. (V.) braziliensis LCL strains (264). L. (V). naiffi and L. (V.) lansoni had the lowest infection indices of (215) and (272), respectively, but, were not significally different from index of L. (V.) guyanensis (300). Rrgarding the NO levels, the highest was that for L. (V.) naiffi (4,1µM), and the lowest for L. (V.) braziliensis-LCM strains (2, 15µM). The other readings were (3,14µM) for L. (V.) lainsoni, 2,96µM for L. (V.) shawi, 2,76µM for L. (V.) guyanensis and 3,1µM for L. (V.) braziliensis-LCL strains. It is conc1uded that L. (V.) natffi. In this way it may be noted the NO levels for infected macrophage were inversely proportional to the degree of infectivity of the species studied.