Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6752_DissertacaoMestrado2013.pdf: 1054624 bytes, checksum: 409a3515cd2707cff3047b1c1ac826f1 (MD5) Previous issue date: 2013-08-28 / O diagnóstico de rotina da leishmaniose visceral (LV) humana é usualmente baseado em parâmetros clínicos e epidemiológicos, associado a exames parasitológicos e/ou imunológicos. Tendo em vista que a doença é fatal se não tratada, a busca por métodos diagnósticos mais efetivos, que sejam de fácil execução, simples, acessíveis, menos invasivos, e rápidos, se faz necessário, diminuindo o tempo de obtenção dos resultados. Portanto, neste estudo foi avaliado o desempenho de diferentes métodos já utilizados na rotina ou propostas como ferramentas alternativas para o diagnóstico da LV, incluindo o exame direto de punção de medula óssea, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), o teste rápido com rK39 (Kalazar Detect®), a ELISA com antígeno solúvel de L. chagasi e a imunofluorescência baseada em citometria de fluxo (FC-AFPA). Para isso foram avaliadas 77 amostras biológicas (punção de medula óssea e soro) de pacientes com diagnóstico clínico de LV, tratados e curados. A sensibilidade dos testes avaliados foi de 48% para o exame parasitológico direto, 74% para RIFI, 79% para o teste rápido com rK39, 88% para o teste ELISA-ASL e 94% para a FC-AFPA. A análise comparativa dos testes avaliados demonstrou que há maior concordância entre os testes sorológicos entre si, do que entre os testes sorológicos e o exame direto, devido a sua baixa sensibilidade. Foi também realizada a comparação entre os resultados dos testes sorológicos em relação ao resultado do teste parasitológico direto. Entretanto, nossos resultados mostraram que o desempenho dos testes foi semelhante independente do resultado do exame direto. Além disso, nosso estudo avaliou o desempenho de dois algoritmos para diagnóstico da LV baseados apenas em testes sorológicos. O primeiro deles utilizando a RIFI como teste de inicial, uma vez que este teste é disponibilizado pelo Ministério da Saúde (MS) para os laboratórios de referência em diagnóstico de LV e um segundo utilizando o teste rápido rK39, que tem sido recentemente sugerido como teste de triagem pelo MS. A análise dos dados demonstrou que o algoritmo para o diagnóstico da LV humana que apresentou melhor desempenho, ou seja, todos os casos foram detectados, foi aquele que utilizou o teste rápido como teste inicial, seguido de FC-AFPA.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 366.pdf: 2881883 bytes, checksum: 041f28bbe2387bf591f544758b2bca29 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Os métodos de diagnóstico sorológico são ainda as ferramentas mais realistas e aplicáveis para identificação de cães com leishmaniose visceral. A pesquisa por métodos sorológicos mais eficientes e de produção simplificada é importante para a identificação do reservatório canino, ação primordial para o controle da doença. Este estudo teve por objetivo o desenvolvimento e a avaliação do desempenho de um ELISA para leishmaniose visceral canina, utilizando como conjugado enzimático uma IgY anti-IgG canina. Para isto, galinhas poedeiras foram imunizadas com IgG canina purificada e a IgY anti-IgG foi isolada das gemas dos ovos por precipitação com polietilenoglicol e purificada por meio de adsorção tiofílica. A especificidade frente ao antígeno imunizante foi verificada por imunodifusão radial dupla, ELISA e western-blot. O ELISA foi desenvolvido utilizando IgY conjugada a enzima peroxidase, tendo seus parâmetros de acurácia avaliados e comparados com o ELISA utilizando IgG de mamíferos conjugada a peroxidase. A concentração total de IgY isolada nas gemas foi constante, sem diferença significativa nos meses analisados (...), com média de 97,55 mg de IgY/ gema. A IgY produzida reconheceu a IgG canina, demonstrando uma forte sensibilidade e especificidade no ELISA, porém na imunodifusão não foi detectada ligação da IgY produzida a IgG canina. Após a imunização, houve um aumento significante da produção de IgY específica do primeiro para o segundo mês (...) onde ocorreu um pico estável sem queda de produção até o final do período analisado (...). A IgY demonstrou ainda, forte reatividade no western-Blot frente a IgG canina purificada e a presente no soro de cão clinicamente saudável, não sendo capaz de reconhecer IgG de outras espécies animais. / A conjugação da IgY a enzima peroxidase ocorreu sem danos à sua estrutura, com discriminação entre as amostras positivas e negativas em todas as diluições do conjugado e concentrações do antígeno testadas. O ELISA utilizando IgY conjugada a peroxidase apresentou 100 por cento de sensibilidade e 100 por cento de especificidade. A comparação dos parâmetros de acurácia do ELISA utilizando IgY com o ELISA utilizando IgG de mamíferos demonstraram valores idênticos. A repetibilidade do ensaio de ELISA IgY foi superior a encontrada com o ELISA IgG, com coeficiente de correlação intraclasse (ICC) estatisticamente significante (...). Um maior agrupamento das amostras negativas e positivas, também verificada quando a correlação das duplicatas nas duas observações foram analisadas (...). Diante de todos esses resultados a IgY ligada à peroxidase demonstrou ser um conjugado enzimático de excelente qualidade, revelando um melhor desempenho quando comparado ao conjugado produzido por mamíferos.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-05-18T15:59:01Z No. of bitstreams: 1 2012_EdvarYuriPachecoSchubach.pdf: 1291703 bytes, checksum: fef36e4b8793edd323eba5d1f25c3009 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-23T11:28:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_EdvarYuriPachecoSchubach.pdf: 1291703 bytes, checksum: fef36e4b8793edd323eba5d1f25c3009 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-23T11:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_EdvarYuriPachecoSchubach.pdf: 1291703 bytes, checksum: fef36e4b8793edd323eba5d1f25c3009 (MD5) / A leishmaniose visceral representa um importante problema em saúde pública para o Brasil, sendo o cão doméstico a principal fonte de infecção para o vetor. O objetivo deste estudo foi validar a técnica de imunocromatografia rápida de duplo percurso para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina em amostras de sangue total e soro de cães. A amostra foi composta por 428 cães domiciliados selecionados por conveniência em dois bairros de uma região endêmica na cidade de Fortaleza, Ceará. De cada cão examinado, foram coletados 5µL de sangue periférico da ponta de orelha para realização do teste rápido em sangue total, 5 mL de sangue da veia jugular para obtenção do soro utilizado na realização do teste em condições de laboratório, além de três fragmentos de pele íntegra da região escapular utilizados para exames parasitológicos. Destes, dois foram acondicionados em solução salina estéril com antibiótico e antifúngico para isolamento de Leishmania em cultura e um em formol 10% tamponado para realização do exame histopatológico e de imunohistoquímica. Os animais positivos em pelo menos um desses três exames foram considerados casos e os negativos nos três exames foram considerados controles ou não-casos. Na avaliação do teste rápido no sangue com leitura visual, no soro com leitura eletrônica e no soro com leitura visual, foram estimadas, respectivamente, sensibilidade de 87,5% (IC95% 66,5 a 96,7), 88% (IC95% 67,5 a 96,8) e 88% (IC95% 67,5 a 96,8) e especificidade de 73,3% (IC95% 67,7 a 78,4), 69,2% (IC95% 63,7 a 74,3) e 68,2% (IC95% 62,2 a 74,3). A concordância entre a leitura visual e eletrônica no soro foi classificada como quase perfeita, índice Kappa = 0,88 (IC95% 0,83 a 0,93). O valor preditivo positivo para 7.9% de prevalência observada na amostra do estudo foi 21.9%. A análise de sensibilidade revelou que o valor preditivo positivo permaneceu abaixo de 50% em cenários com prevalência de 20%. O bom desempenho do teste rápido no sangue com leitura visual sugere que o mesmo possa ser indicado como exame de triagem para uso na rotina de campo e que ferramentas para leitura eletrônica não sejam necessárias para confirmação do resultado, porém seu uso associado a outros testes, utilizando estratégias de testagem sequencial ou paralela em algoritmos específicos deve ser avaliado, assim como a sua comparação formal com os testes atualmente disponíveis na rotina, para aproveitar da melhor maneira possível as facilidades da sua aplicação em condições de campo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Visceral leishmaniasis is a major public health problem in Brazil where the domestic dog is the main source of infection for the vector. The objective of this study was to validate a dual path platform rapid chromatographic immunoassay for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in whole blood and serum samples. The study sample consisted of 428 resident dogs selected by convenience from two districts of an endemic region of the city of Fortaleza, Ceará. Five micro liters of peripheral blood were collected from the tip of the ear to perform the rapid test in whole blood; 5 mL of blood from the jugular vein were collected to obtain serum for testing under laboratory conditions, and three fragments of intact skin from the scapular region were obtained for parasitological examination. Two skin fragments were stored in sterile saline with antibiotics and antifungal agents for isolation of Leishmania in culture and one fragment was stored in 10% buffered formalin for performing the histopathology and immunohistochemistry procedures. Positive animals in at least one of those three parasitological tests were classified as cases and negative animals in all the three tests were considered non-cases. Rapid test sensitivities were 87.5% (CI95% 66,5 to 96,7), 88% (CI95% 67,5 to 96,8%) and 88% (CI95% 67,5 to 96,8); and specificities were 73.3% (CI95% 67,7 to 78,4), 69,2% (CI95% 63,7 to 74,3) and 68,2% (CI95% 62,2 to 74,3) in whole blood submitted to visual reading; serum submitted to electronic reading and serum submitted to visual reading; respectively. The agreement between visual and electronic reading of serum samples was classified as almost perfect, Kappa index = 0.88 (CI95% 0.83 to 0.93). Positive predictive value for a 7.9% prevalence observed in the study sample was 21.9%. Sensitivity analysis revealed that positive predicted value remained below 50% in scenarios of prevalence as high as 20%. The performance of the rapid test in whole blood samples submitted to visual reading suggests that it could be indicated as the screening test for routine use in the field and that tools for electronic reading would be unnecessary to confirm the final result. However, its use in conjunction with other serological assays, using sequential or parallel testing strategies in specific algorithms should be evaluated, as well as its forma comparison with the currently available tests for canine visceral leishmaniasis diagnosis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. ____________________________________________________________________________________________________ / Em atenção aos artigos 11 e 96 da Lei nº 9.279/96 (Lei da Propriedade Industrial) e em consonância com a Resolução CAD 005/2008 da Universidade de Brasília, informamos que o presente trabalho somente foi publicado na data indicada neste informativo. A respectiva defesa, para obtenção do título pretendido, foi realizada na modalidade de sessão fechada, conforme a documentação anexada, de forma que o requisito da novidade, exigida nos referidos artigos da Lei, foi devidamente preservado. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-02T16:09:04Z No. of bitstreams: 1 2016_HerickSampaioMüller_Parcial.pdf: 2537971 bytes, checksum: 0e36706acc171881428e752f4348e1a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-04T20:37:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_HerickSampaioMüller_Parcial.pdf: 2537971 bytes, checksum: 0e36706acc171881428e752f4348e1a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T20:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_HerickSampaioMüller_Parcial.pdf: 2537971 bytes, checksum: 0e36706acc171881428e752f4348e1a4 (MD5) / A leishmaniose é uma antropozoonose que possui diferentes manifestações clinicas, sendo transmitida durante o repasto sanguíneo de flebotomíneos e causada por várias espécies de parasitos do gênero Leishmania. Esta doença causa grandes agravos na saúde humana em escala global, com altas taxas de mortalidade anualmente. Inúmeros fatores de risco impulsionam a transmissão do parasito para áreas anteriormente não endêmicas provocados tanto pelo ser humano quanto por variações naturais do ambiente. O controle da leishmaniose visceral (LV) no Brasil se faz por meio da detecção e eliminação dos reservatórios da doença, controle das populações de vetor, prevenção do contato com vetores infectados e tratamento dos casos humanos. No entanto, essas medidas são aplicadas frequentemente de forma isolada e tem-se mostrado limitadas. Como consequência, observase a manutenção ou mesmo expansão da LV para áreas onde sua ocorrência não era registrada. Nesse contexto, medidas que visem à redução da transmissão e suas aplicações de forma integrada são de fundamental importância, tais como o diagnóstico precoce e com alta sensibilidade dos humanos e dos cães infectados, tratamento eficaz e o emprego de vacinas. O diagnóstico tradicional da LV é baseado na presença de anticorpos anti-Leishmania e o padrão-ouro é a visualização de formas amastigotas do parasito em amostras biológicas. No entanto, a introdução da vacinação de cães nos últimos anos gera a necessidade de novos métodos sorológicos capazes de diferenciar entre animais vacinados e infectados. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a metalopeptidase mitocondrial zinco dependente, secretada de L. infantum como marcador para diagnóstico sorológico de LV. A análise in sílico revelou que a proteína teria 47,35% de resíduos de aminoácidos expondo sua superfície ao solvente e nestas áreas foram encontradas possíveis zonas para epitopos de células B, sítios de glicosilação e fosforilação. A expressão das proteínas em sistemas diferentes possibilitou avaliar a imunogenicidade das proteínas heterólogas com e sem modificações pós-traducionais contra soro de cães infectados e sadios. O resultado do ensaio de ELISA mostrou altos índices de anticorpos específicos contra as proteínas heterólogas e a comparação dos resultados indicou que a proteína heteróloga expressa em modelo procarioto identificou todos os animais infectados nas diluições 1:50 e 1:100 de soro. Os dados estatísticos do teste t mostraram p value < 0.01, dando credibilidade na hipótese de uso desta proteína em possível diagnóstico para LV. O estudo realizado apresenta informações relevantes sobre o uso da metalopeptidase estudada para que possa ser associada ao melhoramento do diagnóstico da LV. Testes para definição da sensibilidade e especifidade fazem-se necessários em futuros trabalhos. / Leishmaniasis is a anthropozoonosis with different clinical manifestations, being transmitted by sandfly during blood feeding and caused by several species of parasites of the genus Leishmania. This disease causes major health problems on a global scale, with high mortality rates annually. Several risk factors drive the transmission of the parasite to areas not previously endemic due to man activities and by natural environmental variations. Control of visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is made through the detection and elimination of disease reservoirs, control of vector populations, preventing contact with infected vectors and treatment of human cases. However, these measures are often applied in isolation and has shown limited 0efficacy. As a result, there is the maintenance or expansion of the VL to areas where their occurrence was not recorded. In this context, measures aimed to reduce transmission and its applications in an integrated manner are of fundamental importance, such as early diagnosis with high sensitivity of humans and infected dogs, effective treatment and the use of vaccines. Traditional diagnosis of VL is based on the presence of anti-Leishmania antibodies and the gold standard is the visualization of amastigote forms of the parasite in biological samples. However, the introduction of vaccination of dogs in recent years creates the need for new serological methods able to differentiate between vaccinated and infected animals. The objective of this study was to evaluate the metallopeptidase zinc dependent secreted from L. infantum, as a marker for serological diagnosis of VL. In silico analysis revealed that the protein had 47.35% of amino acid residues exposed to the solvent, exhibiting on your surface areas for possible B cell epitopes, glycosylation and phosphorylation sites. The expression of proteins in different systems allowed to assess the immunogenicity of the heterologous proteins, with and without post-translational modifications, against sera from infected and healthy dogs. The results of the ELISA assay showed high levels of specific antibodies against heterologous proteins and the comparison of the results shows that heterologous protein expressed in a prokaryotic model was able to differentiate all infected animals at dilutions 1:50 and 1: 100 serum. Statistical analysis emphasize the potential of this protein to be used in diagnosis for VL. The study presents relevant information on the use of metallo-peptidase studied so it can be associated with the improvement of the diagnosis of VL. Tests to define the sensitivity and specificity are made necessary in future work.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T13:27:59Z No. of bitstreams: 1 Segemar PDF Dissertacao_DIP_JosianeValadaoLopes.pdf: 2965756 bytes, checksum: 73c95fa710aaa33622a85777e6d3f780 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T13:28:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Segemar PDF Dissertacao_DIP_JosianeValadaoLopes.pdf: 2965756 bytes, checksum: 73c95fa710aaa33622a85777e6d3f780 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-14T13:28:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Segemar PDF Dissertacao_DIP_JosianeValadaoLopes.pdf: 2965756 bytes, checksum: 73c95fa710aaa33622a85777e6d3f780 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T13:28:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Segemar PDF Dissertacao_DIP_JosianeValadaoLopes.pdf: 2965756 bytes, checksum: 73c95fa710aaa33622a85777e6d3f780 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A proposta deste trabalho foi estudar algumas das variáveis envolvidas na transmissão da leishmaniose visceral (LV) em oito bairros do município de Sabará (MG). Para o levantamento da fauna de flebotomíneos, influência dos fatores climáticos, identificação de repasto sanguíneo e infecção natural por Leishmania, para isso foram realizadas capturas utilizando armadilhas luminosas do tipo HP, tanto no peri como no intradomicílio, nos seguintes bairros: Alvorada, Novo Alvorada, Alvorada Velho, Bom Retiro, Nova Vista, Casa Branca, Rio Negro e Ana Lúcia, no período de janeiro de 2011 a dezembro 2012. Além desses estudos, foram realizados dois inquéritos caninos censitários nos mesmos bairros, nos anos de 2011 e 2012, para o cálculo da taxa de positividade. Para análises parasitológicas e moleculares, foram selecionados aleatoriamente 50 cães soropositivos para os testes de RIFI e ELISA, que foram eutanasiados e necropsiados para obtenção de amostras de pele, linfonodo mesentérico e baço, além de aspirado de medula óssea. Com essas amostras, foram realizados os testes: exame direto (parasitológico), PCR e mielocultura visando confirmar a infecção e identificar a espécie de Leishmania circulante. A fauna flebotomínica foi constituída de quatro espécies, sendo Lutzomyia longipalpis a mais abundante, totalizando 95,0% dos exemplares capturados. Destes, 23,0% foi capturado no intradomicílio. Verificou-se uma tendência no aumento do número de espécimens após o período chuvoso. Das 28 fêmeas ingurgitadas, 67,9% se alimentaram no homem (Homo sapiens) e 25,0% tiveram como fonte alimentar a ave (Gallus gallus). Nove pools foram utilizados para verificar a infecção natural, destes três se apresentaram positivos e, após sequenciamento de DNA, foi observado que a espécie circulante nos vetores foi Leishmania infantum. A taxa média de infecção canina foi de 4,25% em 2011 e 3,34% em 2012. A positividade das amostras (pele, baço, medula e linfonodo) obtidas dos cães soropositivos foi de 100,0% pela PCR, 76,0% pela mielocultura e 66,0% pelo exame parasitológico direto. Entre os quatro tipos de amostras estudadas, o linfonodo foi o tecido que apresentou maior positividade (98,0%). O sequenciamento de DNA das amostras positivas de linfonodo indicou Le. Infantum como sendo a espécie circulante nos cães do município. Após se correlacionarem os casos humanos, caninos e a presença da espécie Lu. longipalpis, encontrada positiva para Le. infantum, pode-se sugerir que os bairros Alvorada e Nova Vista merecem atenção especial como importantes áreas de risco para LV no município. / The purpose of the present study was to investigate some epidemiological aspects related the transmission of visceral leishmaniasis (VL) in eight districts of the town of Sabará, in the Brazilian state of Minas Gerais. We surveyed the local phlebotomine sand fly fauna and the main feeding sources, analyzed the interference of climate variables on the populational fluctuation and verified the rates of natural infection of vector species of VL. The entomological captures were performed with HP light traps, from January 2011 to December 2012, in both intra and peridomiciles of houses located in the following districts of Sabará: Alvorada, Novo Alvorada, Alvorada Velho, Bom Retiro, Nova Vista, Casa Branca, Rio Negro and Ana Lúcia. During our study, the plebotomine sand fly population showed a tendency to increase after the rainy period. Four species of phlebotomine sand flies were present, most of them (95.0%) being Lutzomyia longipalpis. Twenty-three percent of them was captured inside the houses. Amongst 28 engorged females, 67.9% had fed on humans (Homo sapiens) and 25% on chicken (Gallus gallus). Leishmania infantum DNA was genotyped in three of nine pooled samples of Lu. longipalpis. Two canine census surveys were performed in the same districts allowing the calculation of the average positivity rate of canine VL, in each year of study, as 4.25% in 2011 and 3.34% in 2012. Fifty among the seropositive dogs for VL faded to euthanasia were randomly selected for parasitological and molecular analyses of tissues (skin, mesenteric lymph nodes and spleen, as well as bone marrow aspirates). All those samples gave 100% of positivity by PCR, 76% positivity by myeloculture and 66% positivity by direct parasitological examination. The highest overall positivity (98%) was obtained with lymph nodes, where the infecting parasite was also genotyped as L. infantum. The combined analysis of the human and canine cases of VL and the vector population data in Sabará, allow us to suggest that Alvorada and Nova Vista districts deserve special attention as main risk areas of VL in the city.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:01:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 78.pdf: 8994728 bytes, checksum: 69b907a918fd891b88f8ba01c3be666b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Este trabalho buscou avaliar a eficiência do teste rápido SandFly em campo, tendo a PCR como padrão ouro. As coletas e a realização dos testes se deram na Ilha da Marambaia, Estado do Rio de Janeiro, que possui registros de LTA em humanos e LVC. As capturas de flebotomíneos ocorreram utilizando armadilhas luminosas do tipo CDC, que funcionaram entre 19:00 hr e 7:00 hr da manhã seguinte, durante 2 meses consecutivos, Setembro e Outubro de 2014, totalizando 8 coletas em 5 áreas distintas. No total, foram coletados 1505 espécimes de flebotomíneos. Para o diagnóstico de infecção, as fêmeas de cada coleta foram escolhidas ao acaso e separadas em pools de dez; cada pool foi macerado com o tampão de lise e metade de cada amostra foi utilizada nos testes; a outra metade foi encaminhada para realização da PCR. O restante dos flebotomíneos foi encaminhado para identificação de espécies. Nos TRs, 4 resultados foram positivos, 1 em Setembro (amostra A13) e 3 em Outubro (B11, B13 e B14) nos 49 pools analisados, todos sendo fracos. O diagnóstico pela PCR revelou infecção natural por Leishmania em flebotomíneos de 3 áreas na Ilha de Marambaia: Praia Grande, Praia de São José e Praia da Cutuca: 7 resultados positivos (A13, A17, A18, A19, A22, A23 e A24) nas 29 amostras de Setembro e 7 resultados positivos (B01, B02, B05, B06, B09, B13 e B17) nas 19 amostras com fêmeas de Outubro, totalizando 14 resultados positivos. Comparando ao padrão ouro, dos 49 testes realizados: 2 revelaram ser verdadeiros positivos, 33 verdadeiros negativos, 2 falsos positivos e 12 falsos negativos. / Cálculos foram feitos para avaliar a eficiência do TR comparado à PCR: a sensibilidade relativa encontrada foi de 14 por cento e a especificidade relativa de 94,2 por cento. O Valor Preditivo Positivo encontrado foi VPP= 0,50 enquanto o Valor Preditivo Negativo foi VPN= 0,73; a acurácia foi 0,71. Para verificar a concordância entre os testes diagnósticos foi utilizado o índice de concordância de Kappa. Esta concordância foi considerada fraca, com o valor de k= 0,1091 Concluiu-se que apesar do teste rápido SandFly possuir boa especificidade, a sensibilidade deve ser melhorada. Para identificar as espécies de flebotomíneos foi utilizada a nomenclatura de Galati (2003); dentre essas, 6 espécies foram identificadas Nyssomyia intermedia, Migoneimyia migonei, Pintomyia fischeri, Evandromyia edwardsi, Brumptomyia sp. e Micropygomyia capixaba. Cabe ressaltar que as taxas de infecção encontradas foram altas e carecem de mais investigações. A taxa mínima de infecção referente aos dois meses foi de 2,9 por cento e a taxa mínima de infecção em Praia Grande nos dois meses foi de 3,5 por cento. A melhora da sensibilidade do teste rápido e sua validação de campo apontam para um avanço significativo na luta contra as Leishmanioses. / This study aimed to evaluate the efficiency of the Sandfly rapid test in the field considering the PCR as the gold standard. The collections and the tests were performed in Marambaia Island (State of Rio de Janeiro) that has records of Tegumentar Leishmaniasis in humans and Visceral Leishmaniasis in dogs. The collections were performed using CDC light traps from 7 pm to 7 am, for 2 consecutive months - September and October 2014, totaling 8 collections in 5 different areas. A total of 1505 sandflies were collected. Females of each collection were chosen at random and stored in labeled pools of 10 specimens. Each pool was macerated with lysis buffer solution and half of each sample was used in the tests; the other half of the samples was referred for evaluation of infection by Leishmania spp. through PCR. The remaining sandflies were sent for species identification. 4 rapid test results were positive - 1 September (sample A13) and 3 October (B11, B13 and B14) in the 49 analyzed pools and all were weak. Diagnosis by PCR revealed Leishmania natural infection in 3 areas in Marambaia Island: Praia Grande, Praia de São José and Praia da Cutuca. It was 7 positive results (A13, A17, A18, A19, A22, A23 and A24) in 29 samples of September and 7 positive results (B01, B02, B05, B06, B09, B13 and B17) in 19 samples with October females, totaling 14 positive results. Considering PCR as the gold standard, 2 rapid tests results were evaluated as true positives, 33 as true negative, 2 as false positives and 12 as false negatives. Some calculations were performed to evaluate the rapid test efficiency compared to PCR. The relative sensitivity was 14 percent and the relative specificity was 94.2 percent. The Positive Predictive Value was PPV = 0.50 while the Negative Predictive Value was 0.73. The accuracy was 0.71. ^ien / The Kappa agreement index was used to verify the correlation between the diagnostic tests, that was considered weak, with the value of k = 0.1091. It was concluded that despite the Sandfly rapid test has a good specificity the sensitivity needs to be improved. 6 species of sandflies were identified: Nyssomyia intermedia, Migoneimyia migonei, Pintomyia fischeri, Evandromyia edwardsi, Brumptomyia sp. and Micropygomyia capixaba. It is noteworthy that infection rates found were high and require more investigation. The minimum infection rate of the two months was 2.9 percent and the minimum rate of infection in Praia Grande within two months was 3.5 percent. The improvement of the rapid test sensitivity and its field validation points to a significant advance in the fight against Leishmaniasis. (AU)^ien

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2014-08-13T17:59:53Z : No. of bitstreams: 1 000770940.pdf: 1289436 bytes, checksum: 33abe6c9a7b830d30b60ef7e021fa7c2 (MD5) / A leishmaniose visceral canina (LVC), conhecida como leishmaniose visceral americana (LVA) ou calazar é uma antropozoonose, causada pelo protozoário flagelado do gênero Leishmania, com ampla distribuição mundial. No Brasil, o agente responsável pela doença é a Leishmania (Leishmania) chagasi, transmitida pela picada da fêmea do flebotomínio da espécie Lutzomyia longipalpis, e o principal reservatório doméstico é o cão. É uma doença sistêmica grave, de curso lento e crônico, de diagnóstico complexo. Entre as estratégias de controle da LVC está o inquérito sorológico canino, com a eliminação dos cães reagentes, sendo que diferentes técnicas podem ser utilizadas para o diagnóstico desta enfermidade. Muitos avanços têm ocorrido nos últimos anos, mas a respeito dos testes disponíveis para o seu diagnóstico, nenhum apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivos determinar a prevalência de anticorpos para L. chagasi, em 164 cães capturados pelo CCZ de Bauru, SP, área epidêmica para LVC, comparar as técnicas de imunofluorescência indireta, ensaio imunoenzimático (ELISA) e aglutinação direta (DAT); determinar a carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real, a partir da punção de linfonodo poplíteo e de medula óssea; e identificar possíveis variantes genotípicas de Leishmania. spp a partir do sequenciamento e genotipagem, a fim de contribuir para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina, a partir da análise obtida nos diferentes testes, bem como pela avaliação dos sintomas apresentados pelos animais. A sensibilidade apresentada pelas provas DAT e ELISA tendo a RIFI como padrão-ouro foi respectivamente, de 94% e 87%, enquanto a especificidade foi de 28% e 93%. Do total de amostras de sangue, linfonodo e medula óssea submetidas a PCR gênero e espécie- específica, 20 foram positivas somente para gênero, e estas foram sequenciadas ... / The canine visceral leishmaniasis (LCV), known as American visceral leishmaniasis (LVA) or kala-azar is a anthropozoonosis caused by the flagellate protozoan of the genus Leishmania, with worldwide distribution. In Brazil, the agent responsible for the disease is Leishmania (Leishmania) chagasi, transmitted by the bite of the female of the species Lutzomyia longipalpis, and the main reservoir is the domestic dog. It is a severe systemic disease, with chronic and slow course and complex diagnostic. Among the strategies for control of LVC are the canine serological survey, with the elimination of reagents dogs and different techniques can be used to diagnose this disease. Many advances have occurred in recent years, but about the tests available for diagnosis, none had 100% sensitivity and specificity. In this context, this project aimed to determine the prevalence of antibodies to L. chagasi in 164 dogs captured by the CCZ, Bauru, SP, epidemic area for LVC, to compare the techniques of indirect immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA) and direct agglutination (DAT) to determine the parasite burden by PCR in real time from peripheral blood puncture, popliteal lymph node and bone marrow of animals serologically positive, and identify potential genotypic variants of Leishmania. spp. from the sequencing in order to contribute to the diagnosis of canine visceral leishmaniasis, from the analysis obtained for the different tests as well as for assessment of symptoms presented by the animals. The sensitivity shown by DAT and ELISA with IFA as the gold standard were respectively, 94% and 87%, while specificity was 28% and 93%. Of the total sample of blood, lymph node and bone marrow subjected to PCR genus and species-specific, 20 were positive only for gender, and these were sequenced and characterized, yielding cleavage bands profile and common sequences belonging to the species L.donovani complex

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-10T15:51:27Z No. of bitstreams: 1 2017_GiseleLorrannaSilvaSantos.pdf: 4328936 bytes, checksum: 89b09ef90bf026a6818550242065f97b (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-29T20:25:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_GiseleLorrannaSilvaSantos.pdf: 4328936 bytes, checksum: 89b09ef90bf026a6818550242065f97b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-29T20:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_GiseleLorrannaSilvaSantos.pdf: 4328936 bytes, checksum: 89b09ef90bf026a6818550242065f97b (MD5) Previous issue date: 2018-05-29 / A leishmaniose visceral é uma doença negligenciada, endêmica na Ásia, África, Américas e na região do Mediterrâneo. Cerca de 1,5 a 2 milhões de novos casos ocorrem a cada ano no mundo, sendo que aproximadamente 350 milhões estão sob risco de adquirir a doença e esta é responsável por 70 mil mortes anuais. A evolução clínica depende principalmente da resposta imune do hospedeiro. O cão é considerado o principal reservatório urbano do agente Leismania infantum que é transmitido pelo flebotomíneo Lutzomya longipalpis. Várias proteínas de secreção clássica e de superficie da Leishmania foram testadas como potenciais antígenos. Por outro lado, algumas proteínas intracelulares são capazes de modular a resposta imune do hospedeiro por serem mais imunogênicas e terem sofrido menos pressão seletiva evolutivamente. Durante a infecção, estas moléculas são liberadas após a destruição de amastigotas intracelulares por macrófagos ativados, mas, também podem ser excretadas por caminhos de secreção não-clássicos. Vários antígenos intracelulares, tais como proteínas de choque térmico,as proteínas ribossômicas e as histonas foram investigadas como possíveis vacinas contra diferentes espécies de Leishmania e como marcadores diagnósticos. As proteínas Rab1-GTPase e ADF/Cofilina foram surpreendentemente classificadas como potenciais fatores de virulência e moduladores da resposta imunológica, assim como as proteínas intracelulares mencionadas anteriormente. Desta forma, estudos adicionais que venham permitir melhorias nos metodos diagnósticos e que poderão favorecer a prevenção e o controle desta doença, representam uma perspectiva de melhoria da qualidade de vida da população, principalmente em áreas endêmicas. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial imunogênico das proteínas Rab1-GTPase e ADF/Cofilina, expressar e purificar as duas proteinas recombinantes e submetê-las a uma avaliação diagnóstica sorológica pelo metódo ELISA. A proteína Rab1-GTPase apresentou mais sitios possíves para epitopos de células B em relação a ADF/Cofilina. No entanto, a ADF/Cofilina possui poucas regiões conservadas, quando avaliadas pelo alinhamento múltiplo. O teste ELISA permitiu testá-las quanto à capacidade de serem reconhecidas por soro de cães infectados com LVC. Todavia, faz-se necessário aumentar o número de amostras e realizar novos testes que possibilitem determinar a sua sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e a acurácia como alvos diagnósticos da LVC em testes sorológicos. / Visceral leishmaniasis is a neglected disease, endemic in Asia, Africa, the Americas and the Mediterranean region. Approximately 1.5 to 2 million new cases occur every year around the world, with approximately 350 million being at risk of acquiring the disease and accounting for 70,000 annual deaths. The clinical course depends mainly on the immune response of the host. The dog is considered the main urban reservoir of the agent Leismania infantum which is transmitted by the sandfly Lutzomya longipalpis. Several classical and surface secretory proteins of Leishmania were tested as potential antigens. On the other hand, some intracellular proteins are able to modulate the immune response of the host because they are more immunogenic and have suffered less selective pressure evolutionarily. During infection, these molecules are released after the destruction of intracellular amastigotes by activated macrophages, but they may also be excreted by non-classical secretory pathways. Several intracellular antigens, such as heat shock proteins, ribosomal proteins and histones were investigated as possible vaccines against different Leishmania species and as diagnostic markers. Rab1GTPase and ADF/Cofilin proteins were surprisingly classified as potential virulence factors and modulators of the immune response, as well as the intracellular proteins mentioned above. In this way, additional studies that allow improvements in the diagnostic methods and that may favor the prevention and control of this disease represent a perspective of improving the quality of life of the population, especially in endemic areas. Thus, the objective of this study was to evaluate the immunogenic potential of the Rab1-GTPase and ADF/Cofilin proteins, to express and purify the two recombinant proteins and to submit them to a serological diagnostic evaluation by the ELISA method. The Rab1-GTPase protein showed more possible sites for B cell epitopes compared to ADF/Cofilin. However, ADF/Cofilin has few conserved regions when evaluated by multiple alignment. The ELISA test allowed them to be tested for serum recognition of LVC-infected dogs. However, it is necessary to increase the number of samples and perform new tests to determine their sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and accuracy as LVC diagnostic targets in serological tests

Orientador: Hélio Langoni / Coorientador: Rodrigo Costa da Silva / Banca: Simone Baldini Lucheis / Banca: Cassiano Victoria / Banca: Virgínia Bodelão Richini Pereira / Resumo: A leishmaniose visceral canina (LVC), conhecida como leishmaniose visceral americana (LVA) ou calazar é uma antropozoonose, causada pelo protozoário flagelado do gênero Leishmania, com ampla distribuição mundial. No Brasil, o agente responsável pela doença é a Leishmania (Leishmania) chagasi, transmitida pela picada da fêmea do flebotomínio da espécie Lutzomyia longipalpis, e o principal reservatório doméstico é o cão. É uma doença sistêmica grave, de curso lento e crônico, de diagnóstico complexo. Entre as estratégias de controle da LVC está o inquérito sorológico canino, com a eliminação dos cães reagentes, sendo que diferentes técnicas podem ser utilizadas para o diagnóstico desta enfermidade. Muitos avanços têm ocorrido nos últimos anos, mas a respeito dos testes disponíveis para o seu diagnóstico, nenhum apresenta 100% de sensibilidade e especificidade. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivos determinar a prevalência de anticorpos para L. chagasi, em 164 cães capturados pelo CCZ de Bauru, SP, área epidêmica para LVC, comparar as técnicas de imunofluorescência indireta, ensaio imunoenzimático (ELISA) e aglutinação direta (DAT); determinar a carga parasitária pela técnica de PCR em tempo real, a partir da punção de linfonodo poplíteo e de medula óssea; e identificar possíveis variantes genotípicas de Leishmania. spp a partir do sequenciamento e genotipagem, a fim de contribuir para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina, a partir da análise obtida nos diferentes testes, bem como pela avaliação dos sintomas apresentados pelos animais. A sensibilidade apresentada pelas provas DAT e ELISA tendo a RIFI como padrão-ouro foi respectivamente, de 94% e 87%, enquanto a especificidade foi de 28% e 93%. Do total de amostras de sangue, linfonodo e medula óssea submetidas a PCR gênero e espécie- específica, 20 foram positivas somente para gênero, e estas foram sequenciadas ... / Abstract: The canine visceral leishmaniasis (LCV), known as American visceral leishmaniasis (LVA) or kala-azar is a anthropozoonosis caused by the flagellate protozoan of the genus Leishmania, with worldwide distribution. In Brazil, the agent responsible for the disease is Leishmania (Leishmania) chagasi, transmitted by the bite of the female of the species Lutzomyia longipalpis, and the main reservoir is the domestic dog. It is a severe systemic disease, with chronic and slow course and complex diagnostic. Among the strategies for control of LVC are the canine serological survey, with the elimination of reagents dogs and different techniques can be used to diagnose this disease. Many advances have occurred in recent years, but about the tests available for diagnosis, none had 100% sensitivity and specificity. In this context, this project aimed to determine the prevalence of antibodies to L. chagasi in 164 dogs captured by the CCZ, Bauru, SP, epidemic area for LVC, to compare the techniques of indirect immunofluorescence, enzyme immunoassay (ELISA) and direct agglutination (DAT) to determine the parasite burden by PCR in real time from peripheral blood puncture, popliteal lymph node and bone marrow of animals serologically positive, and identify potential genotypic variants of Leishmania. spp. from the sequencing in order to contribute to the diagnosis of canine visceral leishmaniasis, from the analysis obtained for the different tests as well as for assessment of symptoms presented by the animals. The sensitivity shown by DAT and ELISA with IFA as the gold standard were respectively, 94% and 87%, while specificity was 28% and 93%. Of the total sample of blood, lymph node and bone marrow subjected to PCR genus and species-specific, 20 were positive only for gender, and these were sequenced and characterized, yielding cleavage bands profile and common sequences belonging to the species L.donovani complex / Mestre

Orientador: Hélio Langoni / Coorientador: Marcia Almeida Melo / Banca: Rodrigo Costa da Silva / Banca: Virginia Bodelão Richini Pereira / Resumo: A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose que acomete canídeos, constituindo-se um grave problema de saúde pública, tendo em vista que é o cão a principal fonte de infecção da doença para humanos no ciclo doméstico. A proximidade do cão tem sido referenciada como um importante fator de risco para a doença. É endêmica em diversas regiões do Brasil, incluindo o Estado da Paraíba. Em Campina Grande-PB, no período de dezembro de 2011 a fevereiro de 2012 foi realizado inquérito soroepidemiológico para Leishmania spp. em cães por meio de sorologia e pesquisa do DNA do parasita pela biologia molecular, enfocando a sua distribuição geográfica e correlacionando os fatores de riscos e socioeconômicos. Dos 391 cães estudados, 33% apresentaram resultado positivo para a pesquisa de anticorpos para leishmania spp. na RIFI e 4,34% ao ELISA, e 2% para a pesquisa de DNA do parasita no sangue pela PCR. Houve diferença estatística significante para contactantes (P=0,02) e (OR=4,1). A RIFI com antígeno de L. major, mostrou-se como um bom teste confirmatório, podendo ser utilizado como contra prova do ELISA, que apresentou sensibilidade de 39,4%. A associação entre os dois testes e a co-positividade foi de apenas 52%, necessitando de outra prova confirmatória. Já para a confirmação de negatividade na RIFI, o ELISA foi considerado seguro, apresentando um índice de 96,7%. O uso da PCR de sangue total apresentou baixa sensibilidade e baixa concordância com a RIFI, não sendo indicado como teste primário e mostrou-se eficiente na contra prova. Os estudos mostram que a LVC tem-se adaptado à zona urbana, portanto de forma endêmica, concluindo-se que a diversidade de provas diagnósticas, melhora a detecção de animais positivos, aspecto excelente para o controle da LVC em determinadas áreas, além de evitar a eutanásia de cães falsos positivos / Abstract: The Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is a canidae zoonosis, which infects dogs and other mammals, as humans, becoming a serious public health problem, owing the fact that dogs are the main source infection disease for human on domestic cycle. The closeness to dogs has been referenced as an important disease risk factor. This illness is endemic in several regions from Brazil, including the Paraiba state. In the period of December 2011 to February 2012, in Campina Grande, Paraiba, was conducted a seroepidemiological survey to Leishmania spp. in dogs, through serology study and research from the DNA of the parasite by the molecular biology. This study had a focus on the geographical distribution, correlating the socioeconomic and risk factors. From the 391 studied dogs, 33% showed a positive result to antibodies of Leishmania spp. by IFAT test, 4.34% by ELISA and 2% by PCR with detection of the parasite DNA in the animal blood. There was significant statistical difference to contactants (P = 0.02) and (OR = 4.1). The IFAT with L. major antigen, proved to be a proper confirm test that could be used as counterproof to ELISA test, which presented 39.4% of sensitivity. The combination of these two tests and its co-positivity was only 52%, which required another confirmatory test. However, for the negativity confirmation of IFAT, the ELISA test was considered reliable, with a 96.7% index. The use of PCR with total blood, showed low agreement and sensitivity with IFAT test, therefore not indicated as primary test, however efficient as counterproof. This research shown that CVL has adapted to urban areas, thus as endemic form and it concludes that a variety of diagnostic tests improves the detection of positive animals, becoming an excellent aspect to CVL control in certain areas, besides preventing euthanasia of false positives dogs / Mestre