La leishmaniosi canina és una zoonosi causada pel paràsit Leishmania infantum, sent el gos el principal reservori. És endèmica de la conca Mediterrània, de l'orient Mitjà i d'Amèrica del Sud arribant la prevalença de la infecció en aquestes zones al 67%. A més, és una malaltia en expansió ja que recentment s'han descrit casos als Estats Units i Regne Unit.L'objectiu d'aquesta tesi és l'estudi de la base molecular de la resistència i la susceptibilitat a la leishmaniosi visceral canina (CVL) des de dues vessants diferents, l'estudi del polimorfisme de 12 gens candidats i el MHC de classe II i el perfil immunològic en l'establiment de la infecció i en la posterior evolució de la malaltia.S'han caracteritzat 22 nous SNPs pel gen Slc11a1, que està involucrat en la primera barrera de defensa de l'organisme contra els paràsits, a part de tenir múltiples efectes pleotròpics que influencien la resposta immunitària posterior. Un estudi cas-control format per 164 gossos de 19 races, on s'han analitzat 24 polimorfismes per aquest gen, ens ha permès identificar 3 SNPs significatius: A4549G localitzat a l'intró 6, C4859T localitzat a l'exó 8 i C8542T localitzat a l'intró 13, corroborant la implicació d'aquest gen en la CVL.Com a conseqüència d'un treball en col·laboració amb el Centre for Integrated Genomic Medical Research (CIGMR) (Universitat de Manchester) s'ha caracteritzat la regió MHC de classe II i s'han genotipat 97 SNPs en 11 gens candidats relacionats amb la resposta immunitària: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 i VDR (Vitamin D Receptor). El polimorfisme d'aquests gens candidats s'han analitzat en una població de 36 gossos de races que tenen una elevada prevalença de la malaltia. S'han identificat dos al·lels associats a susceptibilitat a la CVL, l'al·lel DQB1*02301 i l'al·lel DRB1*01502, tot corroborant per aquest darrer l'associació prèviament descrita. Aquests dos al·lels es troben en el mateix haplotip en la raça boxer, raça on també s'ha identificat un al·lel que només es troba en els animals control, DRB1*01301. A partir de l'anàlisi dels 11 gens candidats hem identificat 3 SNPs significativament associats a CVL: 1 SNP localitzat en la regió 3' flanquejant de la IL-6 (20R191) i 2 SNPs localitzats en l'intró 7 del gen VDR (13M453 i 15S439) suggerint un paper rellevant d'aquests gens en la CVL.Tots aquests gens candidats han estat genotipats en una població de podencs eivissencs, raça considerada com a resistent. Els resultats obtinguts, confirmen que aquesta raça té una base genètica pròpia que probablement configura la seva particular resistència a la malaltia. S'han identificat nous al·lels pel MHC-II (DRB1*06901 i DQB1*04801) i haplotips específics pel gen Slc11a1. Per l'anàlisi del perfil immunològic en la infecció per Leishmania infantum s'ha dut a terme un estudi d'expressió de citocines (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-γ, TNF-α i TGF-β) mesurades mensualment durant un any en 6 beagles d'infecció experimental que van presentar una diferent progressió de la malaltia. Els resultats obtinguts en aquest estudi proporcionen nous indicis dels mecanismes immunològics que controlen la progressió de la leishmaniosi canina, que es caracteritza per la producció de citocines Th1 i Th2. En la fase inicial de la infecció una predominant resposta Th2 amb una elevada expressió de IL-4 i IL-13 pot afavorir la replicació del paràsit i la disseminació de la infecció. L'elevada expressió d'IFN-γ durant la fase patent de la infecció està associada a l'augment de la càrrega parasitària i als símptomes clínics. A més, és important remarcar l'elevada variabilitat de l'expressió gènica durant la preinfecció que dificulta l'establiment d'uns nivells de referència d'expressió basal per aquestes citocines.Els resultats d'aquesta tesi corroboren el paper dels gens Slc11a1 i DRB1 amb la leishmaniosi visceral canina i evidencien nous gens candidats relacionats amb la malaltia, reafirmant la base genètica de la resistència/susceptibilitat de l'hoste; a més, aporten informació del perfil de diferents citocines en la infecció per Leishmania infantum. / La leishmaniosis canina es una zoonosis causada por el protozoo Leishmania infantum y el perro es considerado el principal reservorio del parasito. Es una enfermedad endémica de la cuenca Mediterránea, Oriente medio y Sudamérica y la prevalencia en estas zonas llega al 67%. Además es una enfermedad en expansión ya que recientemente se han descrito casos en Estados Unidos y en Reino Unido.El objetivo de esta tesis es el estudio de la base molecular de la resistencia y la susceptibilidad a la leishmaniasis visceral canina (CVL) a partir de dos aproximaciones distintas, el estudio del polimorfismo en 12 genes candidatos y el MHC de clase II y el perfil inmunológico en el establecimiento de la infección y en la posterior evolución de la enfermedad.Se han caracterizado 22 nuevos SNPs para el gen Slc11a1, que está involucrado en la primera barrera de defensa contra los parásitos. Un estudio caso-control formado por 164 perros de 19 razas, donde se han analizado 24 polimorfismos para este gen, nos ha permitido identificar 3 SNPs significativos: A4549G localizado en el intrón 6, C4859T localizado en el exón 8 y C8542T localizado en el intrón 13, corroborando la implicación de este gen en la CVL.Gracias a un trabajo en colaboración con el Centre for Integrated Genomic Medical Research (Universidad de Manchester) se ha caracterizado la región del MHC de clase II y se han genotipado 97 SNPs en 11 genes candidatos relacionados con la respuesta inmune: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 y VDR (Vitamin D Receptor). El polimorfismo de estos genes se ha analizado en una población de 36 perros pertenecientes a razas que presentan una elevada prevalencia para la enfermedad.Se han identificado dos alelos asociados a susceptibilidad a la CVL, el alelo DQB1*02301 y el alelo DRB1*01502, corroborándose para este último la asociación descrita previamente. Estos dos alelos forman parte del mismo haplotipo en la raza boxer, raza en la que también se ha identificado un alelo que solo se encuentra en los animales controles, DRB1*01301. A partir del análisis de los 11 genes candidatos hemos identificado 3 SNPs significativamente asociados a CVL: 1 SNP localizado en la región 3' flanqueante de la IL-6 (20R191) y 2 SNPs localizados en el intrón 7 del gen VDR (13M453 y 15S439) sugiriendo un papel relevante de estos genes en la CVL.Todos estos genes candidatos han sido genotipados en una población de podencos ibicencos, raza considerada resistente a la leishmaniosis. Los resultados obtenidos confirman que esta raza tiene una base genética propia que probablemente configura su particular resistencia a la enfermedad. Se han identificado nuevos alelos para el MHC-II (DRB1*06901 y DQB1*04801) y haplotipos específicos para el gen Slc11a1. Para el análisis del perfil inmunológico en la infección por Leishmania infantum se ha llevado a cabo un estudio de expresión de citoquinas (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-γ, TNF-α y TGF-β), analizadas mensualmente durante un año, en beagles de infección experimental que presentaron diferencias en la progresión de la enfermedad. Hemos observado que en la fase inicial de la infección una predominante respuesta Th2 con una elevada expresión de IL-4 y IL-13 puede favorecer la replicación del parásito y la diseminación de la infección. La elevada expresión de IFN-γ durante la fase patente de la infección está asociada con el aumento de la carga parasitaria y a los síntomas clínicos. Además, es importante remarcar la elevada variabilidad de la expresión génica durante la pre-infección, dificultando el establecimiento de niveles de referencia de la expresión basal de estas citoquinas.Los resultados de esta tesis corroboran el papel de los genes Slc11a1 y DRB1 en la leishmaniosis visceral canina y ponen en evidencia nuevos genes candidatos relacionados con la enfermedad, reafirmando la base genética de la resistencia/susceptibilidad en el huésped; además, aportan información del perfil de diferentes citoquinas en la infección por Leishmania infantum. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis caused by Leishmania infantum. The dog is considered the main peridomestic reservoir of the parasite. CVL is endemic in the Mediterranean basin, Middle East, and South America and the prevalence of Leishmania infection can reach 67% in these areas. Moreover, leishmaniasis is emerging within non endemic areas such as North America and the United Kingdom. Leishmaniasis is thus increasingly becoming an important concern both from human public health and animal welfare perspectives.The aim of the present study is to insight into the molecular mechanisms of the resistance and susceptibility to CVL. Analyzing the polymorphism in 12 candidate genes and for the MHC class II region and by evaluating the immunological profile during the establishment of the infection and the progress of the disease. We have characterized 22 new SNPs in the Slc11a1 gene, which is involved in the first step of defense against the parasites and it is known for its multiple pleiotropic effects influencing the immune response. A total of 24 polymorphisms of the Slc11a1 gene have been typed in 164 dogs from 19 different breeds and we have discovered significant associations with CVL for 3 SNPs: A4549G in intron 6, C4859T in exon 8 and C8542T in intron 13, corroborating the role of this gene in CVL.In collaboration with the Centre for Integrated Genomic Medical Research (CIGMR) (University of Manchester) we have genotyped the MHC class II region and a panel of 97 SNPs from 11 candidate genes related with the immune response: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 and VDR (Vitamin D Receptor). Polymorphism at these genes has been analyzed in a breed-matched case-control study of 36 dogs of 4 different breeds known to be predisposed to CVL.We have identified two susceptibility alleles for CVL, the allele DQB1*02301 and allele DRB1*01502, corroborating for this allele the association previously described. These two alleles were found in the same haplotype in the boxer breed. Moreover, we have identified an allele (DRB1*01301) only in the control animals of this breed. Data analyses for the 11 candidate genes have revealed that 3 SNPs were significantly associated to CVL: 1 SNP identified in the 3' flanking region of IL-6 (20R191) and 2 SNPs identified in intron 7 of VDR gene (13M453 and 15S439), suggesting the role of these candidate genes on CVL.All these candidate genes have been genotyped in a cohort of Ibizan Hounds as a resistant breed. Data analysis confirms a specific genetic background for this breed that probably contributes to the resistance to CVL. New alleles for the MHC class II (DRB1*06901 and DQB1*04801) and specific haplotypes for the Slc11a1 gen have been identified.To evaluate the immunological profile associated to Leishmania infantum infection we have performed a cytokine gene expression study (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-γ, TNF-α and TGF-β) monthly during one year follow-up in six experimentally infected beagle dogs that presented different progression of the illness. Our results contribute to the knowledge of the pathogenesis of canine visceral leishmaniasis, which is marked by a balance production of Th1 and Th2 cytokines. In the first stage of infection a predominant Th2 response with an early IL-4 and IL-13 expression could favours parasite survival and the spread of the infection. A higher late IFN-γ expression is associated with the increase of parasite load and clinical status. Moreover, the high variability of expression during the pre-infection stage difficult the establishment of reference basal levels for these cytokines.The results of this study corroborate the role of the genes Slc11a1 and DRB1 in canine visceral leishmaniasis and provide new candidate genes related with the disease, further confirming the importance of host genetics in resistance/susceptibility to infectious disease. Moreover, they provide information of the cytokine profile in Leishmania infantum infection.

Diversos trabajos sobre la leishmaniosis canina han demostrado que el perfil clínico de esta infección es variable, yendo desde formas asintomáticas hasta patologías graves polisintomáticas y desde una evolución con cura espontánea a una resolución fatal, en función de la respuesta inmune que desarrolle el animal a lo largo de la infección.Se ha observado que existe un gran número de perros seropositivos asintomáticos, algunos de los cuales se encuentran en la fase prepatente de la infección, otros en la regresiva y un tercer grupo de animales que presentan formas crípticas, sin manifestar síntomas durante varios años y con una respuesta de anticuerpos baja situada alrededor del umbral de positividad. Ésta es una zona considerada gris en la que coinciden las reacciones cruzadas y las inespecificidades de la técnica. En estos casos, las técnicas serológicas convencionales no distinguen si se trata de animales infectados o no, ni diferencian las fases de la enfermedad en la que se encuentran. Con el objetivo de determinar la utilidad de diferentes técnicas parasitológicas, inmunológicas y moleculares para detectar estas leishmaniosis caninas crípticas se han aplicado varias pruebas diagnósticas a un grupo de perros de zonas endémicas para esta zoonosis. Se ha observado que las técnicas inmunológicas convencionales no discriminan claramente entre animales infectados y no infectados, sino que son los métodos parasitológicos y la PCR los que ofrecen resultados más fiables.También se ha determinado la expresión de IgG, IgG1, IgG2 e IgE específicas anti-Leishmania durante distintas fases de la infección para determinar su relación con la evolución de la infección, la respuesta al tratamiento y su valor pronóstico, viendo que las IgG1 y las IgE son marcadoras de leishmaniosis canina activa y que el nivel de IgG2 está directamente relacionado con la presencia de desórdenes patofisiológicos en los animales.Se ha analizado la expresión idiotípica de IgG1 e IgG2, frente a las diferentes fracciones del antígeno de Leishmania con el objetivo de usarlas como marcadoras de estadio y de evolución en la leishmaniosis canina. Se ha observado que las fracciones polipeptídicas de bajo peso molecular 14, 16 y 18 kDa para IgG1 y 14 y 16 kDa para IgG2 se expresan precozmente en perros infectados por L. infantum, lo que permite detectar diagnósticos falsos negativos mediante pruebas parasitológicas y moleculares en las fases tempranas de la infección, fundamentalmente por parte de las IgG1.Se ha determinado el significado clínico y diagnóstico de la excreción mediante la orina de anticuerpos frente a Leishmania por parte de perros infectados y se ha observado que la presencia de anticuerpos en la orina es debida mayoritariamente a un fallo del filtrado glomerular y, en menor medida, a una producción local de anticuerpos.A pesar de que el perro es el principal reservorio peridoméstico en la zona mediterránea, estudios de epidemiología molecular indican que existe una variabilidad genética de cepas de Leishmania superior a la que se encuentra al analizar las cepas presentes en el perro, por lo que se sospecha que otras especies animales pueden actuar como reservorio. Por ello, se planteó un estudio seroepidemiológico de la leishmaniosis felina para determinar la extensión de esta infección en nuestro entorno. La alta seropositividad encontrada, junto con el patrón de fracciones proteicas revelado por el western blot indican que el gato actúa como verdadero reservorio de la leishmaniosis y no como un hospedador accidental, tal como se venía considerando hasta ahora. / Studies about canine leishmaniosis show that clinic profile of this disease is variable, going from asymptomatic forms to sever pathology, and from spontaneously cure to fatal resolution. Seroepidemiological studies have revealed a large number of asymptomatic seropositive animals. Follow-up of these animals shows that some of them are in the prepatent infection period, others have regressive forms of the disease and others maintain low levels of antibodies without developing the disease for years. The low humoral immunoresponse characteristic of asymptomatic animals frequently places their antibody levels at the borderline of detectability where serological techniques don't discriminate between infected and noninfected animals. To determine the utility of different parasitology, immunology and molecular techniques to detect canine leishmaniosis, we applied various diagnostic methods for dogs from endemic areas and observed that antibody detection are not suitable tools to discriminate infected and noninfected animals, and parasitological methods and PCR offer more accurate results.The study of the level of specific IgG, IgG1, IgG2, and IgE in different phases of infection reveled that IgG1 and IgE are considered markers of the active disease and IgG2 expression is related to pathophysiological disorders.The idiotype expression of IgG1 and IgG2 was analyzed to detect markers related to infection, and to early phases of disease. The early Leishmania infantum infection is characterized by the recognition of polypeptide fractions of low molecular weight, mainly fractions of 14, 16 and 18 kDa by IgG1 and 14 and 16 kDa by IgG2.We have investigate the presence of anti-Leishmania antibodies in the urine of dogs with leishmaniosis and have determined that the presence of these antibodies is mainly caused by the passage into the urinary tract of blood-derived immunoglobulins and, to a lesser extent, by the local production.Dog is the main peridomestic reservoir for leishmaniosis caused by L. infantum, but some studies of molecular epidemiology show a great genetic variability. The study of feline leishmaniosis in Northwestern Mediterranean shows that specific antibodies are prevalent in cats from these ecoregions. So, it could be hypothesized that cats are a secondary reservoir host rather than simply incidental one.