O cristalino se origina de um epitélio simples e cuboidal que recobre a vesícula óptica. Neste estádio, os filamentos de actina são distribuídos ao longo do eixo apicobasal. As células do ectoderma pré- placodal, em contato com a vesícula óptica, formam um epitélio pseudoestratificado, chamado de placóide do cristalino, com acúmulo de actina no domínio apical. Nós propusemos estudar o papel da proteína PAR3 e sua fosforilação no estabelecimento de actina apical. A superexpressão de PAR3 no placóide forma pontos ectópicos de PAR3 na membrana baso-lateral e induz o recrutamento de actina ectópica para esses pontos. O recrutamento de actina e aPKC ectópicos é independente do estado de fosforilação da treonina 833, resíduo localizado no domínio de ligação do PAR3 ao aPKC. Além disso, no ectoderma peri-placoidal, onde a actina localiza-se baso-lateralmente, PAR3 induz o recrutamento ectópico de actina apical e esse recrutamento é independente da fosforilação da treonina 833. Esses dados nos sugerem que PAR3 é suficiente para recrutar actina no placóide do cristalino. / The lens originates from a simple cuboidal epithelium that overlies the optic vesicle. At this stage, the actin filaments are distributed along its apical-basal sides. The pre-placodal ectoderm, in contact with the optic vesicle, forms a pseudostratified tissue, the lens placode, with accumulation of actin network at the apical domain. Here, we focused on the role of the polarity protein PAR3 and its phosphorylation in the establishment of this apical actin network. Overexpression of PAR3 in the lens placode, induced formation of ectopic actin clusters in the basolateral membrane of the lens placode. The formation of these actin clusters, as well as recruitment of aPKC was independent of Threonine 833 phosphorylation at the PAR3 aPKC-binding site. In addition, PAR3 induced ectopic actin networks in the apical membrane of the periplacodal ectoderm independent of the Threonine 833 phosphorylation. Taken together, these data suggest that PAR3 is sufficient for actin recruitment in the lens placode.

O cristalino se origina de um epitélio simples e cuboidal que recobre a vesícula óptica. Neste estádio, os filamentos de actina são distribuídos ao longo do eixo apicobasal. As células do ectoderma pré- placodal, em contato com a vesícula óptica, formam um epitélio pseudoestratificado, chamado de placóide do cristalino, com acúmulo de actina no domínio apical. Nós propusemos estudar o papel da proteína PAR3 e sua fosforilação no estabelecimento de actina apical. A superexpressão de PAR3 no placóide forma pontos ectópicos de PAR3 na membrana baso-lateral e induz o recrutamento de actina ectópica para esses pontos. O recrutamento de actina e aPKC ectópicos é independente do estado de fosforilação da treonina 833, resíduo localizado no domínio de ligação do PAR3 ao aPKC. Além disso, no ectoderma peri-placoidal, onde a actina localiza-se baso-lateralmente, PAR3 induz o recrutamento ectópico de actina apical e esse recrutamento é independente da fosforilação da treonina 833. Esses dados nos sugerem que PAR3 é suficiente para recrutar actina no placóide do cristalino. / The lens originates from a simple cuboidal epithelium that overlies the optic vesicle. At this stage, the actin filaments are distributed along its apical-basal sides. The pre-placodal ectoderm, in contact with the optic vesicle, forms a pseudostratified tissue, the lens placode, with accumulation of actin network at the apical domain. Here, we focused on the role of the polarity protein PAR3 and its phosphorylation in the establishment of this apical actin network. Overexpression of PAR3 in the lens placode, induced formation of ectopic actin clusters in the basolateral membrane of the lens placode. The formation of these actin clusters, as well as recruitment of aPKC was independent of Threonine 833 phosphorylation at the PAR3 aPKC-binding site. In addition, PAR3 induced ectopic actin networks in the apical membrane of the periplacodal ectoderm independent of the Threonine 833 phosphorylation. Taken together, these data suggest that PAR3 is sufficient for actin recruitment in the lens placode.

O formato, posição e alinhamento corretos dos componentes oculares são definidos através de uma série de mudanças morfológicas complexas durante sua embriogênese. A retina se origina de células da vesícula óptica do tubo neural enquanto as células precursoras do cristalino surgem do ectoderma que reveste o ápice da vesícula óptica. Este ectoderma é delimitado molecularmente como pre-placoidal, sofre uma série de eventos morfogênicos durante o seu desenvolvimento inicial para formar o placóide do cristalino e, posteriormente, a vesícula do cristalino. O placóide do cristalino surge a partir do espessamento do ectoderma pre-placoidal. Posteriormente, o placóide invagina para formar a vesícula do cristalino. Durante a invaginação do placóide, as células da ectoderme que circundam o placóide (células periplacodais) também se movem para fechar a abertura do cristalino que invaginou e reconstruir o ectoderma da superfície. Aqui, nos concentramos em dois processos do desenvolvimento do olho. Nós investigamos o papel da matriz extracelular no espessamento do placóide do cristalino e a dinâmica da emissão de protrusões de membrana pelas células periplacodais durante a invaginação do placóide. A matriz extracelular desempenha papel relevante na morfogênese placodal. Por exemplo, a Fibronectina na matriz extracelular entre a vesícula óptica e o ectoderma pré-placoidal é necessária para a formação de placóide do cristalino. No entanto, a dinâmica da arquitetura de Fibronectina durante a formação do placóide é desconhecida. Assim, nosso primeiro objetivo aqui foi investigar a arquitetura da Fibronectina e da Laminina, dois importantes componentes da matriz extracelular, durante o espessamento do placóide do cristalino através de imagens confocais em 3D. Nossos dados sugerem que um padrão de Fibronectina e Laminina difuso e pontuado é restrito à região do placóide. Este padrão é mantido durante o espessamento e invaginação do placóide. Encontramos um padrão similar de Laminina na região do placóide de embrião de camundongo, sugerindo a conservação desta arquitetura neste contexto. Também demonstramos que a inibição mediada por Noggin (inibidor da sinalização de BMP), que interrompe o desenvolvimento do olho, afeta a organização da Fibronectina e da Laminina, sugerindo que a sinalização de BMP regula a organização da matriz extracelular durante o desenvolvimento do placóide do cristalino. Nosso segundo objetivo foi analisar a emissão de 5 protrusões celulares finas por células periplacodais correlacionando com o movimento de invaginação. Aqui, nós investigamos a dinâmica e composição do citoesqueleto dessas protrusões para entender sua função durante o desenvolvimento do olho. Observamos uma grande quantidade de protrusões em células periplacodais de embriões de galinha e de camundongo. Nossos resultados de quantificação com protrusões de embriões de galinha não mostraram correlação entre comprimento e direção de emissão ou com meia-vida. Nós também analisamos a diversidade na composição do citoesqueleto, uma vez que encontramos protrusões positivas para Cofilina e Tubulina. Estes dados sugerem uma população heterogênea de protrusões finas de membrana periplacodais. Finalmente, também identificamos essas protrusões em outras superfícies ectodérmicas de embriões de galinha e de camundongo, sugerindo que elas desempenham um papel no desenvolvimento de ectoderme superficial. / The correct shape, position and alignment of optic components are defined through a series of complex morphological changes during the embryogenesis of the eye. The retina originates from the neural tube´s optic vesicle while the lens precursor cells arise from the ectoderm that overlie the apex of the optic vesicle. This ectoderm is molecularly delimited as preplacodal and undergoes a series of morphogenic events during its initial development to form the lens placode and subsequently the lens vesicle. The lens placode arises from the thickening of the pre-placodal ectoderm. Subsequently, the placode invaginates to form the vesicle of the lens. During the invagination of the placode, the ectodermal cells that surround the placode (peri-placodal cells) also move to close the opening of the lens that invaginated and reconstruct the surface ectoderm. Here we focus on two processes of eye development. We investigated the role of the extracellular matrix in the lens placode thickening and the dynamics of the emission of membrane protrusions by the peri-placodal cells during the lens placode invagination. The extracellular matrix plays a relevant role in placodal morphogenesis. For example, Fibronectin in the extracellular matrix between the optic vesicle and the preplacodal ectoderm is required for the formation of lens placode. However, the dynamics of the Fibronectin architecture during placode formation is unknown. Thus, our first aim here was to investigate the architecture of Fibronectin and Laminin, two important components of the extracellular matrix, during thickening of lens placode through confocal 3D images. Our data suggest that both Fibronectin and Laminin present a diffuse and punctate pattern restricted to the placodal region. This pattern is maintained during thickening and invagination of the placode. We found a similar pattern of Laminin in the placodal region of the mouse embryo, suggesting the conservation of this architecture in this context. We also demonstrate that Noggin-mediated inhibition of BMP signalling, which disrupts the development of the eye, affects the organization of Fibronectin and Laminin, suggesting that BMP signalling regulates the organization of the extracellular matrix during the lens placode development. Our second objective was to analyse the emission of thin cellular protrusions by peri-placodal cells correlating with the lens invagination movement. Here we investigated the dynamics and 3 composition of the cytoskeleton of these protrusions to understand their function during the development of the eye. We observed a large number of protrusions in peri-satellite cells of chicken and mouse embryos. Our quantification results with chicken embryo protrusions showed no correlation between length and direction of emission or with half-life. We also analysed the diversity in the composition of the cytoskeleton, and we found protrusions positive for Cofilin and Tubulin. These data suggest a heterogeneous population of periplacodal protrusions. Finally, we have also identified these protrusions on other ectodermal surfaces of chicken and mouse embryos, suggesting that they play a role in the development of surface ectoderm.