Orientadores: Sergio Marangoni, Maria Ligoa Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_SilvanaCristina_D.pdf: 10029993 bytes, checksum: ad9db9a8d51acb16d319ba5e9f510538 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Os objetivos deste trabalho foram purificar e caracterizar bioquimicamente uma lectina e determinar a estrutura primária de um inibidor de serinoproteinases tipo Kunitz de sementes da espécie D. regia (Leguminosae-Caesalpinioideae) e também verificar o efeito in vitro do inibidor sobre a atividade das enzimas digestivas dos insetos lepidópteros A. kuehniella e C. cephalonica. Para a purificação da lectina e do inibidor de serinoproteinases, as sementes foram trituradas e a farinha foi submetida a uma extração salina 10%. Após centrifugação, o sobrenadante (extrato total) foi dialisado, liofilizado e aplicado em colunas de exclusão molecular, troca iônica e coluna de fase reversa C18 em sistema de HPLC. As frações eluídas foram monitoradas a 280 nm de absorbância. A lectina e o inibidor purificados foram designados como DRL (Delonix regia lectin) e DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectivamente. Após a identificação e purificação, a lectina foi analisada em SDS-PAGE 12,5%, revelando que esta proteína tem massa molecular aparente de 12 kDa sob condições redutoras (DTT 0,1 M) e não redutoras. O gel nativo revelou que DRL é uma proteína constituída por apenas uma cadeia polipeptídica. Os testes de inibição da atividade hemaglutinante foram realizados com eritrócitos de ratos, utilizando-se os seguintes açúcares: D-glicose, D-glicosamina, D-frutose, D-manose, D-sacarose, D-galactose, D-galactosamina, D-rafinose, Dlactose e D-maltose e verificamos que a atividade hemaglutinante de DRL foi inibida mais especificamente por glicose a uma concentração de 0,048 mM, indicando que esta lectina pertence ao grupo glicose-manose. A composição de aminoácidos da lectina mostrou alto conteúdo de ácido aspártico, ácido glutâmico e glicina, mas nenhum resíduo de cisteína foi observado. A determinação da região N-terminal da lectina revelou alta homologia com outras lectinas de leguminosas tais como, con A, lentilha e ervilha. A faixa de pH para a atividade da lectina foi de 8-9 com perda total da sua atividade em faixa de pH ácido (2-4). Além disso, a lectina manteve sua atividade após tratamento térmico a 70°C, durante 30 minutos, com perda de 50% de sua atividade a 100°C. DRL não necessitou de cálcio para sua atividade, mas é dependente de manganês, sugerindo que DRL é uma metaloproteína. O tratamento de DRL com uréia resultou em perda total da AHE, enquanto que na presença do DTT, a lectina manteve sua atividade normal provavelmente devido à ausência de pontes dissulfeto na molécula. A determinação da estrutura primária do DrTI, comprovou que este inibidor pertence à família Kunitz de inibidores de proteinases. A região do sítio reativo possui um resíduo de ácido glutâmico ao invés de arginina ou lisina, mas a molécula apresentou dois "Ioops" compostos por quatro resíduos de cisteína com alta similaridade com outros inibidores tipo Kunitz. Os estudos de inibição in vitro mostraram que, numa concentração de apenas 5J.lg, o DrTI inibiu cerca de 92% da atividade das proteases dos insetos A. kuehniella e C. cepha/onica, indicando alta afinidade do inibidor por estas enzimas. A digestibilidade in vitro do DrTI pelas proteases dos insetos foi analisada em SDS-PAGE 12,5% e revelou que o inibidor foi resistente à proteólise após 72h. Entretanto, a incubação do DrTI com a tripsina bovina resultou em clivagem nos primeiros 30 minutos de reação. A atividade residual máxima do inibidor, após estes ensaios de digestibilidade pelas proteases de A. kuehniella, C. cephalonica e tripsina bovina foi de 69,5%, 64,9% e 34,57%, respectivamente / Abstract: The aims of this work were to purify and to characterize biochemically a lectin and to determine the primary structure of a Kunitz-type serineproteinase inhibitor from seeds of Delonix regia specie (Leguminosae-Caesalpinioideae) and also to verify the in vitro effect of the inhibitor towards to digestive enzymes activities of the lepidoptera insects A. kuehniella and C. cephalonica. For lectin and serine proteinase inhibitor purification, the seeds were tritured and the flour was submitted to saline extraction 10%. After centrifugation , the supernatant (total extract) was dialised, Iyophylized and applied in molecular exclusion, ion exchange and reverse phase C18 HPLC columns. The eluted fractions were monitored by absorbance at 280 nm. The lectin and the inhibitor purified were designated DRL (Delonix regia lectin) and DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectively. After identification and purification, the lectin was analyzed in SDS-PAGE 12.5%, showing that this protein has an apparent molecular mass of 12 kDa under reduced (DTT 0.1 M) and non reduced conditions. Analysis of native gel revealed that DRL is a protein constituted by only one polypeptide chain. The inhibition tests of hemagglutinating activity were realized with rat erytrocytes, using the following sugars: D-glucose, D-glucosamine, D-fructose, Dmannose, D-sucrose, D-galactose, D-galactosamine, D-raffinose, D-Iactose and Dmaltose and we verified that hemagglutinating activity of DRL was more specifically inhibited by glucose at 0.048 mM concentration, indicating this lectin belongs to the glucose-mannose group. The lectin aminoacid composition showed high content of aspartic acid, glutamic acid and glycine, but cysteine residue was not detected. The determination of the N-terminal region of the lectin revealed high homology with other leguminous lectins such as, con A, lentil and pea. The pH range for the lectin activity was 8-9 and DRL lost activity totally in range of acid pH (2-4). Furthermore, the lectin maintained activity after thermal treatment to 70°C, during 30 minutes, with lost of 50% in activity at 100°C. DRL does not require calcium for the activity but is manganese dependent, suggesting that DRL is a metalloprotein. The treatment of DRL with urea resulted in total lost of hemagglutinating activity, while in the presence of DTT, the lectin maintained normal activity probably due absence disulfide bridges in the molecule. The primary structure determination of DrTI, proved that this inhibitor belongs to the Kunitz family of proteinase inhibitors. The region of reactive site presented a glutamic acid residue instead of an arginine or Iysine, but the molecule presented two "loops", composed by four cysteine residues, with high similarity with other Kunitz type inhibitors. The in vitro inhibition studies with insect proteases from A. kuehniella and C. cephalonica showed at concentration of only 5mg, DrTI inhibited about of 92% of the proteases these insects, indicating high affinity of the inhibitor by these enzymes. In vitro digestibility of DrTI by insect proteases was analyzed in SDS-PAGE 12.5% and revealed that the inhibitor was resistant to the proteolysis after 72h. However, the incubation of DrTI with bovine trypsin resulted in cleavage in the first 30 minutes of reaction. The maximal residual activity of the inhibitor, after these digestibility assays by proteases from A. kuehniella, C. cephalonica and bovine trypsin was 69.5%, 64.9% and 34.57%, respectively / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Mohamed E. M. Habib / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T16:30:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia_MariaAlice_M.pdf: 6983134 bytes, checksum: b9732388055cdda70a41ffcc0a2b59e9 (MD5) Previous issue date: 1979 / Resumo: Larvas de S. frugiperda, no presente trabalho, foram submetidas a vários testes para avaliação de suas respostas a inseticidas microbianos e químicos. As larvas de S. frugiperda podem ser consideradas resistentes à ação de B. thuringiensis, tanto quando aplicado isoladamente, como quando em combinações com paration metílico ou piretrina. As possíveis razões da resistência de larvas de S. frugiperda a B. thuringiensis concentram-se em fatores inerentes ao suco gástrico do inseto. Não se deve aconselhar o controle desse noctuídeo por B. thuringiensis. A combinação de piretrina com dosagens subletais de paratiom metílico tem efeito potencializador de mortalidade sobre larvar de S. frugiperda. Populações de S. frugiperda, tanto no campo, como no laboratório, foram afetadas por algumas doenças infecciosas. Essas doenças foram causadas por vírus (VPN), fungo (A. parasiticus) e bactéria (P. aeruginosa). Este fato estimula a recomendação da utilização do vírus no controle e revela a importância de não se perturbar a manifestação natural de fatores bióticos de controle / Abstract: Larvae of Spodoptera frugioera, in the present work, were tested to evaluate their responses to some microbial and chemical insecticides. The larvae of this insect species can be considered as resistant to the action of Cacillus thuringiensis, when applied alone as well as in combinations with parathion or pyrethrum. The resistence of S. frugiperda to B. thuringiensis may be caused by some reasons, all associated with the gastric juice of the insect. B. thuringiensis can not be recommended to the control of S. frugiperda larvae. The combination of pyrethrum with sublethal doses of parathion showed potentiation effect on the larvae. In the field, as well as in the laboratory, populations of S. frugiperda suffered some infectious diseases. These diseases were caused by virus (NPV), fungi (A. parasiticus) and bacteria (P. aeruginosa). This fact stimulates the recomendation to utilize this virus in the control of this insect species, and also shows the importance in protecting the natural biotic mortality factors / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Octavio Henrique de Oliveira Pavan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T16:29:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Garcia-Canedo_AlejandraMariaG_M.pdf: 4619225 bytes, checksum: 161aebc5592898277bfc4cb85606a52f (MD5) Previous issue date: 1989 / Resumo: Dois baculovírus diferentes, o vírus de Granulose de Diatraea saccharalis (VGDs) e o Vírus de Poliedrose Nuclear de Anticarsia gemmatalis (VPNAg), foram inoculados em lagartas de D.saccharalis. Os efeitos da infecção dos dois vírus foram estudadas inoculando-os de maneira isolada, simultânea e alternada. A dose utilizada para ocasionar uma mortalidade semelhante foi 100 vezes maior para o VPNAg cujo hospedeiro original pertence a outra família de Lepidoptera. A alta produção de poliedros e grânulos dos dois vírus, Obtida tanto quando ambos foram inoculados simultaneamente como quando um deles é pré-inoculado, demonstra a inexistência de qualquer tipo de interferência na multiplicação ou desenvolvimento dos vírus no mesmo hospedeiro. O estudo comparativo da infecção desses dois vírus nos tecidos gorduroso e intestinal, através da utilização de microscopia de contraste de fase, mostrou que ambos são capazes de se multiplicar e formar uma grande quantidade de cristais virais em células diferentes do tecido gorduroso, o que indica que a infecção por um vírus modifica a célula de maneira a deixa-la incapaz de permitir uma segunda infecção. No tecido intestinal, no entanto, somente foram encontrados poliedros. A presença do VPNAg em mais de um tecido, e a alta quantidade de cristais formados, muitas vezes maior que a do VGDs, demonstra a sua capacidade de propagar a infecção dentro do inseto uma vez iniciada. Assim sendo, a baixa virulência do VPNAg (verificada pelo alto valor de DL50), parece dever-se à existência de somente alguns variantes genéticos com capacidade para a invasão na população originalmente utilizada. O VGDs e o VPNAg apresentam diferentes períodos de incubação e o período mais curto conferiu uma vantagem, no desenvolvimento, ao VPNAg quando inoculado em indivíduos mais velhos. O tipo de interação obtido, analisando-se os valores de mortalidade larval quando os dois vírus foram inoculados simultaneamente, foi do tipo aditivo, não sendo encontrado efeito sinergístico ou antagônico o que sugere a ação independente de cada vírus. A multiplicação viral no organismo da lagarta parece ser suficientemente veloz de tal forma a evitar que uma segunda inoculação, aplicada 24 horas após a primeira aumente de maneira significativa a mortalidade larval. Assim sendo a quantidade de vírus formados mascararia o efeito da segunda dose viraI. O desenvolvimento dos dois vírus em células do mesmo tecido, que poderia gerar o surgimento de recombinantes genéticos, não foi investigado mais detalhadamente, porém, não se observou o aparecimento de cristais, morfológica ou numericamente diferentes dos utilizados originalmente que pudesse indicar tal acontecimento / Abstract: Two baculoviruses, the Diatraea saccharalis Granulosis Virus (DsGV) and the Anticarsia gemmatalis Nucleopolyhedrosis Virus (AgNPV), were studied infecting the sugarcane borer (SCB), D. saccharalis. The effects of the infecting of these two viruses were analysed by their inoculation simultaneously, sequencially and individually. Being a original virus of the SCB, the DsGV was inoculated in a dose 100 fold smaller than the AgNPV whose original host belongs to a different family of Lepidoptera. Regardless of the inoculation timing being simultaneous or sequencial in one order or the other, a high inclusion body production was observed for both viruses. This type of result discards the possibility of interference between the two pathogens. A comparative study of the infection process of both viruses in the fat body and intestinal tissue, in phase-contrast microscopy, showed their ability to replicate and produce normal inclusion bodies in high amounts in different fat body cells. In the intestinal cells only AgNPV was able to develop and produce polyhedra while no sign of the granules of DsGV were observed. In the fat body, even though neighboring cells were found to bear both types, thus, suggesting some type of inhibitory mechanism. Despite the fact that the AgNPV is developing in an alternate host, thus, having a high LD50 value, once it infects the larvae it is able to develop in a typical infection process. The AgNPV develops in several tissues, producing regular polyhedra in graet amounts, in most cases, more than the capsule production by DsGV. These observations suggest a barrier in host at invasion level being determined by a Iow frequency of genetic variants being able to start infection in the population. The DsGV and AgNPV in the SCB present different infection processes being the AgNPV faster in killing the insect, thus, showing more effectiveness in older larvae. The interaction observed between the two baculoviruses was of the aditive type while no synergism or interference type of effect was observed suggesting independent and non competitive behavior between the two pathogens. As suggested by previous data, the viral replication seems to be fast enough as to eliminate any significant mortality increase by a second inoculation performed after 24 hours following the first inoculum. The simultaneous development of the two different virus in the same individual and same body tissue could result in genetic recombinants. However, further studies should be conducted to confirm these preliminary observations / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Antonio Carlos Busoli / Banca: Arlindo Leal Boiça Junior / Banca: Marcos Doniseti Michelotto / Resumo: Spodoptera cosmioides Walker, 1858 é uma espécie polífaga, resistente a inseticidas em várias regiões do país e, apesar de ocorrer em baixas densidades, é considerada uma praga potencial para as culturas de algodão, soja e feijão no cerrado. Neste trabalho, estudou-se a biologia comparada de S. cosmioides sobre a cultivar transgênica comercial NuOPAL (Bollgard I, Evento 531) e sobre a cultivar convencional DeltaOPAL, procurando-se detectar a influência da α -endotoxina CryIAc no desenvolvimento biológico dessa espécie. O experimento foi desenvolvido em condições de laboratório (26 ± 1ºC; UR: 70 ± 10%; fotofase: 12h), a partir de lagartas recém-eclodidas e individualizadas. Foram avaliadas a duração e a viabilidade das fases imaturas, duração do ciclo biológico, peso de pupas, razão sexual, porcentagem de deformação de adultos e de adultos não liberados dos invólucros pupais, longevidade dos adultos, fecundidade e viabilidade de ovos. Os parâmetros biológicos observados não diferiram significativamente em relação às duas variedades. Na cultivar NuOPAL verificou-se maior porcentagem de ovos inviáveis, de adultos deformados e de adultos não emergidos, o que indica que essa cultivar provavelmente afeta a fase adulta de S. cosmioides. / Abstract: Spodoptera cosmioides Walker, 1858 is a polyphagous species, presents resistance to insecticides in various regions of Brazil, and although it occurs at low densities, it's considered a potencial pest in the crop of cotton, soybeans and beans in the Brazilian cerrado. In this work was studied the comparative biology of S. cosmioides on the comercial transgenic NuOPAL (Bollgard I, Evento 351) and the conventional cultivar DeltaOPAL to detect the influence of endotoxin-α CryIAc on the biological development of this species. The experiment was conducted under specific conditions in a laboratory (26 ± 1º C; RH: 70 ± 10%; photoperiod: 12h), from newlyhatched and individualized larvae. The duration and viability of immature phases and biological cycle, weight of pupae, sex ratio, percentage of deformed adults and adults not released the pupal beg, longevity of adults, fecundity and viability of eggs were evaluated. The biological parameters observed showed that there weren't significant difference between two varieties studied. In NuOPAL cultivar there was a greater percentage of eggs unviable, deformed adults and adults not emerged, which indicates that this cultivar probably affects the adult phase of S. cosmioides. / Mestre

Orientador:, Edson Luiz Lopes Baldin / Coorientador: Leandro do Prado Ribeiro / Banca: Carlos Frederico Wilcken / Banca: Antonio Eduardo Miller Crotti / Resumo: Helicoverpa armigera (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) destaca-se pela grande capacidade de dispersão, hábito polífago e por ocasionar expressivos danos em culturas de interesse econômico em todo o mundo. Dentre os métodos de manejo de insetos-praga, o uso de derivados vegetais é considerado uma promissora alternativa ao controle químico, uma vez que estes produtos apresentam mais de um ingrediente ativo em sua composição, dificultando a seleção de insetos resistentes, além de serem provenientes de recursos renováveis. Dentre as famílias botânicas de ocorrência em regiões neotropicais, Annonaceae constitui uma das principais fontes de compostos naturais bioativos. Assim, visando disponibilizar alternativas mais sustentáveis e ao mesmo tempo eficientes para o manejo de Helicoverpa armigera (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae), avaliou-se a bioatividade de cinco derivados de anonáceas (Annona montana Macfad., A. mucosa Jacq., A. muricata L., A. reticulata L. e A. sylvatica A. St.-Hil.) e do produto comercial à base de acetogeninas de anonáceas (Anosom® 1 EC) sobre lagartas do inseto. Adicionalmente, o composto majoritário do extrato mais ativo foi identificado e também avaliado quanto à sua bioatividade sobre formas neonatas de H. armigera. Constatou-se que o extrato de A. mucosa (CL50: 411,55 mg kg-1 e CL90: 1.479 mg kg-1 ) assim como o Anosom® 1 EC (CL50: 312,08 mg kg-1 e CL90: 1.151 mg kg-1 ) apresentaram significativa atividade inseticida sobre H. armigera, com toxicidade aguda após sete dias de exposição a dieta artificial tratada. A partir do extrato etanólico de A. mucosa realizou-se fracionamento biomonitorado através de diferentes técnicas cromatográficas, permitindo o isolamento da acetogenina bisterahidrofurano roliniastatina-1. Este composto foi testado a uma concentração de 41,55 mg kg-1, ocasionando mortalidade total das larvas de H. armigera ... / Abstract: Helicoverpa armigera (Hübner, 1808) (Lepidoptera: Noctuidae) is a highly polyphagous species with high dispersion ability and adaptability to different crops of economic interest worldwide. Botanical insecticides emerge as a viable alternative to the use of synthetic insecticides for pest management because they have more of a potentially active ingredient in their composition, delaying the selection of resistant insect, moreover come from renewable resources. Among tropical plant families, the Annonaceae has shown great potential as a source of biopesticides. To determine an alternative tool for H. armigera control, this study evaluated the insecticidal activity of ethanolic seed extracts from five species of Annonaceae (Annona montana Macfad., A. mucosa Jacq., A. muricata L., A. reticulata L. e A. sylvatica A. St.-Hil.) and the acetogenin-based commercial bioinsecticide Anosom® 1 EC on larvae of H. armigera larvae. In addition, the major active compound of the ethanolic extract was isolated using various chromatographic techniques and assessed for its bioactivity on H. armigera neonates. In the initial screening assay we verified that the ethanolic seed extract from A. mucosa (LC50 = 411.55 mg kg-1 and LC90 = 1,479 mg kg-1 ) was the most promising one, showing similar effectiveness to Anosom® 1 EC (LC50 = 312.08 mg kg-1 and LC90 = 1,151 mg kg-1 ) against H. armigera at seven days after exposition to treated diet. The acetogenin bis-tetrahydrofuran rolliniastatin-1 was identified as the major compound in ethanolic extract from A. mucosa. This compound was assessed at 41.55 mg kg- 1, causing 100 % of larval mortality on H. armigera neonates for days after exposition to treated diet. After, in a greenhouse trial using tomato plants, the bioactivity of ethanolic extract of A. mucosa was compared to botanical insecticide Anosom® 1 EC (both at LC90) and a synthetic insecticide (Belt® 48 SC) ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-17Bitstream added on 2014-06-13T20:53:02Z : No. of bitstreams: 1 araujo_cr_me_jabo.pdf: 3312351 bytes, checksum: 263e48cc89172f756fb22bf527953bc5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Spodoptera cosmioides Walker, 1858 é uma espécie polífaga, resistente a inseticidas em várias regiões do país e, apesar de ocorrer em baixas densidades, é considerada uma praga potencial para as culturas de algodão, soja e feijão no cerrado. Neste trabalho, estudou-se a biologia comparada de S. cosmioides sobre a cultivar transgênica comercial NuOPAL (Bollgard I, Evento 531) e sobre a cultivar convencional DeltaOPAL, procurando-se detectar a influência da α -endotoxina CryIAc no desenvolvimento biológico dessa espécie. O experimento foi desenvolvido em condições de laboratório (26 ± 1ºC; UR: 70 ± 10%; fotofase: 12h), a partir de lagartas recém-eclodidas e individualizadas. Foram avaliadas a duração e a viabilidade das fases imaturas, duração do ciclo biológico, peso de pupas, razão sexual, porcentagem de deformação de adultos e de adultos não liberados dos invólucros pupais, longevidade dos adultos, fecundidade e viabilidade de ovos. Os parâmetros biológicos observados não diferiram significativamente em relação às duas variedades. Na cultivar NuOPAL verificou-se maior porcentagem de ovos inviáveis, de adultos deformados e de adultos não emergidos, o que indica que essa cultivar provavelmente afeta a fase adulta de S. cosmioides. / Spodoptera cosmioides Walker, 1858 is a polyphagous species, presents resistance to insecticides in various regions of Brazil, and although it occurs at low densities, it’s considered a potencial pest in the crop of cotton, soybeans and beans in the Brazilian cerrado. In this work was studied the comparative biology of S. cosmioides on the comercial transgenic NuOPAL (Bollgard I, Evento 351) and the conventional cultivar DeltaOPAL to detect the influence of endotoxin-α CryIAc on the biological development of this species. The experiment was conducted under specific conditions in a laboratory (26 ± 1º C; RH: 70 ± 10%; photoperiod: 12h), from newlyhatched and individualized larvae. The duration and viability of immature phases and biological cycle, weight of pupae, sex ratio, percentage of deformed adults and adults not released the pupal beg, longevity of adults, fecundity and viability of eggs were evaluated. The biological parameters observed showed that there weren’t significant difference between two varieties studied. In NuOPAL cultivar there was a greater percentage of eggs unviable, deformed adults and adults not emerged, which indicates that this cultivar probably affects the adult phase of S. cosmioides.