NOGUEIRA, Vanessa Lúcia Rodrigues. Papel de proteínas na tinta liberada pela lesma-do-mar Aplysia dactylomela Rang 1828 os mecanismos de defesa do animal. 2005. 90 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Marinhas Tropicais) - Instituto de Ciências do Mar, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2005. / Submitted by Debora Oliveira (deby_borboletinha@hotmail.com) on 2011-12-22T15:10:49Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) / Approved for entry into archive by Nadsa Cid(nadsa@ufc.br) on 2012-01-23T17:07:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-23T17:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_vlrnogueira.pdf: 12654022 bytes, checksum: 35936f35caac0bc23dbf25e1b2ffcafc (MD5) Previous issue date: 2005 / The sea hare Aplysia dactylomela is known by discharging a purple ink when disturbed. As it doesn't show any external structure of protection, it is believed that this secretion, rich in bioactive substances, participates in the chemical defense against pathogens and/or predators. The ink is constituted mainly by pigments, proteins and low molecular mass substances. The pigments are originated from red algae, nevertheless, there is lack of information about the origin, processing, storage and function of the ink proteins. This work describes the protein composition of the ink and present some physiochemical and biological characteristics of the dactylomelin-P, an antibacterial protein from the ink besides information concerning the location of this protein in the purple gland. The ink was obtained from specimens collected at Fleixeiras beach, Ce. The protein composition of the ink was studied by bi-dimensional electrophoresis. The purification of dactylomelin-P consisted basically in ion exchange and hydrophobic interaction chromatography. Dactylomelina-P was analyzed as to molecular mass, isoeletric point, amino acid composition, carbohydrates, heat stability, pH and proteinase resistance. Several biological activities were tested with the ink and with dactylomelina-P, including antimicrobial, enzymatic, haemagglutinating, anticoagulant, hemolytic, cytotoxic and toxic activities. The immunolocalization assays of dactylomelina-P were carried out in different sea hare tissues by western blot and immunohistochemistry and the interaction with Staphylococcus aureus was investigated by immunocytochemistry. The ink of A. dactylomela contains more than 40 proteins/peptides, with molecular masses below 70 kDa and acid pIs. The most abundant protein in the ink is the dactylomelin-P, a monomeric protein with 59,8 kDa, pI 5,0, high methionin content, and less than 1% carbohydrates. It is denatured at 60 ºC for 10 minutes and it resists to pH range of 3-12. Dactylomelin-P shows a wide antibacterial action spectrum, but no antifungal, unlike the ink that possesses some factor with this activity. It is particularly efficient against sea bacteria, can be bactericidal (4,0μg/ml) or bacteriostatic (0,2μg/ml), depending on the concentration. Dactylomelin-P agglutinated rabbit, mice and rat erythrocytes, but it did not show anticoagulating, hemolytic and cytotoxic activities. The LD50 for mice was 60-100 mg/Kg, being considered moderately toxic. Dactylomelin-P was only found in the ink gland, being located preferentially in the cells of the producing vesicles. The electronic transmission microscopy revealed that the dactylomelina-P crosses the cell wall of S. aureus and interacts mainly with the plasmatic membrane, probably interfering in the metabolism of the bacterium, instead of causing mechanic damage to the cell. / O gastrópode marinho Aplysia dactylomela é conhecido por liberar uma tinta púrpura sempre que é importunado. Como não possui nenhuma estrutura externa de proteção, acredita-se que essa secreção, rica em substâncias biologicamente ativas, participe da defesa química do animal. A tinta é composta de pigmentos, proteínas e substâncias de baixa massa molecular. Os pigmentos da tinta são originados de algas vermelhas, mas quanto às proteínas, pouco é conhecido sobre a sua origem, processamento, local de armazenamento e função no animal. Este trabalho descreve pela primeira vez a composição protéica da tinta e apresenta algumas características físico-químicas e biológicas da dactylomelina-P, uma proteína antibacteriana presente na tinta dessa lesma, além de trazer informações acerca da localização desta proteína na glândula de tinta. A tinta foi obtida a partir de espécimes encontrados na praia de Fleixeiras, Ce. A composição de proteínas da tinta foi determinada por eletroforese bidimensional e a purificação da dactylomelina-P foi feita através de cromatografias de troca iônica e interação hidrofóbica. Dactylomelina-P foi analisada quanto à massa molecular, ponto isoelétrico, composição de aminoácidos, presença de carboidratos, estabilidade térmica, resistência ao pH e a proteases. Várias atividades biológicas foram testadas com a tinta e com a dactylomelina-P, incluindo atividades antimicrobianas, enzimáticas, hemaglutinante, anticoagulante, hemolítica, citotóxica e tóxica. Os ensaios de localização da proteína foram realizados em diferentes tecidos da lesma por western blot, na glândula de tinta por imunohistoquímica e a interação com a bactéria Staphylococcus aureus foi feita por imunocitoquímica. A tinta de A. dactylomela contém mais de 40 proteínas/ peptídeos, com massas abaixo de 70 kDa e pIs na faixa ácida. A proteína mais abundante na tinta é a dactylomelina-P, que é uma molécula monomérica, de 59,8 kDa, pI 5,0, que possui alto teor de metionina e menos de 1% de carboidratos, é desnaturada a 60 ºC por 10 minutos e resiste a pHs entre 3-12. Dactylomelina-P mostra um amplo espectro de ação antibacteriano, mas não antifúngico, ao contrário da tinta que possui um fator com esta atividade. É particularmente eficiente contra bactérias marinhas, podendo ser bactericida (4,0μg/ml) ou bacteriostática (0,2μg/ml), dependendo da concentração. Dactylomelina-P aglutinou eritrócitos de coelho, ratos e camundongos, não apresentou atividade anticoagulante, hemolítica e nem citotóxica. A DL50 para camundongos ficou entre 60-100 mg/Kg, sendo considerada moderadamente tóxica. Dactylomelina-P só foi encontrada na glândula de tinta, localizando-se preferencialmente nas células das vesículas produtoras. Ensaios de microscopia eletrônica de transmissão revelaram que a dactylomelina atravessa a parede celular da bactéria S. aureus e, interage principalmente com a membrana citoplasmática, provavelmente interferindo no metabolismo, ao invés de causar danos à célula.

Os peptídeos antimicrobianos tem sido alvo de cada vez mais estudos como candidatos a antibióticos naturais devido a seu amplo espectro de ação e baixa suceptibilidade a induzir resistência microbiana. Carentes de sistema imune específico, os invertebrados contam com um eficiente sistema imune inato para se defenderem de microrganismos patogênicos, incluindo uma coleção de peptídeos antimicrobianos. Através de cromatografia, ensaios antimicrobianos, espectrometria de massas e análise em banco de dados, isolou-se frações do muco de lesmas da espécie P boraceiensis com efeito antimicrobiano e obteve-se sequencias mais prováveis de fragmentos de algumas das frações ativas encontradas, relacionando-os as proteínas e peptídeos conhecidos mais similares e sugerindo relação entre as sequencias encontradas, as proteínas e peptídeos similares, bem como possível relação com atividade antimicrobiana. Obteve-se uma gama de frações ativas contra bactérias e/ou leveduras e sequências e informações relacionadas que podem ser úteis para futuros estudos de isolamento e caracterização de fatores antimicrobianos no muco de P boraceiensis. / Antimicrobial peptides are becoming increasingly more important as natural antibiotics candidates since they show a broad spectrum of action and low suceptibility to induce microbial resistance. Lacking specific imunne system, invertebrates count with an efficient innate imunne system to deffend theirselves from pathogenic microrganisms, including a collection of antimicrobial peptides. Through chromatografy, antimicrobial tests, mass spectometry and database analysis, we isolated fractions from the mucucs of P boraceiensis slugs showing antimicrobial effect. We obtained most propable sequences from several active fractions, relating them with most similar known peptides and proteins. There were sugesteg some possible connections between the found sequences and related peptides and proteins as well as possible antimicrobial activity relations. We found several active fractions against bacteria and/or yeast as well as sequences and related information that may be usefull in further isolation and caracterization studies of antimicrobial factors in P boraceiensis mucus.

Os peptídeos antimicrobianos tem sido alvo de cada vez mais estudos como candidatos a antibióticos naturais devido a seu amplo espectro de ação e baixa suceptibilidade a induzir resistência microbiana. Carentes de sistema imune específico, os invertebrados contam com um eficiente sistema imune inato para se defenderem de microrganismos patogênicos, incluindo uma coleção de peptídeos antimicrobianos. Através de cromatografia, ensaios antimicrobianos, espectrometria de massas e análise em banco de dados, isolou-se frações do muco de lesmas da espécie P boraceiensis com efeito antimicrobiano e obteve-se sequencias mais prováveis de fragmentos de algumas das frações ativas encontradas, relacionando-os as proteínas e peptídeos conhecidos mais similares e sugerindo relação entre as sequencias encontradas, as proteínas e peptídeos similares, bem como possível relação com atividade antimicrobiana. Obteve-se uma gama de frações ativas contra bactérias e/ou leveduras e sequências e informações relacionadas que podem ser úteis para futuros estudos de isolamento e caracterização de fatores antimicrobianos no muco de P boraceiensis. / Antimicrobial peptides are becoming increasingly more important as natural antibiotics candidates since they show a broad spectrum of action and low suceptibility to induce microbial resistance. Lacking specific imunne system, invertebrates count with an efficient innate imunne system to deffend theirselves from pathogenic microrganisms, including a collection of antimicrobial peptides. Through chromatografy, antimicrobial tests, mass spectometry and database analysis, we isolated fractions from the mucucs of P boraceiensis slugs showing antimicrobial effect. We obtained most propable sequences from several active fractions, relating them with most similar known peptides and proteins. There were sugesteg some possible connections between the found sequences and related peptides and proteins as well as possible antimicrobial activity relations. We found several active fractions against bacteria and/or yeast as well as sequences and related information that may be usefull in further isolation and caracterization studies of antimicrobial factors in P boraceiensis mucus.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-04-26T20:27:57Z No. of bitstreams: 1 MarlonDelgadoMelo_DISSERT.pdf: 57317504 bytes, checksum: bc0c674bf921e5980bfc858a437e34c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-04-29T21:49:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MarlonDelgadoMelo_DISSERT.pdf: 57317504 bytes, checksum: bc0c674bf921e5980bfc858a437e34c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-29T21:49:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarlonDelgadoMelo_DISSERT.pdf: 57317504 bytes, checksum: bc0c674bf921e5980bfc858a437e34c0 (MD5) Previous issue date: 2015-05-29 / A taxonomia ? a base de qualquer ci?ncia que envolva biodiversidade, como a ecologia e biogeografia. Entre os invertebrados marinhos, os moluscos gastr?podes s?o um dos grupos mais diversos. O grupo ?Opistobranchia? apresentam redu??o, internaliza??o ou aus?ncia da concha calc?ria, e apresenta tamb?m a maior diversidade de formas entre os gastr?podes. Estima-se que existam entre 5000 e 6000 esp?cies em todo globo terrestre, dentre estas, aproximadamente 235 s?o reportadas para o Brasil, com apenas 12 registradas para o estado do Rio Grande do Norte. O presente projeto visa o levantamento taxon?mico dos opistobr?nquios no litoral do estado do Rio Grande do Norte, Brasil. Para isto foram realizadas expedi??es ?s praias do litoral deste estado. Alguns opistobr?nquios foram coletados diretamente no campo, enquanto outros foram separados em laborat?rio de substratos coletados (i.e., macroalgas, cascalho e pequenas rochas soltas). As coletas se deram manualmente sobre os arrecifes na regi?o entre-mar?s, ou atrav?s de mergulhos livres e aut?nomos (sublitoral). As esp?cies encontradas foram medidas e fotografadas in vivo no Laborat?rio Did?tico II do Departamento de Bot?nica, Ecologia e Zoologia da UFRN. A identifica??o dos esp?cimes foi feita atrav?s da compara??o dos caracteres diagn?sticos de cada grupo, embasada na literatura espec?fica. Foram encontrados 34 novos registros para o litoral do RN, dentre estes, quatro novos registros tamb?m para o nordeste, assim como tr?s novas ocorr?ncias para o Brasil e Atl?ntico Sul. O presente levantamento contribuiu, portanto, para uma melhor estimativa da fauna de opistobr?nquios do litoral norte rio-grandense. Acredita-se que s?o necess?rios mais estudos que envolvam diferentes aspectos ecol?gicos, biol?gicos e biogeogr?ficos dos opistobr?nquios no Brasil e especialmente no Nordeste. / The taxonomy is the foundation of any science involving biodiversity, such as ecology and biogeography. Among marine invertebrates, mollusks gastropods are among the most diverse groups. The subgroup ?Opisthobranchia? have a reduction, or absence internalization of calcareous shell and also has the highest diversity of forms of gastropods. It is estimated that there are between 5000 and 6000 species around the globe, among these, are reported to approximately 235 Brazil, with only 12 recorded for the state of Rio Grande do Norte. This project aims to taxonomic survey of opistobr?nquios the coast of Rio Grande do Norte, Brazil. For this were carried out expeditions to the coastal beaches of this state. Some opistobr?nquios were collected directly in the field, while others were separated in laboratory collected substrates (ie, macroalgae, gravel and small loose rocks). The collections are given manually on the reefs in the region intertidal, or through free and scuba diving (sublitoral). The species found were measured and photographed in vivo in laboratory Didactic II of the Department of Botany, Ecology and Zoology at UFRN. The identification of specimens was made by comparing the diagnostic characters of each group, based on the literature. 34 new records for the coast of the infants were found, among them, four new records as well to the northeast, as well as three new records for Brazil and the Southern Atlantic. This survey contributed thus to a better estimate of opistobr?nquios fauna of North coast Rio Grande. It is believed that more studies are needed involving different ecological, biological and biogeographical aspects of opistobr?nquios in Brazil and especially in the Northeast.