La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est l'hémopathie maligne la plus commune chez les adultes dans les pays occidentaux. La LLC est caractérisée par une instabilité génomique qui se présente sous la forme de mutations somatiques récurrentes et d'anomalies chromosomiques. L'évolution clinique de la maladie, ainsi que la réponse au traitement basé sur la fludarabine, est très hétérogène. Bien que le traitement chimiothérapeutique de première ligne soit relativement efficace, la rechute est inévitable. Par conséquent, la LLC reste une maladie incurable. Les voies dites "3R", réplication, réparation et recombinaison de l'ADN, sont des processus essentiels pour maintenir l'intégrité du génome et prévenir l'apparition du cancer. A contrario, l'instabilité génétique peut entraîner la tumorigenèse et soutenir le développement de la chimiorésistance. Le but de mon projet de thèse a été d'étudier comment les 3R pouvaient contribuer à l'évolution de la LLC. L'analyse de l'expression génique à haut débit, a montré une signature 3R spécifique dans la LLC. De plus, en utilisant des données cliniques nous avons pu: 1. révéler l'anti-silencing function 1A histone chaperone (ASF1A) comme un marqueur pronostique pour le temps de début du premier traitement (time to first treatment (TTFT)) indépendamment des autres marqueurs cliniques connus, 2. montrer que le niveau d'expression de l'ADN polymérase nu (POLN) avant un traitement à base de fludarabine conditionne le temps sans progression (time to progression (TTP)) chez les patients après le traitement. Etant un analogue d'un nucléotide, la fludarabine agit, entre autres, comme un inhibiteur de la ribonucléotide réductase (RNR), une enzyme essentielle pour la régulation du pool cellulaire des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTPs). Or, une modification du pool des dNTPs imposée par la fludarabine provoque un stress réplicatif en perturbant la synthèse d'ADN. Nos données suggèrent que Pol nu (Pol ?) peut diminuer ce stress réplicatif en activant de nouvelles origines de réplication. Dans ce contexte, nous démontrons, donc, le rôle de Pol ? dans la chimiorésistance à la fludarabine. En conclusion, notre étude a démontré l'implication des facteurs 3R dans l'évolution de la LLC précédent le traitement ainsi que leur rôle mécanistique dans la résistance à la chimiothérapie à base de fludarabine. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL), the most common type of adult leukemia in the Western world, is a hematological malignancy characterized by genomic instability present in form of common somatic mutations and chromosomal abnormalities. The disease has a heterogeneous clinical course and despite relatively efficacious first-line chemoimmunotherapeutic treatment based on fludarabine, majority of CLL patients still relapses. CLL, therefore, remains an incurable disease. DNA transactions, including replication, repair of damaged DNA and recombination (the so-called "3Rs") are crucial processes required for preserving genome integrity and limiting cancer risk. Genome instability, on the other hand, is known to drive tumorigenesis and contribute to development of chemoresistance. The aim of my thesis project was to explore whether and how 3R could contribute to the evolution of CLL. In our high-throughput gene expression analysis we defined a specific 3R CLL signature and revealed anti-silencing function 1A histone chaperon (ASF1A) as an independent prognostic marker of time to first treatment (TTFT). Moreover, clinical data analysis showed that DNA polymerase nu (POLN) gene expression level could determine time to progression (TTP) in patients treated with fludarabine based therapeutic regime. Fludarabine is a nucleotide analog that acts, among other, as an inhibitor of ribonucleotide reductase (RNR), an enzyme responsible for regulating the cellular deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) pool. Perturbation of the dNTP pool caused by treatment with fludarabine induces replication stress by arresting DNA synthesis processes. Our data suggest that Pol nu (Pol ?) can counteract this type of replication stress by supporting the activation of new replication origins and, thereby, drive fludarabine chemoresistance. In conclusion, our study, on one hand, demonstrated the implication of 3R factors in the clinical course of CLL before the chemoimmmunotherapy treatment and, on the other hand, revealed their mechanistic role in resistance to fludarabine based therapy.

La translocation t(1;9)(q24 ;q34), qui engendre la protéine de fusion RCSD1-ABL1, a été identifiés dans des cas de LAL de mauvais pronostic. Les propriétés oncogéniques du partenaire RCSD1, sa structure et son rôle dans l’activité et la signalisation de RCSD1-ABL1 restent inconnus. Nous avons récemment rapporté le cas d’une LAL-B t(1;9)(q24 ;q34) montrant une résistance à un grand nombre d’ITK, mais une sensibilité inattendue au ponatinib, en l’absence de mutation d’ABL1 susceptible d’expliquer ces réponses.Dans le but de caractériser la protéine RCSD1-ABL1, de comprendre ces profils de réponse aux ITK et de rechercher un traitement optimal de ces leucémies, nous avons cloné le produit de fusion à partir des blastes leucémiques de la patiente. Les constructions obtenues ont été transfectées dans le modèle cellulaire BaF3, ce qui nous a permis : 1) de démontrer et 2) de disséquer pour la première fois l’oncogénicité et la signalisation de la protéine de fusion, au moins partiellement distincte de celle de BCR-ABL1 et notamment concernant l’activation de la voie JAK/STAT; 3) de purifier RCSD1-ABL1 et de révéler l’impact inattendu du bras N-terminal RCSD1 sur l’activité catalytique de l’enzyme et sa sensibilité aux ITK ; 4) d’intégrer ces données et de démontrer l’effet potentialisateur d’inhibiteurs de la voie JAK/STAT sur l’activité des ITK dans les cellules transduites par RCSD1-ABL1 mais pas celles exprimant BCR-ABL1. Enfin, le profilage chémo-génomique de prélèvements issus de 3 patients nous a permis de conforter nos résultats, et de proposer des bases précliniques de traitements personnalisés ciblant ces mécanismes. / The t(1;9)(q24;q34) translocation, generating the RCSD1-ABL1 fusion protein, is found in bad prognosis LAL cases. The oncogenic properties of RCSD1-ABL1 are unknown and the structure of the RCSD1 portion as well as its impact on RCSD1-ABL1 activity and signaling is yet to be determined. We recently reported the case of a patient with ALL associated with a RCSD1-ABL1 rearrangement that was resistant or poorly responsive to a large number of TKIs but was sensitive to Ponatinib, with no mutation that could explain this.In order to characterize this fusion protein, understand its response profile to TKI and optimize therapeutic approaches for these patients, we cloned the RCSD1-ABL1 gene from the patient sample and expressed it in the cellular model BaF3. This allowed us to 1) Demonstrate and 2) Study for the first time the oncogenic properties and signaling of the fusion protein, which is partially distinct from that of BCR-ABL1, especially regarding the JAK/STAT pathway; 3) Purify RCSD1-ABL1 and reveal the impact of the RCSD1 N-terminal portion on the enzyme activity and its TKI sensitivity; 4) Integrate this data and demonstrate the potentiating effect of JAT/STAT pathway inhibitors on TIK activity in cells expressing RCSD1-ABL1 but not in cells expressing BCR-ABL1.Finally, the chemo-genomic profiling of samples from three B-ALL t(1;9)(q24 ;q34) allowed us to consolidate our results and to propose preclinical bases for personalized treatments targeting the identified mechanisms.

Les leucémies lymphoïdes de type T et B sont des maladies malignes typiques des cellules sanguines. Afin d'approfondir nos connaissances concernant ces dernières, nous avons utilisé le rétrovirus murin Graffi. Pendant longtemps, on pensait que ce rétrovirus ne provoquait que l'apparition des leucémies myéloïdes pour constater, plus tard avec des outils moléculaires et plus perfectionnés, qu'il était capable d'induire différents types de leucémies (lymphoïdes et non lymphoïdes). Pour mieux caractériser les leucémies lymphoïdes et dans le but de trouver des gènes potentiellement impliqués dans ce type de leucémie ou dans le processus de l'hématopoïèse, la technique des microarrays a été retenue. Cette technique permet de mesurer en une seule expérience le niveau d'expression de plusieurs milliers de gènes. Les analyses ont porté sur 8 échantillons de souris constitués de 3 sous types de leucémies T (CD4+/CD8+, CD4+/CD8-, CD4-/CD8+), de 3 sous-types de leucémies B (CD45R low/CD19+, CD45R+/CD19+, CD45R+/CD19+/SCA1+) et d'un contrôle constitué de lymphocytes T (CD4+/CD8+) et B (CD45R+/CD19+) exprimant les marqueurs de surface exprimés à la surface de chacun des types de leucémies. Différentes approches d'analyse des résultats obtenus par les microarrays ont été appliquées de façon à distinguer ou à regrouper les gènes dont l'expression est altérée dans les différents types de leucémies analysées. Ceci nous a permis de sélectionner 56 gènes qui étaient soit spécifiques aux leucémies T, soit spécifiques aux leucémies B, soit communs à ces deux types. Parmi ces gènes se trouvent des gènes qui sont connus dans d'autres types de cancers mais qui n'ont pas encore été impliqués dans la leucémie. D'autres ne sont connus que dans les leucémies non lymphoïdes ou encore n'ont jamais été impliqués ni dans la tumorigénèse ni dans la leucémogénèse mais qui ont des fonctions physiologiques nécessaires au bon fonctionnement de l'organisme. Pour certains autres gènes, aucune information n'était disponible. L'application des microarrays a donc permis de créer une liste constituée des gènes potentiellement impliqués dans le développement de leucémies et qui pourraient servir de marqueurs diagnostiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Rétrovirus, Rétrovirus murin Graffi, Leucémies lymphoïdes, Leucémies non lymphoïdes, Cytométrie de flux, Tri cellulaire, Micropuces à ADN, Gènes différentiellement exprimés, Oncogènes.

La Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) est la leucémie la plus fréquente des pays occidentaux. Cette maladie est caractérisée par l’accumulation de lymphocytes B (LB) monoclonaux (CD5+/CD19+/CD23+) dans le sang, la moelle et les organes lymphoïdes secondaires. Malgré d’importants progrès durant cette dernière décennie, la LLC reste incurable avec les traitements classiques. De manière intéressante, son évolution clinique est hétérogène :certains patients ne présenteront aucun symptôme alors que d’autres évolueront rapidement nécessitant une intervention thérapeutique. De nombreuses interactions entre les cellules leucémiques et le microenvironnement (ME) médullaire, composé entre autres de cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sécrétant une matrice extracellulaire, jouent un rôle important dans la survie cellulaire et la résistance à la chimiothérapie. Actuellement la nature des communications entre le clone leucémique et son ME n’est pas encore complétement élucidée. Notre objectif est d’étudier l’impact des vésicules extracellulaires (VEs abréviées ici EVs) (microparticules et exosomes) du ME, spécifiquement des CSM, sur les LB de LLC. Dans la 1ère partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à la caractérisation des microparticules (MPs) par cytométrie en flux (CMF). Cette technique est un des meilleurs moyens de déterminer le phénotype des MPs, elle permet d’étudier les vésicules de 300 nm à 1 µm, excluant donc les exosomes, dont la taille est inférieure à 100 nm. Nous avons ainsi pu caractériser les MPs provenant de plaquettes et d’érythrocytes grâce à la présence respective des antigènes CD41/61 et du CD235a. Par contre, concernant les antigènes classiques des cellules mononucléées (CD3-14-19-20-56), aucun antigène n’a pu être détecté sur les MPs provenant des lymphocytes T (LT), des monocytes, des LB normaux et leucémiques et des cellules ‘’natural killer’’ (NK). Le signal positif obtenu dans certains cas était la conséquence d’un marquage aspécifique. Nous avons dès lors proposé un contrôle négatif supplémentaire qui ne se limite pas à l’utilisation d’isotypes mais qui se base sur des marquages croisés. Grâce à ce travail, nous avons démontré que les MPs dérivant de cellules positives pour un antigène donné n’étaient pas automatiquement positives pour ce dernier. Dans la seconde partie du travail, nous avons étudié les MPs et les exosomes provenant du ME médullaire, regroupés sous le terme EVs. Nous avons démontré que leur intégration dans les LB de LLC est très rapide et qu’elle permet une diminution de l’apoptose ainsi qu’une augmentation de la viabilité et de la migration des cellules leucémiques. Les EVs augmentent leur chimiorésistance vis-à-vis de différents agents leucémiques. A l’aide de la technologie Affymetrix, nous avons comparé les profils d’expression génique des LB leucémiques, ayant reçu ou non des EVs du ME. Ces analyses ont mis en évidence 805 gènes différentiellement exprimés entre les deux conditions. Une grande partie de la signature obtenue suite à l’intégration des EVs, partage de nombreuses similitudes avec des signatures de LB de LLC ayant eu un contact avec des cellules nourricières ou ayant reçu différents stimuli. Le point commun parmi ces différentes signatures est l’activation de la voie du ‘’B-cell receptor’’ (BCR) ;les EVs de CSM semblent en effet avoir la capacité d’induire dans les LB de LLC une réponse semblable à celle d’une activation BCR. Dans cette étude, nous avons démontré que le ME médullaire, en plus d’interagir par contact direct avec les LB de LLC et par la production de facteurs solubles, est également capable d’influencer le comportement des cellules leucémiques via la production d’EVs. Nos données suggèrent un rôle important des EVs dans la survie cellulaire et l’évolution de la LLC et ouvrent donc la porte à de nouvelles cibles thérapeutiques. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Titre de l'écran-titre (visionné le 25 octobre 2023) / L'expression tumorale des enzymes UDP-glucuronosyltransférase (UGT) est associée à un pronostic défavorable dans plusieurs types de cancers. Un membre de cette famille, UGT2B17, est impliqué dans l'inactivation d'agents anticancéreux et de certains composés endogènes jouant un rôle dans le développement et la progression du cancer. L'expression élevée du gène UGT2B17 a été identifiée par notre groupe comme un marqueur indépendant de mauvais pronostic en leucémie lymphoïde chronique (LLC), associée à une survie réduite et à une moins bonne réponse au traitement. L'expression d'UGT2B17 au niveau des cellules B-LLC se caractérise par la présence de transcrits alternatifs n2, n3 et n4, dont la transcription est issue des promoteurs P2 et P3. En revanche, le transcrit canonique v1 est absent et prédomine dans d'autres tissus comme le foie, pour lequel la régulation de la transcription a été principalement étudiée. Mon projet a porté sur les mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression d'UGT2B17 au niveau des cellules B-LLC, et visait à démontrer l'implication de facteurs de transcription préalablement identifiés et potentiellement impliqués dans l'expression des transcrits alternatifs. Mon hypothèse stipulait que l'expression d'UGT2B17 dans les lymphocytes B-LLC implique ces facteurs de transcription et sous-tend un programme transcriptionnel distinct du foie n'impliquant pas le transcrit canonique. Expérimentalement, les données présentées dans ce mémoire supportent l'implication de facteurs de transcription tels que STAT3, Nf-kB et IRF dans l'activité transcriptionnelle d'UGT2B17 dans les cellules B-LLC. Ces facteurs de transcription sont connus pour leur implication en LLC. Nous concluons que la régulation de la transcription de ce gène diffère de celle du foie. / Tumor expression of UDP-glucuronosyltransferase (UGT) enzymes is associated with poor prognosis in several cancers. A member of this family, UGT2B17, is involved in the inactivation of anticancer agents and certain endogenous compounds that play a role in the development and progression of cancer. High expression of the UGT2B17 gene has been identified by our group as an independent marker of poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia (CLL), associated with reduced survival and poor response to treatment. The expression of UGT2B17 in B-CLL cells is characterized by the presence of alternative transcripts n2, n3 and n4, whose transcription comes from the P2 and P3 promoters. On the other hand, the canonical transcript v1 is absent and predominates in other tissues such as the liver, for which the regulation of transcription has been mainly studied. My project focused on the mechanisms involved in the regulation of UGT2B17 expression in B-CLL cells, and aimed to support the involvement of previously identified transcription factors potentially involved in the expression of alternative transcripts. My hypothesis was that expression of UGT2B17 in B-CLL cells involves these transcription factors and underlies a distinct transcriptional program than observed the liver, not involving the canonical transcript. The data presented in this thesis support the involvement of transcription factors such as STAT3, Nf-kB and IRF in the transcriptional activity of UGT2B17 in B-CLL cells. These transcription factors are known to be involved in CLL. We conclude that the regulation of transcription of this gene differs from that of the liver.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la forme adulte la plus fréquente dans le monde occidental. Les patients atteints présentent un parcours clinique très variable. Il s’avère important d’identifier de nouveaux marqueurs pronostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’optimiser à la fois la prise en charge du patient et le traitement. Une étude antérieure de notre groupe révèle une surexpression en ARN du marqueur UGT2B17dans les lymphocytes d’un sous-groupe de patients LLC. Les niveaux d’expression UGT2B17 élevés sont associés à un mauvais pronostic et une réponse réduite aux traitements utilisant la fludarabine (FC/FCR). Bien que les UGT soient connus pour leur rôle important dans l’inactivation et l’élimination des médicaments, ces enzymes régulent aussi l’équilibre de molécules endogènes, notamment les hormones stéroïdiennes. L’hypothèse du projet de doctorat stipule qu’UGT2B17 module des fonctions cellulaires favorisant la progression de la LLC et la résistance aux médicaments. Ces effets peuvent être médiés via sa fonction enzymatique i) en modifiant certains substrats endogènes, entraînant un effet sur les voies cellulaires, influençant le profil oncogénique des cellules LLC et ii) en inactivant les composés pharmacologiques, entraînant ainsi une réponse réduite au traitement anti leucémique. Une première étude a permis d’établir les liens entre les niveaux d’expression d’UGT2B17, l’exposition hormonale, et la survie des patients leucémiques (n=156). Nos travaux révèlent une perturbation des niveaux hormonaux chez les patients atteints de LLC comparés aux sujets sains. De plus, les niveaux de certaines hormones stéroïdiennes sont associés à la survie des patients et ce, de manière différente selon le sexe. Cela suggère un dimorphisme sexuel quant à l’influence des voies hormonales sur la progression de la maladie. Toutefois, ces effets semblent indépendants du statut génétique et d’expression d’UGT2B17, l'UGT prédominante dans les lymphocytes B. Conformément à la signature pronostique défavorable associée à UGT2B17 in vivo, sa surexpression dans des modèles cellulaires est associée à une prolifération accrue des lymphocytes B. Les analyses transcriptomiques révèlent qu'un taux élevé d'UGT2B17 est associé à une altération de gènes liés à la prostaglandine E2 (PGE₂), à la fois dans les modèles et dans une cohorte de 448 patients LLC. Les analyses fonctionnelles montrent que le PGE₂ favorise l’apoptose des cellules leucémiques de patients et réduit la prolifération des modèles cellulaires. Son effet est partiellement aboli par l’expression élevée d’UGT2B17. Les analyses enzymatiques démontrent qu’UGT2B17 inactive PGE₂ par sa conjugaison à l’acide glucuronique (GlcA), ce qui entraîne la formation de deux glucuronides (G). Ceci est soutenu par l’inactivation efficace de PGE₂ en PGE₂-G dans les cellules de patients atteints de LLC exprimant UGT2B17. Pour cette seconde étude, nous concluons que la glucuronidation du PGE₂ par l’enzyme UGT2B17 altère les effets anti-oncogéniques de PGE2 dans les cellules leucémiques, contribuant possiblement à la progression de la maladie chez les patients atteints de LLC présentant des niveaux élevés d'UGT2B17. Nous avons par la suite étudié l’implication de l’enzyme UGT2B17 dans l'inactivation de la fludarabine et de thérapies ciblées émergentes, et si cette voie affecte la réponse au traitement. Des niveaux élevés d'UGT2B17 sont associés à une sensibilité réduite à la fludarabine, l'ibrutinib et l'idelalisib dans deux modèles cellulaires lymphoïdes. Comme chez les patients atteints de LLC traités à la fludarabine, l'exposition des modèles à la l'ibrutinib et l'idelalisib induit l'expression d’UGT2B17. Nos résultats révèlent que l'UGT2B17 affecte possiblement la signalisation de la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK) et que son expression est régulée par un promoteur alternatif. Outre la fludarabine, l'ibrutinib et l'idelalisib, nous avons démontré la formation de glucuronides par spectrométrie de masse pour un nombre important de médicaments utilisés en LLC. La majorité de ces antileucémiques sont conjugués par UGT1A4, alors que la fludarabine, le venetoclax, le cerdulatinib et le chlorambucil sont également conjugués par UGT2B17. Les glucuronides de la fludarabine et de l’ibrutinib sont détectés en circulation des patients LLC traités. Ces données supportent un mécanisme spécifique pour la modification de la réponse au médicament par UGT2B17 impliquant l’inactivation directe du médicament dans les cellules B néoplasiques, contribuant ainsi à la réponse au traitement chez les patients atteints de LLC présentant des niveaux élevés d'UGT2B17. Cependant, nos résultats suggèrent des mécanismes additionnels pour les molécules qui ne sont pas des substrats de l’enzymeUGT2B17.

RhoH est une petite protéine G de la famille Rho constitutivement activée. Cette protéine, exclusivement exprimée dans les cellules hématopoïétiques, intervient dans le développement du système immunitaire. Elle régule la croissance des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, la différenciation des lymphocytes T et la signalisation des récepteurs TCR, BCR et FcεRI présents respectivement à la surface des cellules T, B et des mastocytes. La dérégulation de l’expression du gène RHOH est un facteur de progression tumorale dans certaines leucémies. En effet, l’augmentation de son expression dans la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) et sa répression dans la leucémie à tricholeucocytes (HCL) sont des évènements impliqués dans la progression de ces maladies. La LLC et l’HCL sont deux pathologies affectant des lymphocytes B matures mais, pour cette dernière, les cellules présentent un état de différenciation plus avancé. RhoH module donc différemment les processus de prolifération, de migration et de survie cellulaires selon le stade de maturation des cellules, suggérant que son expression soit finement régulée dans les cellules hématopoïétiques. Au laboratoire, notre équipe a mis en évidence la répression de RHOH dans l’HCL, responsable de la progression de cette maladie. Cette expression anormale est le résultat d’une diminution des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4. Le même phénomène a également été observé dans la leucémie T de l’adulte (ATL). L’HCL et l’ATL sont deux maladies caractérisées par une prolifération anormale de cellules matures activées de type B (HCL) ou de type T (ATL). Nous avons donc projeté de comprendre les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation physiologique du gène RHOH au cours de l’activation lymphocytaire B et T ; puis de mettre en évidence les évènements responsables de la répression de RHOH dans l’HCL et l’ATL. Notre objectif serait d’y restaurer l’expression de RHOH et ainsi d’essayer de contrecarrer le phénotype leucémique, ceci dans le but de proposer de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques dans ces deux leucémies, dont les traitements sont soit inefficaces (ATL), soit satisfaisants mais associés à des taux de rechutes assez élevés (HCL). Notre projet s’est tout d’abord orienté sur l’étude de la régulation normale du gène RHOH dans les cellules B et T. Nos résultats ont permis de montrer que l’expression du gène RHOH est principalement due à l’activité du promoteur P3 dans les lymphocytes B et T normaux et dans des lignées cellulaires lymphoïdes. Dans les lignées lymphoïdes B, le promoteur P3 a été caractérisé et correspond à la séquence -236/+67, en regard du site d’initiation de la transcription. Nous avons observé une augmentation de son activité suite à l’activation de ces cellules par un analogue du diacylglycérol (DAG), suggérant que des facteurs de transcription comme AP1, complexe formé des membres des familles Jun et Fos, sont impliqués dans la régulation du gène RHOH dans des lignées cellulaires lymphoïdes B. Nos résultats ont également permis de mettre en évidence : d’une part, la fixation de JunD sur le promoteur P3, par immunoprécipitation de la chromatine et son rôle de régulateur négatif dans la transcription de RHOH ; d’autre part, l’importance des membres de la famille Fos dans l’expression de ce gène, dans la lignée lymphoïde B Raji. Dans les lymphocytes T, l’activation des cellules par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 a permis d’observer une variation biphasique de l’expression des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4, au niveau du promoteur P3 : tout d’abord, une forte augmentation du taux des ARN messagers, reproduite par l’utilisation d’un ionophore pour le calcium, suivie d’une répression, mimée par l’analogue du DAG. / The hematopoietic GTPase RhoH is an atypical family member of the Rho GTPases as it is constitutively active and not regulated through the classical cycling between GTP- and GDP-bound state. A number of studies investigated the role of RhoH in hematopoietic cells. RhoH is associated with regulation of proliferation of hematopoietic stem and progenitors. This protein exhibits essential functions in thymocyte development and TCR, BCR, FcεRI signaling in T, B and mast cells, respectively. Recently, a report provided evidence implicating RhoH overexpression in the initiation and progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL); on the other hand, RhoH underexpression has been implicated in the progression of Hairy Cell Leukemia (HCL). Most data indicate that RhoH is an important regulatory molecule with antagonistic functions in proliferation, adhesion or migration in hematopoietic cells and therefore must be accurately regulated. Previous experiments from our laboratory reported that HCL is characterized by abnormal underexpression of RhoH, corresponding to a decreased level of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. Reconstitution of RhoH expression reduced proliferation, adhesion and migration that is central in HCL pathogenesis. Transcriptional repression of this gene was also observed in another leukemia, Adult T cell Leukemia (ATL). Aimed at identifying new therapeutic targets to combat HCL and ATL, we wanted to examine molecular mechanisms implicated in RhoH underexpression in both diseases. HCL and ATL are chronic lymphoproliferative disorders characterized by proliferation of mature cells with memory B cell or T-helper cell phenotype, respectively. In the first part of our work, we wanted to investigate molecular mechanisms mediating normal RhoH expression in activated B and T cells, as well as induced pathways; in the second part, we tempted to identify transcription factors implicated in RhoH repression in HCL and ATL. Firstly, our work has focused onto physiological expression of RHOH gene in B and T cells. We showed that RHOH gene expression observed in these cells was mostly due to transcriptional activity of P3 promoter, upstream of RHOH exon 4. The promoter was isolated spanning nucleotides -236/+67 relative to the transcription start site, in B cells. B cells stimulation by PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acétate) induced an increase of P3 promoter activity. PMA is a DiacylGlycerol (DAG) analogous. This result suggested that transcription factors related to DAG pathway stimulation, like AP1 (Activator Protein 1), could be responsible for RHOH expression in B cells. We could show that the Jun family member JunD is able to bind to endogenous P3 promoter and can act as a repressor of RHOH expression in a B cell line, Raji. Other Jun family members seemed not to be implicated in this regulation. We also reported that Fos family members are important in RHOH expression. Our results suggest that the transcription factor AP1 could regulate this process in B cells. T cell activation by antibodies directed against CD3 and CD28 induced biphasic kinetics of expression of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. We observed a high increase of RHOH transcript level, mimicked by use of ionomycin, followed by an important decrease, mimicked by use of PMA. RHOH P3 promoter was isolated in a T cell line, Jurkat, then we investigated putative binding sites for transcription factors, which could be implicated in this biphasic event in T cells. Our preliminary results have shown that some potential binding sites for transcription factors related to calcium pathway and inducing RHOH expression are present between nucleotides -236 and -201; also sites for transcription factors induced by DAG pathway and repressing this gene are present between nucleotides -583 and -380.

CD20 est une cible thérapeutique validée pour l’immunothérapie des néoplasmes lymphoïdesdes cellules B, incluant la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Nous avons comparé les effets de rituximab et de GA101 (nouvel anticorps anti-CD20) contre les cellules LLC fraiches in vitro. Le marquage avec Annexine V a démontré une induction de l’apoptose après l’exposition au rituximab et GA101.Contrairement au rituximab, GA101 induisait une réduction du potentiel transmembranaire mitochondrial, uneffet qui peut être partiellement inhibé par la cyclosporine A et qui est partiellement caspase-dépendant. GA101induisait aussi la production des espèces d’oxygènes réactives. L’analyse du niveau d’expression des protéinespro- et anti-apoptotiques après exposition aux anticorps a démontré une forte hétérogénéité entre les échantillons.Bax subissait une activation de conformation et une translocation mitochondriale suite à l’exposition aux anticorps d’une manière caspase-indépendante. GA101, mais pas rituximab, induisait le clivage des caspase-8, -9et -3. En transfectant les cellules LLC avec un siRNA ciblant Bcl-xL utilisant la sonoporation, nous avons trouvéque la réduction du niveau d’expression de Bcl-xL est associée à une augmentation de la sensibilité aux anticorps. Nos résultats suggèrent que les voies de signalisation apoptotiques diffèrent entre rituximab et GA101avec une implication de la voie mitochondriale avec le GA101. L’inhibition de Bcl-xL peut constituer une façon pour sensibiliser les cellules LLC aux effets apoptotiques des anticorps anti-CD20. / CD20 is a validated target for the immunotherapy of B lymphoid neoplasms, including ChronicLymphocytic Leukemia (CLL). We compared the activities of rituximab and GA101 (novel anti-CD20 antibody)on fresh human CLL cells in vitro. AnnexinV staining demonstrated induction of apoptosis after exposure torituximab or GA101. Unlike rituximab, GA101 induced a reduction of the mitochondrial transmembranepotential, an effect which could be partially inhibited by cyclosporin A and which was partially caspasedependent.GA101 was also found to induce the production of Reactive Oxygen Species. Analysis of pro- andanti-apoptotic protein content after exposure to antibodies demonstrated a strong degree of heterogeneity between samples. Bax underwent conformational activation and mitochondrial translocation upon exposure toantibodies in a caspase-independent manner. GA101 but not rituximab induced cleavage of caspase-8, -9 and -3.By transfecting CLL cells with anti-Bcl-xL siRNA using a sonoporation method, we found that reduction of BclxLcontent was associated with increased sensitivity to these antibodies. Our results suggest that apoptoticsignalization pathways differ between rituximab and GA101 with a greater involvement of the mitochondrialpathway for GA101. Inhibition of Bcl-xL could constitute an approach to sensitize CLL cells to the apoptoticeffects of anti-CD20 antibodies.

CD20 est une cible thérapeutique validée pour l'immunothérapie des néoplasmes lymphoïdesdes cellules B, incluant la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC). Nous avons comparé les effets de rituximab et de GA101 (nouvel anticorps anti-CD20) contre les cellules LLC fraiches in vitro. Le marquage avec Annexine V a démontré une induction de l'apoptose après l'exposition au rituximab et GA101.Contrairement au rituximab, GA101 induisait une réduction du potentiel transmembranaire mitochondrial, uneffet qui peut être partiellement inhibé par la cyclosporine A et qui est partiellement caspase-dépendant. GA101induisait aussi la production des espèces d'oxygènes réactives. L'analyse du niveau d'expression des protéinespro- et anti-apoptotiques après exposition aux anticorps a démontré une forte hétérogénéité entre les échantillons.Bax subissait une activation de conformation et une translocation mitochondriale suite à l'exposition aux anticorps d'une manière caspase-indépendante. GA101, mais pas rituximab, induisait le clivage des caspase-8, -9et -3. En transfectant les cellules LLC avec un siRNA ciblant Bcl-xL utilisant la sonoporation, nous avons trouvéque la réduction du niveau d'expression de Bcl-xL est associée à une augmentation de la sensibilité aux anticorps. Nos résultats suggèrent que les voies de signalisation apoptotiques diffèrent entre rituximab et GA101avec une implication de la voie mitochondriale avec le GA101. L'inhibition de Bcl-xL peut constituer une façon pour sensibiliser les cellules LLC aux effets apoptotiques des anticorps anti-CD20.

Le facteur de transcription Aiolos, membre de la famille des protéines à doigts de zinc de type Ikaros, joue un rôle important dans la différenciation des lymphocytes B. Notre premier objectif a été de définir les mécanismes impliqués dans la régulation de la transcription du gène aiolos humain. Nous avons analysé la méthylation de l'îlot CpG d'Aiolos et les modifications de ses histones dans différentes lignées et cellules primaires. Nous avons observé une méthylation dense de l'ilot CpG, associée à des niveaux faibles de marques d'euchromatine (H3K4 di-/tri-méthylées, H3K9 acétylées) dans les lignées Aiolos négatives U937 et 1106mel, tandis que les cellules exprimant Aiolos présentaient les caractéristiques opposées. L'inhibition des Dnmt dans les U937 et 1106mel avec la 5-Aza-dC a entrainé une déméthylation de l'îlot CpG, associée à une augmentation des marques d'euchromatine et à une induction d'Aiolos. La répression d'Aiolos dans les monocytes et mélanocytes primaires a quant à elle été associée à une augmentation des H3K9me3 et H3K27me3, indépendamment de la méthylation de l'ADN. Notre deuxième objectif était d'étudier l'implication d'Aiolos dans les syndromes lymphoprolifératifs des cellules B matures chez l'homme (leucémie lymphoïde chronique et autres lymphomes B). Nous avons démontré que les cellules B, saines et tumorales, exprimaient majoritairement le variant hAio1 (80%) et nous avons observé pour la première fois une augmentation globale des transcrits Aiolos dans la LLC, indépendamment des marqueurs pronostiques (ZAP-70, statut mutationnel des IgVH). Cette augmentation, confirmée au niveau protéique, semble indépendante des niveaux d'H3K4me3 et H3K9ace.