Acute Lymphocitic Leukemia (ALL) is the most common cause of childhood cancer and occurs in adults in 20%. Lymphoblasts accumulation is a characteristic of the disease since the leukemic cells retain some multiplication ability without differentiation. The chemotherapy treatment for ALL has been proven effectiveness leading 95% cases to remission however, some patients may have recurrence disease. An accurate diagnosis is critical for the correct treatment and therefore longer survival. Molecular biology techniques have contributed to the early detection of recurrence, mainly by PCR method. Considering the high frequency of clonal rearrangements in leukemia (about 90 to 95%) the analysis of clonal immunoglobulin (Ig) or T-cell receptor (TCR) rearrangements by PCR has been shown to be useful for treatment monitoring the minimal residual disease. This study aimed to standardize the PCR for Ig and TCR rearrangements technique and characterize the pacients at the University Hospital of Santa Maria, through these analysis. After adjustments the technique was considered a reliable procedure and relatively easy to perform. The higher frequency of rearrangements were detected in IgH gene (82.76%) by the DH7 sequences (14 samples), Vg1 (10 samples), VH3 and V2D3 (9 cases). IgK rearrangements occurred in frequency of 31.03, TCRG and TCRD rearrangements to 41.37%, and Sil-Tal to 3.45%. / A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) é a causa mais comum de câncer infantil e ocorre em 20% dos adultos. Tem como característica o acúmulo de linfoblastos, células leucêmicas que mantêm capacidade de multiplicação, porém, sem diferenciação. O tratamento quimioterápico para LLA tem se mostrado eficaz e levado à remissão em 95% dos casos, no entanto, alguns pacientes podem apresentar recidiva da doença. O diagnóstico preciso é fundamental para o tratamento correto do paciente e, consequentemente, elevar a sobrevida. Metodologias de biologia molecular têm contribuído para a detecção precoce de recidivas, principalmente por técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR). Tendo em vista que nas LLA os rearranjos clonais de imunoglobulinas (Ig) ou de receptores de células T (TCR) ocorrem em 90 a 95% dos casos, as análises destes por PCR tem-se mostrado método útil para o acompanhamento do tratamento, detecção de doença residual mínima. O presente estudo teve como objetivo padronizar a técnica de pesquisa de rearranjos de Ig e TCR, e caracterizar a sua frequência na população de pacientes com LLA do Hospital Universitário de Santa Maria. A técnica para pesquisa da prevalência de rearranjos gênicos mostrou-se, depois de ajustadas os devidos detalhes, um procedimento de reprodutibilidade confiável e relativamente fácil execução. A maior frequência de rearranjos foi detectada no gene IgH (82,76%), sendo representada por amplificações nas sequências DH7 (14 amostras), Vg1 (10 amostras), VH3 e V2D3 (9 amostras). Rearranjos de IgK ocorreram em frequência de 31,03%, rearranjos TCRG e TCRD com 41,37% e Sil-Tal em 3,45%.

Orientador: José Andrés Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T07:51:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ganazza_MonicaAparecida_D.pdf: 9547403 bytes, checksum: 7d821874cefad54cd4ae846262dbb09a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é o câncer mais comum da infância. Os atuais protocolos de tratamento da LLA levam à cura em até 80% dos casos e parte do sucesso se deve à aplicação de diferentes tratamentos para os pacientes estratificados em diferentes grupos de risco. Contudo, pacientes considerados em remissão podem apresentar conteúdo substancial de células neoplásicas, a chamada doença residual mínima (DRM), cuja proliferação está associada com a recaída da doença e que podem estar em níveis indetectáveis pelas técnicas convencionais de análise morfológica. O atual protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia Infantil (GBTLI-LLA-2009) utiliza as análises da DRM para estratificar os pacientes em grupos de risco e assim determinar seu tratamento. Desta maneira o presente estudo objetivou (1) estudar a DRM por método qualitativo e quantitativo (RQ-PCR) em amostras D35 de 120 pacientes prospectivos admitidos para tratamento com o protocolo GBTLI-LLA-2009 no Centro Boldrini entre dezembro de 2009 e julho de 2013 (2) determinar a freqüência e sensibilidade dos rearranjos gênicos de imunoglobulinas e receptores de células T (3) analisar a realocação dos pacientes em grupos de risco em três pontos do tratamento (D8, D15 e D35) (4) buscar associações entre resultados de DRM no D35 e variáveis clínico-biológicas dos pacientes (5) analisar a sobrevida global nos pacientes (6) analisar o grau de concordância entre os resultados obtidos por PCR qualitativo e RQ-PCR no D35. Para a DRM no D15 as análises foram realizadas por citometria de fluxo pela equipe multidisciplinar do Centro Boldrini, já para DRM no D35 as análises foram feitas por PCR qualitativo e RQ-PCR com o uso de primers para a região VDJ das imunoglobulinas e receptores de células T. Observou-se que pelo menos 1 rearranjo gênico foi detectado ao diagnóstico para 98% dos casos estudados através de PCR qualitativo. Os rearranjos mais frequentes ao diagnóstico foram IGH , IGK, TCRG e TCRD para os casos de LLA-B derivada e TCRG, TCRD e Sil-Tal e IGH para os casos de LLA-T. Os primers paciente específicos para RQ-PCR mais sensíveis (sensibilidade 1x10-4) foram aqueles envolvendo rearranjos IGH, TCRD, TCRG e IGK. Associação entre presença de DRM no D35 detectada por RQ-PCR e idade dos pacientes (grupo <1 e ?9 anos) foi observada. Presença de DRM ?10-3 no D35 se mostrou relacionada com sobrevida global em pacientes com LLA-B derivada classificados como BR após análises de DRM no D15. Casos de LLA-B derivada classificados como BR após o D15 em sua maioria não apresentaram DRM nos pontos analisados (D15 e D35) sugerindo que a análise da DRM nesses casos seja dispensável. Já para os casos LLA-B derivada classificados como AR após o D15, 7 pacientes considerados bons respondedores no D15 mostraram-se respondedores lentos no D35 ressaltando a importância da análise da DRM nesse ponto do tratamento. Para casos com LLA-T o número reduzido de pacientes impediu qualquer conclusão a respeito. As duas metodologias aplicadas para as análises da DRM no D35 obtiveram concordância de 80% e 100% para LLA-B derivada e LLA-T, respectivamente / Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric cancer. The recent ALL treatment protocols can achieve the complete remission in 80% of cases and this success is due to different treatments for patients stratified into different risk groups. Therefore, patients considered in remission may have substantial contents of neoplasic cells, the minimal residual disease (MRD). The proliferation of such neoplasic cells is associated with disease relapse and they can be undected by conventional methods. The current protocol of the Brazilian Childhood Leukemia Treatment (GBTLI-LLA-2009) uses the analysis of MRD to stratify patients into risk groups and thus determine their treatment. Thus this study aimed to (1) study the MRD for qualitative and quantitative method (RQ-PCR) at D35 from 120 prospective patients admitted for treatment with protocol GBTLI-LLA-2009 at Centro Boldrini between December 2009 and July 2013 (2) determine the frequency and sensitivity of immunoglobulin and T cell receptor gene rearrangements (3) analysis of the relocation of patients into risk groups in three points of treatment (D8, D15 and D35) (4) find associations between results of MRD at D35 and D15 and clinical-biological characteristics of patients (5) analyze the overall survival in patients (6) to analyze the degree of agreement between the results obtained by qualitative PCR and RQ-PCR in D35. MRD analyzes at D15 were performed by flow cytometry by the multidisciplinary team of the Centro Boldrini, MRD at D35 analyzes were performed by qualitative PCR and RQ-PCR using primers for the VDJ region of the immunoglobulin and T cell receptors. At least one gene rearrangement was detected at diagnosis to 98% of the cases studied by qualitative PCR. The most frequent rearrangements at diagnosis were IGH, IGK, TCRG and TCRD for cases of B-ALL derived and TCRG, TCRD and Sil-Tal and IGH in cases of T-ALL. The most sensitive RQ-PCR patient specific primers (sensitivity 1x10-4) were those involving IGH, TCRD, TCRD and IGK rearrangements. Association between presence of MRD in D35 detected by RQ-PCR and age group (<1 and ? 9 years) was observed. Presence of MRD ? 10-3 in D35 showed to be related with overall survival in patients with B-ALL derived classified as BR after analysis of MRD in D15. Cases of B-ALL derived classified as low risk after the D15 mostly showed no MRD in the analyzed points (D15 and D35) suggesting that the analysis of these cases is dispensable. As for the B-ALL derived cases classified as AR after D15, 7 patients considered good responders in D15 proved to be slow responders in D35 emphasizing the importance of analyzing MRD at this point of treatment. For T-ALL cases the small number of patients did not allow any conclusion. Both methodologies for the analysis of DRM in D35 obtained 80% and 100% of agreement for B-ALL derived and T-ALL respectively / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Orientador: José Andrés Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:04:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laranjeira_AngeloBrunelliAlbertoni_D.pdf: 13248620 bytes, checksum: 729ec8e23331934ddd1e5803361b6fe6 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é o tipo de câncer mais comum que acomete crianças. Sabe-se que a interação do tumor com o contexto celular do hospedeiro (microambiente tumoral) é recíproca, ou seja, na medida em que o tumor estimula o seu microambiente, este potencializa a sobrevivência, proliferação e invasividade tumoral. A interação da LLA com as células estromais da medula óssea tem um impacto positivo na resistência das células leucêmicas à quimioterapia. No presente estudo foi investigado a modulação de uma série genes de sensibilidade e resistência à asparaginase em células de LLA-B precursoras após co-cultura com as células estromais. Mostramos o aumento da expressão e secreção da IGFBP7 pelas células leucêmicas após co-cultivo com células do estroma da medula óssea. Em ensaios com o silenciamento do IGFBP7 em células leucêmicas e células estromais, mostramos que a IGFBP7 atua regulando positivamente o crescimento celular e aumenta a resistência a asparaginase. A IGFBP7 'leucêmica' junto com IGF/insulina atua sobre as células estromais, induzindo nestas células o aumento da produção de asparagina, e diminuindo a ação da asparaginase. Além deste mecanismo de resistência dependente das células estromais, mostramos que a IGFBP7 em conjunto com IGF/insulina promove a resistência das células leucêmicas à ação de outros compostos quimioterápicos (dexametasona e metotrexato) de forma independente da interação leucemia-estroma. Ainda pode ser observado que o plasma de crianças com LLA ao diagnóstico, apresenta maiores níveis de IGFBP7 do que em amostras controles. É importante ressaltar que níveis mais altos de mRNA IGFBP7 foram associados com menor sobrevida livre de leucemia (Modelo de regressão de Cox, P = 0,003), em células de LLAB Ph(-) presursoras / Abstract: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common type of cancer that affects children. It is known that the interaction between tumor and the cellular context of the host (tumor microenvironment) is reciprocal, ie, to the extent that the tumor stimulates their microenvironment, this enhances the survival, proliferation and tumor invasiveness. The interaction of ALL with bone marrow stromal cells has a positive impact on leukemia resistance to chemotherapy. In the present study, we investigated the modulation of a series of putative asparaginase-resistance/sensitivity genes in B-precursor ALL upon co-culture with stromal cells. We showed an increase expression and secretion of IGFBP7 in leukemic cells after co-culture with BMSCs. Assays with IGFBP7 knockdown in leukemic cells and stromal cells, showed that IGFBP7 acts as a positive regulator of cell growth and increases resistance to asparaginase. 'Leukemic' IGFBP7 together with IGF/insulin acts on stromal cells, increasing asparagine production, thus reducing the asparaginase effect. Besides this mechanism of resistance dependent of stromal cells, we showed that IGFBP7 in conjunction with IGF/insulin promotes the resistance of leukemia cells to the action of other chemotherapeutic compounds (dexamethasone and methotrexate) independently of the interaction leukemia-stroma. We still observed that diagnostic BM plasma from children with ALL at diagnosis, have higher levels of IGFBP7 than control samples. Importantly, higher levels of IGFBP7 mRNA were associated with lower leukemia-free survival (Cox regression model, P = 0.003) in precursor B-ALL Ph (-) patients / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Jorg Kobarg, Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T22:20:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trindade_DanielMaragno_D.pdf: 7352494 bytes, checksum: 5b03d143205e747b05e3d4b6a8ed8e34 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Staniocalcinas (STCs) representam uma pequena família de hormônios glicoprotéicos, encontrados em todos os vertebrados e composta por STC1 e STC2, que foram inicialmente implicados na homeostase de cálcio e recentemente também foram implicados em vários outros processos. Stanniocalcina-1 (STC1), o primeiro membro encontrado, foi originalmente descoberto em peixes ósseos e posteriormente identificado em humanos onde parece ter um papel, embora ainda obscuro, na carcinogênese e angiogênese. Nos seres humanos STC1 pode ser encontrado em duas formas: um dímero ou um grupo de variantes de alto peso molecular coletivamente chamados bigSTC. Uma vez que ambas as células leucêmicas e os tumores sólidos dependem vascularização, a angiogênese é um passo fundamental na interação tumorhospedeiro e essencial para a progressão do câncer. Análises prévias de microarray resultaram na identificação de vários genes ativados em células endoteliais da medula óssea (BMEC) modulados pela presença de células leucêmicas. Apresentamos aqui STC1 como um marcador microambiente de medula óssea (BMM) durante leucemia linfoblástica aguda (LLA) pela validação dos dados prévios de microarray através de PCR em tempo real quantitativos. Em vista da falta de informações funcionais e estruturais sobre STC1 realizamos: (1) um screen no sistema de duplo híbrido em levedura, a fim de encontrar algumas das proteínas que interagem com a STC1 humana, e (2) uma caracterização estrutural inicial à baixa resolução desta proteína. Fomos capazes de construir um mapa interação proteína-proteína, obtido a partir dos 22 interactantes encontrados em screen de duplo híbrido em levedura. As proteínas encontradas apresentam-se em vários compartimentos celulares nos quais STC1 já foi demonstrada para estar presente, e essas novas informações podem ajudar a esclarecer como e qual o papel STC1 desempenha nesses locais. A fim de fornecer informação estrutural sobre STC1, realizamos análises bioquímicas e estruturais da proteína recombinante STC1 com 6xHis tag produzida em células de inseto utilizando o sistema baculovírus. A análise de dicroísmo circular confirmou a predição in silico do elevado conteúdo de alfa-helices. A análise por espectrometria de massas forneceu os dados experimentais que confirmaram o padrão conservado de pontes dissulfeto anteriormente descrito para STC1 de peixes. Finalmente, os dados de espalhamento de raios-X a baixo ângulo demonstraram que, STC1 adota uma estrutura dimérica, ligeiramente alongada em solução fornecendo deste modo os primeiros dados estruturais à baixa resolução desta família de proteínas. Além disso, foi possível obter proteína suficiente e de elevado grau de pureza para realizar ensaios cristalização que resultaram em cristais os quais difrataram a boa resolução. / Abstract: Staniocalcins (STCs) represent a small family of glycoprotein hormones found in all vertebrates composed by STC1 and STC2, which have been initially implicated in calcium homeostasis and also recently implicated in several other processes. Stanniocalcin-1 (STC1), the first member found, was originally discovered in bony fishes and later identified in humans were it seems to have a role, although still unclear, in carcinogenesis and angiogenesis. In humans STC1 can be found in two forms: a dimer or a group of higher molecular weigh variants collectively called bigSTC. Since both leukemic cells and solid tumors depend on vascularization, angiogenesis is a fundamental step in tumor-host interaction and essential to the cancer progression. Previous microarray analysis resulted in the identification of several activated genes in bone marrow (BM) endothelial cells (BMEC) modulated by presence of leukemic cells. Here we present STC1 as a BM microenvironment marker during acute lymphoblastic leukemia (ALL) by validating previous microarray data by quantitative RealTime-PCR. In view of the lack of functional and structural information on STC1 we performed (1) a yeast two hybrid screen in order to find some of the human STC1 interacting proteins and (2) a initial structural lowresolution characterization of this protein. We were able to construct a protein-protein interaction map, derived from the 22 interactants found in our yeast two-hybrid screen. The proteins found are located in several cellular compartments in which STC1 has already been shown to be present, and the new information might help to clarify how and which role it performs at these sites. As a means to provide structural information about STC1, we performed biochemical and structural analyses of recombinant STC1 6xHis tagged protein produced in insect cells by using the baculovirus system. Circular dichroism analysis confirmed the in silico predicted high alpha-helical content. By mass spectroscopy analysis we provided experimental data that confirmed the conserved disulfide pattern previously described for fish STC1. Finally Small Angle X-ray Scattering data demonstrated that STC1 adopts a dimeric, slightly elongated structure in solution, providing there by the first low resolution structural data of this family of proteins. Additionally, we could obtain enough protein of high purity to perform crystallization trials that resulted in crystals diffracting at good resolution. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular