Orientador: Glauco Issamu Miyahara / Coorientador: Cáris Maroni Nunes / Banca: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Izabel Regina Fischer Rubira-Bullen / Resumo: A leucoplasia bucal é considerada uma lesão cancerizável para o desenvolvimento do carcinoma espinocelular (CEC), e vários fatores de risco podem estar relacionados a essa carcinogênese, incluindo o papiloma vírus humano (HPV). Na mucosa bucal tem sido feita a associação da leucoplasia bucal com o HPV. O objetivo desse estudo foi detectar a presença do DNA do HPV em amostras de tecidos fresco, saliva, plasma e células exfoliadas orais, extraídas de pacientes com e sem leucoplasia bucal, analisadas através da técnica de nested PCR (nPCR). Para este estudo foram avaliados 32 pacientes portadores de leucoplasia bucal e 24 pacientes selecionados de forma caso-controle. Foi realizada a extração de DNA das amostras, e em seguida a sua amplificação através da PCR. A nPCR para detecção do HPV revelou a presença do vírus em 68,75% das amostras de tecido fresco, 50% no plasma, 28,1% no citobrush, 62,5% na saliva no grupo de pacientes com leucoplasia em comparação com 45,8%, 54,2%, 45,8%, 50% nas amostras de tecido fresco, plasma, citobrush e saliva do grupo controle respectivamente. Baseado no presente estudo o HPV poderia ser um co-fator etiológico na patogênese da leucoplasia oral. / Abstract: The oral leukoplakia is considered as a pre-malignant lesion for the development of the oral squamous cell carcinoma, and several risk factors can be related to this carcinogenesis, including the human papillomavirus (HPV). HPV is the main cause of cervix cancer, and your role in the oral carcinogenesis is still controversial. The aims of this study was to detect the presence of HPV DNA in fresh tissue samples, plasma and oral exfoliated cells extracted from patients 32 with oral leukoplakia, and 24 controls analyzed through the technique of nPCR and make a comparison among these biological materials sources. It was performed the extraction of DNA from 37 patients with oral leukoplakia, and amplification of the human β-globin gene was carried out in all samples to confirm the presence and integrity of DNA. Nested PCR assays revealed the presence of HPV DNA in 68.75% of fresh tissue, 50.0% of plasma, 62.5% of saliva, and in 28.1% of oral exfoliated cells extracted from patients. Based on the current experiment, HPV could potentially be an etiologic co-factor in the pathogenesis of oral leukoplakia. / Mestre

Orientador: Andreia Bufalino / Resumo: As desordens potencialmente malignas orais (DPMOs) são apresentações clínicas que apresentam risco aumentado para o desenvolvimento de câncer na cavidade oral, seja ela uma lesão precursora definida ou mucosa clinicamente normal. Dentre as principais DPMOs, a leucoplasia oral (LO) se apresenta como uma placa branca não raspável de risco questionável, podendo ser homogênea ou não homogênea, cuja taxa de transformação maligna varia de 0,2% até 17,5%. Além disso, a LO apresenta os mesmos fatores de riscos que são observados no desenvolvimento de carcinoma espinocelular (CEC) oral, o qual é a principal neoplasia maligna que afeta a cavidade oral. Outra DPMO importante é a leucoplasia verrucosa proliferativa (LVP), a qual também se apresenta como uma placa branca não raspável, porém multifocal e possui um comportamento persistente e progressivo para malignidade, com taxa de transformação maligna de 70% até 100% dos casos. Diferente da LO, os fatores de risco como tabaco, álcool e noz de areca não parecem estar associados com o desenvolvimento da LVP. Adicionalmente, a LVP apresenta resposta inadequada a todas as modalidades de tratamento, sofre rápida disseminação pelos sítios orais e muitas vezes demonstra recorrência. Os graus de displasias identificados nas DPMOs são utilizados atualmente como preditores de risco para transformação maligna, no entanto diversos estudos têm mostrado que este não é um preditor fiel. Estudos recentes sugerem ainda que o infiltrado inflamatório asso... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Oral potentially malignant disorders (OPMDs) are clinical presentations that present an increased risk of cancer development in the oral cavity, whether in a clinically definable precursor lesion or clinically normal oral mucosa. Among the main OPMDs, oral leukoplakia (OL) presents itself as a non-scratchable white plaque of questionable risk, which can be homogeneous or non-homogeneous, whose malignant transformation rate varies from 0.2% to 17.5%. In addition, OL has the same risk factors that are observed in the development of oral squamous cell carcinoma (OSCC), which is the main malignant neoplasm affecting the oral cavity. Another important OPMD is proliferative verrucous leukoplakia (PVL), which also presents itself as a white, non-scratchable, but multifocal plaque and has a persistent and progressive behavior for malignancy, with a malignant transformation rate of 70% to 100% of the cases. Unlike OL, risk factors such as tobacco, alcohol and areca nut do not appear to be associated with the development of PVL. Additionally, PVL has a poor response to all treatment modalities, suffers rapid dissemination through oral sites and often shows recurrence. The degree of epithelial dysplasia identified in OPMDs is currently used as a risk predictor for malignant transformation, however several studies have shown that it is not a reliable predictor. Recent studies also suggest that the inflammatory infiltrate associated with OPMD may be due to its etiology and clinical compor... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

OBJETIVO: A perda de heterozigosidade (LOH) é capaz de avaliar as alterações genéticas de lesões potencialmente malignas. Este ensaio avalia as regiões cromossômicas polimórficas que estão próximas ou na região dos oncogenes e genes supressores de tumor conhecidos. Os objetivos desta tese foram três principais: 1) Avaliar a frequência de perda de heterozigosidade de leucoplasias bucais com diferentes graus de severidade histopatológico em regiões cromossômicas próximas aos genes supressores de tumores. 2) Comparar e correlacionar o perfil de perda de heterozigosidade entre indivíduos da British Columbia (Canadá) e Rio Grande do Sul (Brasil). 3) Avaliar os danos ao DNA que podem ocorrer durante o processamento e armazenamento das amostras de tecido parafinado. MÉTODOS: Amostras de leucoplasia bucal (com e sem displasias), fixadas em formalina tamponada 10% e parafinadas, obtidas nos laboratório de patologia bucal do Canadá e do Brasil foram selecionadas e microdissectadas. Procedeu-se a extração de DNA, amplificação por PCR das seguintes regiões microssatélites: 4q (D4S243, FABP2), 9p21 (IFNA, D9S171, D9S1748, D9S1751), 17p11.2 (CHRNB1) e 17p13.1 (tp53 e D17S786). Após o produto do PCR foi separado e visualizado em gel de poliacrilamida por autoradiografia. RESULTADOS: Observou-se uma forte correlação entre o perfil de perda de heterozigosidade entre indivíduos com leucoplasia bucal de ambos os países, independentemente da etnicidade. Além disso, pode-se notar que amostras de tecidos parafinados submetidos a mais de 24 horas de fixação em formalina tamponada 10% não serão, em sua maioria, boas amostras para análises de DNA. CONCLUSÃO: As lesões potencialmente malignas, provavelmente não são influenciadas em sua etiopatogênia pelas diferenças étnicas. O modelo de risco genético validado por Zhang e colaboradores (2012) parece ser aplicável em nossa comunidade, sendo necessário a sua validação, respeitando procedimentos técnicos padronizados. Ainda, vale ressaltar, que é imprescindível que a comunidade científica passe a adotar metodologias que preservem o material genético das peças dos bancos de tecidos parafinados, que são de inestimável valor para a pesquisa biomédica. / OBJECTIVE: Loss of heterozygosity (LOH) can evaluate genetic alterations of pre-malignant lesions. This assay evaluates the chromosomal polymorphic regions that are present in tumor suppressor genes and oncogenes. The main objectives of this thesis were: 1) Evaluate the frequency of LOH of oral leukoplakias with different histopathological degrees at chromosomal regions of tumor suppressor genes. 2) Compare the profile of LOH between individuals from British Columbia (Canada) and Rio Grande do Sul (Brazil). 3) Evaluate the DNA damage that may occur with FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) tissues. METHODS: FFPE samples of oral leukoplakia (with and without dysplasia), obtained in Canadian and Brazilian oral pathology laboratories were selected and microdissected. DNA extraction and PCR amplification of the following microsatellite regions were conducted: 4q (D4S243, FABP2), 9p21 (IFNA, D9S171, D9S1748, D9S1751), 17p11.2 (CHRNB1) and 17p13.1 (tp53 and D17S786). PCR products were separated and visualized on polyacrylamide gel by autoradiography. RESULTS: A strong correlation between the LOH profile among individuals with oral leukoplakia from both countries was observed, regardless ethnicity. Furthermore, FFPE tissues subjected to more than 24 hours of fixation in 10% buffered formalin are not, generally, good samples for DNA analysis. CONCLUSION: Pre-malignant lesions etiopathogenesis may not be influenced by ethnicity. The genetic risk model validated by Zhang et al. (2012) seems to be applicable in our community, requiring its own validation, respecting standardized procedures. Still, it is important to emphasize that it is imperative that a scientific community adopts methodologies that preserve the genetic material FFPE tissues that are an invaluable resource for biomedical research.

Autofagia é o processo catabólico que ocorre nos lisossomos, e tem por finalidade degradar os componentes celulares e proteínas que já não são mais funcionantes e, assim manter seu equilíbrio homeostático para sobreviverem adequadamente em condições estressantes. Diante das funções biológicas da autofagia identificadas até hoje, a relação entre autofagia celular e neoplasias está provavelmente entre as mais estudadas, devido ao papel duplo que a autofagia exerce sobre o desenvolvimento do câncer, podendo atuar como um mecanismo supressor de tumor ou, podendo ser um mecanismo fundamental para a sobrevivência de células neoplásicas. No entanto, em lesões potencialmente malignas não se sabe sobre o comportamento do processo autofágico. Dessa forma, nosso estudo se propôs a estudar o comportamento da autofagia em neoplasias e em lesões potencialmente malignas bucais e correlacionar com os parâmetros clínicos e a evolução dessas lesões. Para tal finalidade foi utilizado a técnica de imunoistoquímica para avaliar em amostras de mucosa normal, leucoplasias e carcinomas espinocelulares bucais, o percentual de células positivas para o marcador LC3-II. Foram avaliadas 7 amostras de mucosa bucal normal, 51 leucoplasias e 120 carcinomas espinocelulares. Para a análise de carcinomas espinocelulares foi construído um microarranjo tecidual com 2 cilindros de cada paciente. Observamos o aumento dos níveis de autofagia no carcinoma espinocelular bucal (p<0,001) em relação aos outro grupos, porém sem associação com a evolução e sobrevida desses pacientes. Entre as leucoplasias, observamos maior percentual de células positivas na camada intermediária de leucoplasias 12 displásicas (p=0,0319) e na camada basal de lesões com pior evoluação (p=0,0133). Concluimos que os níveis de autofagia aumentam durante o processo de carcinogênese bucal e estão correlacionados com o pior comportamento das leucoplasias. / Autophagy is a catabolic process to digest the cell components and proteins that are no functional anymore. Autophagy maintains the homeostasis in order to cells survive in stressful conditions. In view of the biological functions of autophagy identified to date, the relationship between cellular autophagy and neoplasia is probably among the most studied, due to the dual role that autophagy exerts on the development of cancer. Cell autophagy can act as a tumor suppressor mechanism, or as a key mechanism for the survival of neoplastic cells. However, it is not known in potentially malignant lesions how the autophagic process is controlled. Therefore, the purpose of this study is to assess the autophagic process in oral cancer and potentially malignant oral lesions and to correlate with clinical parameters and the evolution of these lesions. For this purpose, the immunohistochemical technique was used to evaluate the percentage of cells positive for the LC3-II marker in the normal mucosa, leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples. Seven samples of normal buccal mucosa, 51 leukoplakia and 120 squamous cell carcinomas were evaluated. For the squamous cell carcinomas analysis, a tissue microarray with 2 cylinders of each patient was constructed. We observed increased levels of autophagy in oral squamous cell carcinoma (p <0.001) in relation to the other groups, however no association with the prognosis and survival of these patients was detected. Among the leukoplakias, we observed a higher percentage of positive cells in the intermediate layer of dysplastic leukoplakias (p = 0.0319) and in the basal layer of lesions with worse prognosis (p = 0.0133). We conclude that autophagy levels increase during the process of oral carcinogenesis and are correlated with the worse behavior of leukoplakia

Orientador: Glauco Issamu Miyahara / Coorientador: Daniel Galera Bernabé / Coorientadora: Kellen Cristine Tjioe / Banca: Maria José Hitomi Nagata / Banca: Luciana Estevam Simonato de Oliveira / Resumo: Objetivo: Avaliar a presença do HPV-16 em tecido fresco, saliva e plasma sanguíneo de pacientes com leucoplasia bucal pela real time PCR na região noroeste do estado de São Paulo, Brasil. Pacientes e métodos: Trinta e sete pacientes com diagnóstico de leucoplasia bucal foram incluídos no estudo. Destes, foram obtidos dados sociodemográficos, clinicopatológicos, estilo de vida e amostras de tecido fresco, sangue e saliva que foram armazenados a -80ºC para posterior análise molecular. Os materiais obtidos destes pacientes foram submetidos à detecção do DNA viral pela técnica da real time PCR com sonda específica para o HPV-16. Resultados: Dos 37 pacientes incluídos no estudo, 64,8% eram homens e a idade variou de 25 a 82 anos, com uma média de 58,72 anos. Dezesseis pacientes (43,2%) eram idosos e 43,2%, adultos de meia idade, e apenas 13,6%, adultos jovens. A maioria dos pacientes era fumante (72,9%), sendo que 16,3% eram ex-fumantes e 10,8%, não fumantes. Da mesma forma, a maioria (62,2%) era etilista, 21,6%, ex-etilistas e 16,2%, não-etilistas. Vinte e sete por cento das lesões apresentaram algum grau de displasia epitelial. A detecção do HPV-16 pela PCR em tempo real não foi positiva para nenhuma amostra, resultando em um índice de 0% de detecção. Conclusão: O HPV-16 não foi identificado na população estudada. No entanto, outros subtipos do HPV de baixo e alto risco podem estar associados à ocorrência de leucoplasia bucal nesta população, o que requer novas investigações. Es... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objective: To evaluate the prevalence of HPV-16 DNA detection in fresh tissue, saliva and blood plasma from patients with oral leukoplakia by the real time PCR in the northwest region of the São Paulo state, Brazil. Patients and methods: Thirty-seven patients diagnosed with oral leukoplakia were included in the study. Sociodemographic, clinicopathologic and lifestyle data, fresh tissue, saliva and blood plasma samples were collected. Biologic material was stored at -80ºC and then submitted to viral DNA detection by the real time PCR technique with a probe specific for HPV-16. Results: Of the 37 patients included in the study, 64.8% were men, and the age ranged from 25 to 82 years, with a mean of 58.72. Sixteen patients (43.2%) were elderly, 43.2% were middle-aged adults, and only 13.6% were young adults. Most patients were smokers (72.9%), 16.3% were former smokers, and 10.8% were non-smokers. Most patients (62.2%) were current drinkers, 21.6% were ex-drinkers and 16.2% were non-drinkers. Twenty seven percent of the lesions presented some degree of dysplasia. HPV-16 detection by real-time PCR was not positive for any sample, resulting in a 0% detection rate. Conclusion: The HPV-16 was not identified in the population studied. However, other low and high-risk HPV subtypes might be associated to the occurrence of oral leukoplakia in this population, which requires further investigations. Broader epidemiological studies are required to clarify the geographic variability in the p... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A espectroscopia Raman é uma das tecnologias ópticas que tem ganho cada vez mais destaque na oncologia. Esta tecnologia fornece a composição molecular dos mais variados tipos de amostras, inclusive biofluidos, células e tecidos. Na tentativa de avaliar sua aplicação em lesões bucais, o objetivo deste trabalho foi obter um perfil espectral dos distúrbios epiteliais nãodisplásicos, displásicos, e do carcinoma espinocelular bucal, bem como verificar a possibilidade diagnosticar estas alterações pelos espectros. Inicialmente, foram usados 44 amostras de mucosa bucal em blocos de parafina, com diagnóstico de hiperplasia epitelial, hiperparaceratose, displasia epitelial e carcinoma espinocelular bucal. Da porção epitelial de cada uma destas amostras foram obtidos 10 espectros Raman. A média dos espectros de cada alteração gerou um perfil espectral correspondente à sua composição química. Os resultados desta análise apresentaram picos ou bandas espectrais referentes a moléculas usualmente encontradas nos tecidos biológicos: proteínas, lipídios e DNA. Em seguida, os dados espectrais foram submetidos a análise dos componentes principais (PCA) e análise discriminante linear (LDA), onde foi encontrada uma eficiência de 86,36% no uso da Espectroscopia Raman para o diagnóstico de alterações epiteliais. A validade do método foi comprovada pela Curva Roc resultando em 91% de sensibilidade e 96,9% de especificidade. Em um segundo momento, com a finalidade de avaliar a influência da fixação com formalina nas análises espectrais, a superfície epitelial de uma amostra de tecido bucal fresca ex vivo foi submetida a análise pela Espectroscopia Raman e armazenada em formalina tamponada a 10% por 24h para posteriormente se obter outro espectro. A análise comparativa entre os perfis espectrais de uma mesma amostra antes e após a fixação, demonstraram diferenças em relação aos picos de proteínas e DNA, que podem modificar o perfil espectral da alteração analisada e, portanto, gerar algum erro de classificação. De maneira geral, pelos resultados desta pesquisa, observou-se que a Espectroscopia Raman é uma tecnologia eficiente para identificar a composição molecular de amostras de tecido, seja imediatamente após a excisão cirúrgica, fixação em formalina ou emblocadas em parafina. Entretanto, deve-se considerar que estas a diferentes formas de condicionamento influenciarão diretamente no resultado dos espectros. / Raman spectroscopy (RS) is one of the optical technologies that has garnered a great deal of interest in oncology. This technology provides the molecular composition of various types of samples, including biofluids, cells and tissues. In an attempt to assess its application in oral lesions, the purpose of this study was to obtain a spectral profile of epithelial disorders non-dysplastic, dysplastic, and oral squamous cell carcinoma, as well as checking the ability to diagnose these changes by the spectra. Initially, 44 samples of oral mucosa formali-fixed paraffin embebed were used with epithelial hyperplasia, hyperparakeratosis, epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinoma. From the epithelial area of each sample were obtained 10 Raman spectra. The average of the spectra of each change generated a spectral profile corresponding to its chemical composition. Results of this analysis showed peaks or spectral bands related to molecules generally found in biological tissues: proteins, lipids and DNA. Then the spectral data were submitted to principal component analysis (PCA) and linear discriminant analysis (LDA), which was found 86.36% efficiency in the use of Raman spectroscopy (RS) for diagnosis of epithelial changes. The validity of the method was confirmed by Roc curve resulting in 91% sensitivity and 96.9% specificity. In a second step, in order to evaluate the influence of fixation with formalin in the spectral analysis, the epithelial surface of a sample of freshly biopsied oral tissue was subjected to analysis by RS and stored in 10% formalin for 24 hours for later obtain another spectrum. The comparative analysis of the spectral profiles of the same sample, before and after fixation, shows differences relative to spectral peaks of proteins and DNA that can modify the spectral profile of the analyzed change and thus generate some misclassification. In general, the results of this research, it was observed that Raman spectroscopy is an efficient technology to identify the molecular composition of tissue samples, either immediately after surgical excision, either after fixation in formalin and embedded in paraffin. However, it should be considered that these different means of conditioning will influence the outcome of the spectra.

Leucoplasia bucal (LB) é uma desordem potencialmente maligna, com risco de transformação maligna que varia de 0,13% a 17,5%. Muitos estudos vêm buscando estabelecer biomarcadores capazes de predizer o potencial de transformação maligna dessa lesão. O Ki-67 é uma proteína não-histônica nuclear que tem sido amplamente utilizada para avaliar proliferação celular. O BMI-1 é uma proteína considerada um marcador essencial para a manutenção das propriedades de autorrenovação e da tumorigenicidade do carcinoma espinocelular. O objetivo principal desse estudo observacional transversal foi avaliar proliferação e imortalização celulares em LB a partir da marcação imunoistoquímica do Ki-67 e do BMI-1, comparando lesões displásicas com não displásicas. Casos de LB não displásica - LBND (n=28), LB displásica - LBD (n=33) foram selecionados a partir de prontuários de pacientes e comparados com mucosa clinicamente normal - MN (n=9), hiperplasia inflamatória - HI (n=17) e carcinoma espinocelular - CEC (n=19). Os diagnósticos histopatológicos foram confirmados a partir da revisão de cortes histológicos corados por hematoxilina e eosina. Adicionalmente, cortes histológicos foram submetidos à técnica imunoistoquímica para avaliação de Ki-67 e BMI-1. Para a quantificação foi considerado o percentual de células positivas por 1000 células para o CEC e 1500 células para os demais grupos. O percentual de imunomarcação de Ki-67 e de BMI-1, quando avaliadas todas as camadas epiteliais em conjunto, foi mais alto no CEC quando comparado aos demais grupos (Kruskal-Wallis, p<0.05). A expressão de Ki-67 foi maior em LBND, LBD e HI quando comparada com MN (Kruskal-Wallis, p<0.05). Além disso, a imunomarcação de BMI-1 foi maior em LBD quando comparada com MN, quando analisadas todas as camadas em conjunto (Kruskal-Wallis, p<0.05). A partir da avaliação das camadas epiteliais separadamente, observou-se aumento da expressão de BMI-1 na camada parabasal e suprabasal em LBND quando comparada com MN. Houve correlação positiva entre Ki-67 e BMI-1 (Correlação de Spearman, R=0.37, p<0.05). Conclui-se que a proliferação e as alterações na transição epitélio-mesênquima são eventos relacionados e que estão presentes desde estágios precoces e se acentuam nos estágios mais tardios da carcinogênese. / Oral leukoplakia (OL) is potentially malignant disorder, with a risk of malignant transformation that ranges from 0.13% to 17.5%. Many biological markers have been used as an attempt to predict malignant transformation, but no reliable markers have been established so far. The Ki-67 is a nuclear non-histone regarded as reliable marker of proliferating cells .BMI-1 is a protein considered as an essential marker for maintenance of properties self-renewability and tumorigenicity of squamous cell carcinoma. The main aim this cross-sectional observational study was to evaluate cell proliferation and immortalization in oral leukoplakia, comparing non-dysplastic and dysplastic lesions. Cases of non-dysplastic – Non-dys OL (n=28), dysplastic – Dys OL (n=33) records were selected and compared with normal oral mucosa – NOM (n=9), inflammatory hyperplasia –IH (n=17), and oral squamous cell carcinoma - OSCC (n=19). The histopathological diagnosis was confirmed by the revision of Hematoxilin and Eosin stained slides. Additionally, histological sections were submitted to immunohistochemical technique for evaluation of Ki-67 and BMI-1. The labeling index was determined by counting the labeled nuclei of 1000 cells for OSCC cases and 1500 for the others comparison groups. Ki-67 and BMI-1 immunolabeling percentage were higher in OSCC in comparison of others groups when all epithelial layers were evaluated together (Kruskal-Wallis, p<0.05). Ki-67 immunolabeling increased in Non-dys OL, Dys OL and IH when compared to NOM (Kruskal-Wallis, p<0.05). Furthermore, BMI-1 immunolabeling was higher in Dys OL relation to NOM in the analysis of all epithelial layers together (Kruskal-Wallis, p<0.05). When the evaluation considered the epithelial layer separately, an increased BMI1 expression was observed in the parabasal and suprabasal layers of Non-dys OL when compared to NOM. A significant positive correlation was found between Ki-67 and BMI-1 (Spearman correlation coefficient, R=0.37, p<0.01). In conclusion, the present findings support that proliferation and changes toward epithelial-to-mesenchymal transition increase gradually since early stages of oral carcinogenesis.

A espectroscopia Raman é uma das tecnologias ópticas que tem ganho cada vez mais destaque na oncologia. Esta tecnologia fornece a composição molecular dos mais variados tipos de amostras, inclusive biofluidos, células e tecidos. Na tentativa de avaliar sua aplicação em lesões bucais, o objetivo deste trabalho foi obter um perfil espectral dos distúrbios epiteliais nãodisplásicos, displásicos, e do carcinoma espinocelular bucal, bem como verificar a possibilidade diagnosticar estas alterações pelos espectros. Inicialmente, foram usados 44 amostras de mucosa bucal em blocos de parafina, com diagnóstico de hiperplasia epitelial, hiperparaceratose, displasia epitelial e carcinoma espinocelular bucal. Da porção epitelial de cada uma destas amostras foram obtidos 10 espectros Raman. A média dos espectros de cada alteração gerou um perfil espectral correspondente à sua composição química. Os resultados desta análise apresentaram picos ou bandas espectrais referentes a moléculas usualmente encontradas nos tecidos biológicos: proteínas, lipídios e DNA. Em seguida, os dados espectrais foram submetidos a análise dos componentes principais (PCA) e análise discriminante linear (LDA), onde foi encontrada uma eficiência de 86,36% no uso da Espectroscopia Raman para o diagnóstico de alterações epiteliais. A validade do método foi comprovada pela Curva Roc resultando em 91% de sensibilidade e 96,9% de especificidade. Em um segundo momento, com a finalidade de avaliar a influência da fixação com formalina nas análises espectrais, a superfície epitelial de uma amostra de tecido bucal fresca ex vivo foi submetida a análise pela Espectroscopia Raman e armazenada em formalina tamponada a 10% por 24h para posteriormente se obter outro espectro. A análise comparativa entre os perfis espectrais de uma mesma amostra antes e após a fixação, demonstraram diferenças em relação aos picos de proteínas e DNA, que podem modificar o perfil espectral da alteração analisada e, portanto, gerar algum erro de classificação. De maneira geral, pelos resultados desta pesquisa, observou-se que a Espectroscopia Raman é uma tecnologia eficiente para identificar a composição molecular de amostras de tecido, seja imediatamente após a excisão cirúrgica, fixação em formalina ou emblocadas em parafina. Entretanto, deve-se considerar que estas a diferentes formas de condicionamento influenciarão diretamente no resultado dos espectros. / Raman spectroscopy (RS) is one of the optical technologies that has garnered a great deal of interest in oncology. This technology provides the molecular composition of various types of samples, including biofluids, cells and tissues. In an attempt to assess its application in oral lesions, the purpose of this study was to obtain a spectral profile of epithelial disorders non-dysplastic, dysplastic, and oral squamous cell carcinoma, as well as checking the ability to diagnose these changes by the spectra. Initially, 44 samples of oral mucosa formali-fixed paraffin embebed were used with epithelial hyperplasia, hyperparakeratosis, epithelial dysplasia and oral squamous cell carcinoma. From the epithelial area of each sample were obtained 10 Raman spectra. The average of the spectra of each change generated a spectral profile corresponding to its chemical composition. Results of this analysis showed peaks or spectral bands related to molecules generally found in biological tissues: proteins, lipids and DNA. Then the spectral data were submitted to principal component analysis (PCA) and linear discriminant analysis (LDA), which was found 86.36% efficiency in the use of Raman spectroscopy (RS) for diagnosis of epithelial changes. The validity of the method was confirmed by Roc curve resulting in 91% sensitivity and 96.9% specificity. In a second step, in order to evaluate the influence of fixation with formalin in the spectral analysis, the epithelial surface of a sample of freshly biopsied oral tissue was subjected to analysis by RS and stored in 10% formalin for 24 hours for later obtain another spectrum. The comparative analysis of the spectral profiles of the same sample, before and after fixation, shows differences relative to spectral peaks of proteins and DNA that can modify the spectral profile of the analyzed change and thus generate some misclassification. In general, the results of this research, it was observed that Raman spectroscopy is an efficient technology to identify the molecular composition of tissue samples, either immediately after surgical excision, either after fixation in formalin and embedded in paraffin. However, it should be considered that these different means of conditioning will influence the outcome of the spectra.

OBJETIVO: A perda de heterozigosidade (LOH) é capaz de avaliar as alterações genéticas de lesões potencialmente malignas. Este ensaio avalia as regiões cromossômicas polimórficas que estão próximas ou na região dos oncogenes e genes supressores de tumor conhecidos. Os objetivos desta tese foram três principais: 1) Avaliar a frequência de perda de heterozigosidade de leucoplasias bucais com diferentes graus de severidade histopatológico em regiões cromossômicas próximas aos genes supressores de tumores. 2) Comparar e correlacionar o perfil de perda de heterozigosidade entre indivíduos da British Columbia (Canadá) e Rio Grande do Sul (Brasil). 3) Avaliar os danos ao DNA que podem ocorrer durante o processamento e armazenamento das amostras de tecido parafinado. MÉTODOS: Amostras de leucoplasia bucal (com e sem displasias), fixadas em formalina tamponada 10% e parafinadas, obtidas nos laboratório de patologia bucal do Canadá e do Brasil foram selecionadas e microdissectadas. Procedeu-se a extração de DNA, amplificação por PCR das seguintes regiões microssatélites: 4q (D4S243, FABP2), 9p21 (IFNA, D9S171, D9S1748, D9S1751), 17p11.2 (CHRNB1) e 17p13.1 (tp53 e D17S786). Após o produto do PCR foi separado e visualizado em gel de poliacrilamida por autoradiografia. RESULTADOS: Observou-se uma forte correlação entre o perfil de perda de heterozigosidade entre indivíduos com leucoplasia bucal de ambos os países, independentemente da etnicidade. Além disso, pode-se notar que amostras de tecidos parafinados submetidos a mais de 24 horas de fixação em formalina tamponada 10% não serão, em sua maioria, boas amostras para análises de DNA. CONCLUSÃO: As lesões potencialmente malignas, provavelmente não são influenciadas em sua etiopatogênia pelas diferenças étnicas. O modelo de risco genético validado por Zhang e colaboradores (2012) parece ser aplicável em nossa comunidade, sendo necessário a sua validação, respeitando procedimentos técnicos padronizados. Ainda, vale ressaltar, que é imprescindível que a comunidade científica passe a adotar metodologias que preservem o material genético das peças dos bancos de tecidos parafinados, que são de inestimável valor para a pesquisa biomédica. / OBJECTIVE: Loss of heterozygosity (LOH) can evaluate genetic alterations of pre-malignant lesions. This assay evaluates the chromosomal polymorphic regions that are present in tumor suppressor genes and oncogenes. The main objectives of this thesis were: 1) Evaluate the frequency of LOH of oral leukoplakias with different histopathological degrees at chromosomal regions of tumor suppressor genes. 2) Compare the profile of LOH between individuals from British Columbia (Canada) and Rio Grande do Sul (Brazil). 3) Evaluate the DNA damage that may occur with FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) tissues. METHODS: FFPE samples of oral leukoplakia (with and without dysplasia), obtained in Canadian and Brazilian oral pathology laboratories were selected and microdissected. DNA extraction and PCR amplification of the following microsatellite regions were conducted: 4q (D4S243, FABP2), 9p21 (IFNA, D9S171, D9S1748, D9S1751), 17p11.2 (CHRNB1) and 17p13.1 (tp53 and D17S786). PCR products were separated and visualized on polyacrylamide gel by autoradiography. RESULTS: A strong correlation between the LOH profile among individuals with oral leukoplakia from both countries was observed, regardless ethnicity. Furthermore, FFPE tissues subjected to more than 24 hours of fixation in 10% buffered formalin are not, generally, good samples for DNA analysis. CONCLUSION: Pre-malignant lesions etiopathogenesis may not be influenced by ethnicity. The genetic risk model validated by Zhang et al. (2012) seems to be applicable in our community, requiring its own validation, respecting standardized procedures. Still, it is important to emphasize that it is imperative that a scientific community adopts methodologies that preserve the genetic material FFPE tissues that are an invaluable resource for biomedical research.

Autofagia é o processo catabólico que ocorre nos lisossomos, e tem por finalidade degradar os componentes celulares e proteínas que já não são mais funcionantes e, assim manter seu equilíbrio homeostático para sobreviverem adequadamente em condições estressantes. Diante das funções biológicas da autofagia identificadas até hoje, a relação entre autofagia celular e neoplasias está provavelmente entre as mais estudadas, devido ao papel duplo que a autofagia exerce sobre o desenvolvimento do câncer, podendo atuar como um mecanismo supressor de tumor ou, podendo ser um mecanismo fundamental para a sobrevivência de células neoplásicas. No entanto, em lesões potencialmente malignas não se sabe sobre o comportamento do processo autofágico. Dessa forma, nosso estudo se propôs a estudar o comportamento da autofagia em neoplasias e em lesões potencialmente malignas bucais e correlacionar com os parâmetros clínicos e a evolução dessas lesões. Para tal finalidade foi utilizado a técnica de imunoistoquímica para avaliar em amostras de mucosa normal, leucoplasias e carcinomas espinocelulares bucais, o percentual de células positivas para o marcador LC3-II. Foram avaliadas 7 amostras de mucosa bucal normal, 51 leucoplasias e 120 carcinomas espinocelulares. Para a análise de carcinomas espinocelulares foi construído um microarranjo tecidual com 2 cilindros de cada paciente. Observamos o aumento dos níveis de autofagia no carcinoma espinocelular bucal (p<0,001) em relação aos outro grupos, porém sem associação com a evolução e sobrevida desses pacientes. Entre as leucoplasias, observamos maior percentual de células positivas na camada intermediária de leucoplasias 12 displásicas (p=0,0319) e na camada basal de lesões com pior evoluação (p=0,0133). Concluimos que os níveis de autofagia aumentam durante o processo de carcinogênese bucal e estão correlacionados com o pior comportamento das leucoplasias. / Autophagy is a catabolic process to digest the cell components and proteins that are no functional anymore. Autophagy maintains the homeostasis in order to cells survive in stressful conditions. In view of the biological functions of autophagy identified to date, the relationship between cellular autophagy and neoplasia is probably among the most studied, due to the dual role that autophagy exerts on the development of cancer. Cell autophagy can act as a tumor suppressor mechanism, or as a key mechanism for the survival of neoplastic cells. However, it is not known in potentially malignant lesions how the autophagic process is controlled. Therefore, the purpose of this study is to assess the autophagic process in oral cancer and potentially malignant oral lesions and to correlate with clinical parameters and the evolution of these lesions. For this purpose, the immunohistochemical technique was used to evaluate the percentage of cells positive for the LC3-II marker in the normal mucosa, leukoplakia and oral squamous cell carcinoma samples. Seven samples of normal buccal mucosa, 51 leukoplakia and 120 squamous cell carcinomas were evaluated. For the squamous cell carcinomas analysis, a tissue microarray with 2 cylinders of each patient was constructed. We observed increased levels of autophagy in oral squamous cell carcinoma (p <0.001) in relation to the other groups, however no association with the prognosis and survival of these patients was detected. Among the leukoplakias, we observed a higher percentage of positive cells in the intermediate layer of dysplastic leukoplakias (p = 0.0319) and in the basal layer of lesions with worse prognosis (p = 0.0133). We conclude that autophagy levels increase during the process of oral carcinogenesis and are correlated with the worse behavior of leukoplakia