Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-11-30T11:59:08Z No. of bitstreams: 1 fabio_p_m_santos_ioc_bcm_0037_2011.pdf: 10305796 bytes, checksum: 74de5b830c8354cd532f74bd40993c6a (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-30T11:59:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fabio_p_m_santos_ioc_bcm_0037_2011.pdf: 10305796 bytes, checksum: 74de5b830c8354cd532f74bd40993c6a (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Durante a resposta alérgica, dentre os vários mediadores inflamatórios de natureza lipídica, a prostaglandina D2 (PGD2) é considerada um mediador-chave. Em adição aos seus conhecidos efeitos quimiotáticos para eosinófilos, recentemente, foi descrito que a PGD2 é também capaz de promover a ativação dos eosinófilos, induzindo a biogênese de corpúsculos lipídicos e a síntese de leucotrieno C4 (LTC4) nessas organelas recém-formadas. Esses efeitos são atribuídos a ação da PGD2 sobre seus 2 receptores – DP1 e DP2 – os quais encontram-se expressos de maneira constitutiva na membrana dos eosinófilos. Então, o objetivo principal do estudo foi identificar o receptor específico da PGD2 envolvido no mecanismo de síntese de LTC4 por eosinófilos estimulados com PGD2. In vivo, num modelo murino de pleurisia alérgica e induzida por PGD2, a utilização dos antagonistas seletivos do receptor DP1 (BW A868c) ou do receptor DP2 (CAY10471) inibiu a síntese de LTC4 nessas respostas inflamatórias. No entanto, somente BWA868C foi capaz de inibir a biogênese de corpúsculos lipídicos nos eosinófilos recrutados para o sítio inflamatório; enquanto que o tratamento com o CAY10471, diminuiu o número de eosinófilos infiltrantes na cavidade pleural, mas não inibiu a biogênese de corpúsculos lipídicos nessas poucas células recrutadas. In vitro, eosinófilos humanos purificados estimulados com PGD2 tiveram a síntese de LTC4 inibida tanto pelo pré-tratamento com BWA868c, quanto pelo prétratamento com CAY10471. Além disso, a ativação do receptor DP1, com seu agonista seletivo (BW245c) e a ativação do receptor DP2 com o agonista seletivo do receptor DP2 (DK-PGD2) corroborou a observação de que no processo de síntese de LTC4 nos eosinófilos, ambos os receptores são necessáior, pois somente quando ambos os receptores foram ativados simultaneamente foi observada síntese de LTC4 nos corpúsculos lipídicos recém-formados (Eicosacell). Além disso, caracterizamos que uma das vias de sinalização intracelular envolvida na formação de corpúsculos lipídicos é depende da ativação de proteína quinase A (PKA). Em um outro grupo de ensaios, investigamos a PGD2 como potencial alvo terapêutico em doenças alérgicas. Recentemente, foi descrito que o extrato aquoso de C. sympodialis e a warafteína (alcalóide isolado) têm propriedades antialérgicas, visto que não somente reduzem a eosinofilia, mas também, a biogênese de corpúsculos lipídicos, assim como a produção de leucotrienos cisteinados. Dessa forma, aqui demonstramos que os pré-tratamentos tanto com o extrato quanto com o alcalóide isolado, foram capazes de inibir a produção de PGD2 ocorrida durante a resposta alérgica. In vitro, embora a warafteína não tenha inibido a biogênese de corpúsculos lipídicos em eosinófilos induzida por PGD2, observamos que é capaz de bloquear a liberação de PGD2 por mastócitos ativados – mas, não a produção de PGE2 por macrófagos ativados com A23187 – demonstrando que o mecanismo de ação dos seus efeitos antiinflamatórios não parecem envolver antagonismo de receptores em eosinófilos, e sim inibição da síntese da PGD2 em sítios alérgicos. / During allergic response, among several lipid mediators produced, prostaglandin D2 (PGD2) has emerged as key mediator. In addition to its known eosinophilotatics effects, recently PGD2 was described to be able to promote eosinophil activation, inducing lipid bodies biogenesis and LTC4 synthesis within these newly formed organelles. These effects are attributed to the action of PGD2 on its 2 receptors – DP1 e DP2 – which are expressed constituvely on eosinophil cell membranes. So, the main objective of this study was to identify the PGD2 specific receptor involved in LTC4 synthesis mechanism by stimulated eosinophils with PGD2. In vivo, in a murine allergic model of pleurisy and in a pleurisy induced by PGD2, the use of selective DP1 receptor (BWA868c) and DP2 receptor (CAY10471) antagonists showed us that both treatments inhibited LTC4 synthesis during these inflammatory responses. However, only BWA868C treatment was able to inhibit lipid bodies biogenesis within recruited eosinophils to the inflammatory sites, while CAY10471, decreased the number of infiltrated eosinophils in the pleural cavity, but did not inhibit lipid bodies biogenesis within these low number of recruited cells. In vitro, pre-treatment with BWA868c or CAY10471 inhibited LTC4 synthesis by human eosinophils stimulated with PGD2. Moreover, the activation of DP1 receptor with its selective agonist (BW245c) and DP2 activation with DP2 selective agonist (DK-PGD2) reinforced the observation that during LTC4 synthesis within eosinophils, activation of both receptors are necessary, because only simultaneous activation of DP1 and DP2, induced LTC4 synthesis within eosinophilic lipid bodies (Eicosacell). Moreover, we observed that the pathway of cellular signaling involved on lipid bodies biogenesis induced by DP1 activation is dependent on protein kinase A (PKA). In another set of experiments, we investigated PGD2 as a therapeutical target of allergic diseases. Recently, it was described that aqueous extract of C.sympodialis and warafteine (isolated alkaloid) have antiallergic properties, because of its effects on the reduction of eosinophils recruitment, lipid bodies biogenesis and cysteinyl leukotrienes synthesis. Here, we demonstrated that pre-treatments with extract and its alkaloid were able to inhibit PGD2 production during allergic response. In vitro, warafteine did not inhibit eosinophil lipid bodies biogenesis induced by PGD2, but it was capable to inhibit PGD2 release by activated mast cells – otherwise fail to blockade PGE2 production by A23187- activated macrophages – suggesting that the action mechanism of its antiinflammatory effects could occur through PGD2 synthesis inhibition in allergic sites.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Growing evidence has shown that leukotrienes are important contributors in the pathophysiology of several SNC inflammatory diseases where excitotoxicity is involved, including traumatic brain injury, encephalitis, Parkinson's disease, ischemia, epilepsy and neuropathic pain. However little is known about the molecular mechanism by which leukotrienes facilitate excitatory activity in the brain. Thus, in this study we investigated the effect of antagonists for cysteinyl leukotrienes receptors (CysLT) on PTZ-induced seizure in mice. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelukast (0.03 and 0.3 μmol) and pranlukast (1 and 3 μmol), increased the latency to generalized seizures and decreased the mean amplitude of EEG recordings during seizures. LTD4 (0.2 and 2 pmol) reverted the anticonvulsant effect of montelukast (0.3 μmol). Montelukast (0.03 and 0.3 μmol) prevented PTZ-induced BBB disruption, an effect that was reversed by LTD4 (6 pmol). In addition, doses of LTD4 (0.2 and 2 pmol) which reversed the effect of montelukast in crisis did not alter the protective effect of montelukast on the barrier, dissociating the anticonvulsant of protective effect on BBB. The confocal microscopy analysis revealed that 1. PTZ increased the number of CD45+ and IgG cells in cerebral cortex, indicating BBB leakage with leukocyte infiltration; 2. while LTD4 (6 pmol) potentiated, montelukast decreased the effect of PTZ on leukocyte migration. Considering that increase levels of leukotrienes and decrease in Na+,K+-ATPase are common findings in several excitotoxic conditions, including epileptic seizures, we also investigated the effects of LTD4 on the activity of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices. LTD4 10 and 100 nM decreases Na+,K+-ATPase activity alpha 2, 3 and alpha 1 subunits, respectively, in mice hippocampal slices. The inhibitory effect of LTD4 on Na+,K+-ATPase activity was not observed in hippocampal homogenates, indicating that it requires intact cells. Moreover, we showed that LTD4-induced decrease Na+,K+-ATPase activity was reversed by CysLT1R inverse agonis, montelukast (1 μM). In addition, we also showed that possibly the PKC activation pathway is involved in LTD4-induced decrease of Na+,K+-ATPase activity in mice hippocampal slices, since PKC inhibitor, GF 109203X (0,3 μM), prevent this effect. Finally, but not least important, we have demonstrated that animals injected with LTD4 (2 pmol/3 μL icv), there also occurs a decrease in Na+,K+-ATPase activity, corroborating our in vitro findings and confirming the biological importance of this work. In summary, we showed that CysLT1 receptor activation modulates hippocampal Na+,K+-ATPase activity in mice, suggesting a possible mechanism for the involvement of leukotrienes in several dosorders related with brain inflammation and hyperexcitability. / Evidências crescentes têm mostrado que os leucotrienos são importantes contribuintes na patofisiologia de diversas doenças inflamatórias do sistema nervoso central nas quais a excitotoxicidade esteja envolvida, incluindo trauma crânio-encefálico, encefalite, doença de Parkinson, isquemia, dor neuropática e epilepsia. Entretanto pouco se sabe sobre o mecanismo molecular pelo qual os leucotrienos facilitam a atividade excitatória no encéfalo. Assim, neste trabalho investigamos o efeito de antagonistas para receptores de leucotrienos cisteínicos (CysLT) sobre as convulsões induzidas por PTZ em camundongos. Bay-u9973 (3 and 30 nmol), montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) e pranlucaste (1 and 3 μmol), aumentaram a latência para as crises e diminuíram a amplitude média do EEG durante as crises. Montelucaste (0.03 and 0.3 μmol) preveniu a ruptura da BHE induzida pelo PTZ, e o efeito foi revertido pelo LTD4 (6 pmol). Além disso, as doses de LTD4 (0.2 and 2 pmol) que reverteram o efeito do montelucaste nas crises não alteraram o efeito protetor do montelucaste sobre a barreira, dissociando o efeito anticonvulsivante do efeito protetor sobre a BHE. As análises de microscopia confocal revelaram: 1) PTZ aumentou o número de células CD45+ e IgG no córtex, evidenciando a ruptura da BHE; 2) enquanto o LTD4 (6 pmol) potencializou, o montelucaste diminuiu o efeito do PTZ sobre a migração leucocitária. Considerando que níveis aumentados de leucotrienos e diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase são achados comuns em diversas condições excitotóxicas, incluindo crises epilépticas, também investigamos o efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+- ATPase em fatias de hipocampo de camundongos. LTD4 nas doses de 10 e 100 nM, diminuiu a atividade das subunidades alfa 2/3 e alfa 1, respectivamente. O efeito inibitório do LTD4 na atividade da Na+,K+-ATPase não foi reproduzido quando realizado com homogeneizado de hipocampo, indicando que esse efeito requer a célula intacta. A fim de nos certificarmos de que o LTD4 (10 nM) estava se ligando ao receptor CysLT1, incubamos as fatias com anticorpo anti- CysLT1, e verificamos que, na presença do anticorpo, o LTD4 perde o efeito. Além disso, observamos que a diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase induzida pelo LTD4 foi revertida pelo montelucaste (1 μM), agonista inverso dos receptores CysLT1. Neste trabalho mostramos ainda que a ativação da PKC possivelmente esteja envolvida no efeito do LTD4 sobre a atividade da Na+,K+-ATPase em fatias de hipocampo de camundongos, uma vez que o GF 109203X (0,3 μM), inibidor da PKC, preveniu esse efeito. Por fim, mas não menos importante, também demonstramos que em animais injetados i.c.v. com LTD4 (2 pmol/3 μL, i.c.v.), também ocorre uma diminuição na atividade da Na+,K+-ATPase, corroborando com nossos achados in vitro e confirmando a importância biológica deste trabalho. Assim, este trabalho mostrou evidências do envolvimento dos receptores CysLT1 nas crises induzidas por PTZ bem como na permeabilidade da BHE, sendo a modulação da enzima Na+,K+-ATPase um possível mecanismo para a implicação dos leucotrienos em diversas doenças do SNC relacionadas com inflamação e hiperexcitabilidade.

No presente trabalho investigamos a relevância dos mediadores lipídicos (Leucotrienos) gerados pela enzima 5-Lipoxigenase (5-LO) na susceptibilidade ou resistência de camundongos ao Melanoma experimental com células tumorais B16-F0, utilizando como modelo camundongos produtores de leucotrienos (129_WT) e camundongos geneticamente deficientes \"knockout\" de 5-LO (129_5-LO KO). Primeiramente, verificamos que leucócitos peritoneais provenientes de animais WT implantados com melanoma B16-F0, apresentam aumento da expressão do gene para 5-LO (Alox5). Nossos resultados mostram que animais 5-LO KO, deficientes de 5-LO são mais eficientes no controle da progressão do tumor e apresentam significativo aumento na sobrevivência, quando comparados a animais WT, produtores de 5-LO. A nossa análise do perfil imunológico em células esplênicas indicam que a maior eficiência dos camundongos 5-LO KO no controle do crescimento de células tumorais B16-F0 estariam associados à presença numérica aumentada de neutrófilos (Gr-1+), células apresentadoras de antígeno (I-Ab+) majoritariamente CD19+CD80+ e esplenócitos capacitados para produção de altos níveis de citocinas pró-inflamatórias/efetoras como a IL-6, TNF?, IFN-? e baixos níveis de citocinas regulatórias como IL-10, 15 dias pós-implantação do tumor; a rápida geração da resposta imune polarizada para produção elevada de citocinas Th1 (IFN-?), mas não, citocinas Th2 (IL-10) e presença de maiores números de linfócitos T CD4+ e CD8+ efetoras, expressando o fenótipo CD44high ou CD44highCD62Llow. Ainda, verificamos que a deficiência genética da 5-LO ou a inibição da 5-LO pelo MK886 em células LAK, aumenta significativamente sua atividade citotóxica em células do melanoma B16-F0. Nossos resultados em conjunto, indicam que leucotrienos gerados pela enzima 5-LO, modulam negativamente a geração de resposta imune protetora em camundongos para o Melanoma B16-F0. / In the present work we examine the contribution of 5-lipoxigenase-derived lipid mediators during experimental melanoma (B16-F0) in 5-LO gene knockout (KO) mice and wild-type (WT) mice. The 5-LO KO mice presented delayed tumor growth, lesser tumor volume and delayed mortality. The greater resistance of 5-LO KO mice correlated with the following: High splenic Gr-1+ leukocytes counts, High and dominant presence of splenic IAb+CD19+CD80+ antigen-presenting cells counts and capacity of spleen cell to produce high levels of IL-6, TNF-?, IFN-? and lower levels of IL-10 early after tumor cells implantation; rapid T-cell polarization to secret high quantities of Th1 type cytokine IFN-? and low quantities of Th2 type cytokine IL-10; rapid generation and greater numbers of CD4+ and CD8+ activated T cells expressing CD45RB or CD44 markers; and also CD4+ and CD8+ CD44high or CD44highCD62Llow effector T cells. Herein, IL-2 induced splenic LAK cells from 5-LO KO mice, compared with splenic LAK cells from WT mice, were more efficient at killing B16-F0 melanoma cells. The increased B16-F0 melanoma cells killing activity were also found by treatment of splenic LAK cells from WT mice with a 5-LO activity inhibitor, MK886. Our findings suggest that 5-LO deficiency altered antigen-presenting cells profile, IFN-? and IL-10 production during skin cancer disease favoring the generation of protective immune responses and also provide evidence that 5-LO-derived LTs negatively affect the host survival during experimental B16-F0 melanoma.