Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / p54nrb est une protéine de liaison à l'ARN nucléaire impliquée dans plusieurs processus cellulaires tels que la transcription, la maturation des ARNm et la rétention des ARNs hyper-édités. Cette protéine multifonctionnelle fait partie de la machinerie d'épissage et participe à ce processus en liant directement le site d'épissage en 5' du pré-ARNm. De plus, p54nrb se concentre dans un corps nucléaire nommé le paraspeckle en liant une fraction riche en G de l'ARNnc NEAT1. Récemment, nous avons démontré que la phosphorylation mitotique de la threonine 15 de p54nrb, située en N-terminal de deux RRMs en tandem, régule négativement sa capacité de liaison aux ARNs excepté pour ceux riches en G comprenant l'ARNnc NEAT1 (Bruelle et al., sous presse, annexe A). Afin de caractériser la liaison des différents RRMs de p54nrb à l'ARN, une dissection moléculaire de son domaine de liaison à l'ARN (DLA) a été réalisée. Cette section contient les deux RRMs de la protéine précédés d'une région riche en H, Q, et P contenant le résidu T15 phosphorylable. Des tests de liaison in vitro à l'ARN du site d'épissage en 5' (5'SS, 11 nucleotides) et à des ARNs de polyguanosines ont permis de démontrer que le RRM1 de p54nrb est responsable de l'affinité de la protéine pour ces ligands. De plus, la cartographie des sites d'interaction du RRM1 avec le 5'SS et avec un ARN de polyguanosines (polyG, 11 nucleotides) a été réalisée par RMN et a révélé un site de liaison unique pour chacune de ces molécules. En effet, nous avons démontré que le RRM1 de p54nrb lie l'ARN polyG par un site de liaison non classique différent du site de liaison classique utilisé par la protéine pour lier le 5'SS. Ces expériences ont aussi permis de voir que le RRM1 de p54nrb avait plus d'affinité pour le polyG que pour le 5'SS. Les résultats obtenus démontrent pour la première fois, à notre connaissance, la possibilité pour un seul RRM de posséder deux sites distincts de liaison à l'ARN. De plus, cette liaison non classique du RRM1 de p54nrb aux ARNs de polyguanosines pourrait potentiellement expliquer pourquoi la liaison de la protéine à ce type d'ARN n'est pas affectée par sa phosphorylation.

Le profilage transcriptomique global des gènes humains a permis d'estimer que 95% des gènes subissent un épissage alternatif. L'épissage alternatif élargit la diversité de notre génome et le module par des mécanismes de régulation croisée. Les principales petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP), à savoir U1, U2, U4, U6 et U5, catalysent l'excision des introns d'une manière concertée. Certains des modèles d'épissage prédominants par lesquels l'AS étend la diversité du génome incluent le saut d'exon, les exons mutuellement exclusifs, le site d'épissage alternatif 5' et la sélection du site d'épissage alternatif 3'. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) jouent un rôle majeur dans la régulation de l´épissage alternatif en modulant le recrutement des snRNP aux niveaux des séquences cis-régulatrices; (« enhancer » et « silencer ») situées dans les exons ou les introns. L´objectif actuel dans le domaine de l´épissage est d´établir un « code d´épissage » pour chaque RBP afin de permettre la prédiction de son type d´activité en fonction de la région liée. Des applications récentes à l'échelle du génome, telles que les microréseaux et l'ARN-Seq, ont mis en lumière des modèles d'épissage souvent négligés, tels que la polyadénylation intronique et la rétention intron. La protéine de liaison à l'ARN, SAM68, module l'épissage alternatif de mTor - qui code mTOR, le régulateur principal de la croissance cellulaire et de l'homéostasie. SAM68 favorise l'épissage intron 5 normal de mTor. Des pré-adipocytes chez des souris déficientes en Sam68 ont montré des défauts de différenciation et une diminution de l'engagement dans la lignée adipocytaire. Ces souris étaient maigres et insensibles à l'obésité d'origine alimentaire. L'analyse à l'échelle d'une micropuce du tissu adipeux blanc de souris Sam68-null a permis d'identifier une régulation à la hausse d'une isoforme tronquée de mTor ; mTori5, qui se termine par transcription dans l'intron 5, en raison d'un manque d'épissage au site 5´ d´épissage. Cependant, le mécanisme par lequel SAM68 régule les événements d'épissage, en particulier dans le contexte de la reconnaissance du site d'épissage, n'a pas encore été caractérisé à ce jour. Dans cette thèse de doctorat, je décris une étude approfondie sur le rôle de SAM68 et des régions d'amplificateur intronique dans mTor intron 5 dans la reconnaissance de son site d'épissage 5' amont. Mes résultats mettent en évidence un nouveau rôle du SAM68 dans la modulation du recrutement du snRNP U1 snRNP sur des sites d'épissage de 5'. Je décris la caractérisation biochimique de l'interaction de SAM68 avec U1A, le composant central du snRNP U1 et le rôle de la phosphorylation de la tyrosine SAM68 dans la modulation de cette interaction. Je décris également comment SAM68 par son interaction avec U1 snRNP joue un rôle crucial dans le masquage des signaux de polyadénylation intronique cryptique dans un sous-ensemble de gènes. Collectivement, cette étude contribuera à une meilleure compréhension des éléments introniques et du rôle de SAM68 dans les décisions cruciales en matière d'épissage. / Global transcriptome profiling of human genes have led to the estimation that 95% of genes undergo alternative splicing. Alternative splicing expands the diversity of our genome and modulates it by cross-regulatory mechanisms. Major small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) namely U1, U2, U4, U6 and U5 catalyzes intron excision in a concerted manner. Some of the predominant splicing patterns by which alternative splicing expands genome diversity includes include exon skipping, mutually exclusive exons, alternative 5´splice site and alternative 3´splice site selection. RNA binding proteins play a major role in the regulation of alternative splicing by modulating snRNP recruitment and they do so by binding directly to pre-mRNA sequences called splicing enhancers or silencers that are located in exons and/or introns. A current goal in the splicing field is to establish a ‘splicing code’ for each RBP, whereby its activity, as in splicing activation or repression can be predicted based on its binding region relative to splice sites. Recent genome wide applications such as microarray and RNA-Seq have shed light on the often overlooked splicing patterns such as intronic polyadenylation and intron retention. The RNA binding protein, SAM68, modulates the alternative splicing of mTor – that encodes mTOR, the master regulator of cell growth and homeostasis. SAM68 promotes normal intron 5 splicing of mTor. Pre-adipocytes of Sam68 deficient mice showed differentiation defects and decreased commitment to adipocyte lineage. These mice were lean and unresponsive to dietary induced obesity. Exon-wide microarray analysis of white adipose tissue from Sam68-null mice identified upregulation of a truncated isoform of mTor; mTori5 , that transcriptionally terminates within intron 5 due to lack of splicing at the upstream 5´splice sites. However, the mechanism by which SAM68 regulates splicing events, particularly in the context of splice site recognition, has not been characterized till date. In this doctoral thesis, I describe an in-depth study on the role of SAM68 and the intronic enhancer regions in mTor intron 5 in the recognition of its upstream 5´splice site. My results uncover a novel role of SAM68 in modulating U1 snRNP recruitment at 5´splice sites. I describe the biochemical characterization of SAM68 interaction with U1A, the core component of U1 snRNP and the role of SAM68 tyrosine phosphorylation in modulating this interaction. I also describe how SAM68 by its interaction with U1 snRNP plays a crucial role in masking cryptic intronic polyadenylation signals in a subset of genes. Collectively, this study will contribute to advanced understanding of intronic elements and the role of SAM68 in affecting crucial splicing decisions.

L'augmentation des taux cellulaires de p53 en réponse aux dommages à l'ADN a été largement attribuée à une augmentation de la demi-vie de la protéine. Il est maintenant bien établi que la régulation traductionnelle de l'ARNm de p53 est également critique à la fois pour la répression de l'accumulation de p53 dans des conditions normales, et l'induction de la protéine en réponse aux dommages de l'ADN. Nos travaux se sont accès sur l'étude du rôle de facteur de réparation de l'ADN Ku dans la régulation traductionnelle de l'ARNm P53. Nous avons montré que Ku réprime la synthèse de la protéine p53 et l'apoptose p53-dépendante via la liaison à une structure en tige-boucle dans la 5'UTR de l'ARNm. Cependant, la répression traductionnelle exercée par Ku est levée après un stress génotoxique. Le mécanisme sous-jacent implique l'acétylation de Ku qui perturbe les interactions Ku-ARNm p53. Ces résultats suggèrent que la répression traductionnelle de p53 par Ku constitue un nouveau mécanisme cytoprotectif liant la réparation de l'ADN et la traduction des ARNm. / Increases in p53 protein levels after DNA damage have largely been attributed to an increase in the half-life of the p53 protein. It is now well accepted that translational regulation of p53 mRNA is also critical for both repression of p53 accumulation in unstressed conditions and induction of the p53 protein in response to DNA damage. Our work focused on studying the role of DNA repair factor Ku in the regulation of P53 mRNA translation. We showed that Ku represses p53 protein synthesis and p53-mediated apoptosis by binding to a stem-loop structure within the p53 5'UTR. However, Ku-mediated translational repression is relieved after genotoxic stress. The underlying mechanism involves Ku acetylation which disrupts Ku-p53 mRNA interactions. These results suggest that Ku-mediated repression of p53 mRNA translation constitutes a novel cytoprotective mechanism linking DNA repair and mRNA translation.

Chez les eucaryotes, les microARN sont de courts ARN non codants régulant les gènes essentiels pour le développement et la différenciation cellulaire. Parmi les facteurs cellulaires clés de cette voie métabolique, on retrouve les RNAses de type III Drosha et Dicer, ainsi que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 chez C. elegans. Dans le but de mieux caractériser l’implication des protéines Argonautes dans la voie des microARN, nous avons utilisé deux approches différentes. Premièrement, nous avons étudié la liaison de la protéine Argonaute ALG-1 aux microARN chez C. elegans en fonction du stade développemental, et ce par analyse par micropuce des microARN associés avec ALG-1. Cette étude nous a permis de remarquer que ALG-1 lie la majorité des microARN, mais non la totalité, et ce, de façon très importante aux stades développementaux tardifs. Deuxièmement, nous nous sommes intéressés à l’identification d’interacteurs génétiques d’alg-2. Nous avons donc réalisé un criblage génétique basé sur la létalité synthétique avec le gène alg-2. Ainsi, lorsque le gène synthétique létal est muté simultanément avec alg-2, tel qu’observé avec alg-1, la double lésion induit la mort de l’animal. De ce criblage, nous avons isolé 11 mutants, classés en 5 groupes de complémentation. Par l’utilisation de techniques de cartographie génétique, nous avons localisé la mutation chez le candidat sla-1 sur le chromosome V, entre les positions génétiques de -12.7 et -3.65. / In eukaryotes, microRNAs are small non-coding RNAs which have the role of regulating genes essential for development and cellular differentiation. Beside the RNAse III family members (Drosha and Dicer) and the Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in C. elegans, essential components of this gene regulation pathway are still not uncovered. In order to characterize the implication of Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in microRNA pathway, we used two approaches. First, we studied the interaction between microRNA and ALG-1 during worm development by microarray analysis of microRNA associated to ALG-1. From this analysis, we observed that the majority, but not the totality, of microRNA are associated to ALG-1, mostly at early developmental stages. Secondly, to identify new components of microRNA pathway, we conducted a genetic screen to identify new interactors of alg-2. Our screen is based on the synthetic lethality feature of alg-2 and alg-1 genes. In absence of both genes, the animal can not survive. With this synthetic lethal screen, we want to identify new genes that work in synergy with alg-2, like alg-1, interacting in the same genetic pathway. The worms have been mutagenized and 11 mutants, classified in 5 complementation groups, have been collected. By using various mapping techniques, we localized the mutation on mutant sla-1(qbc1) on chromosome V, between the genetic positions of -12.7 and -3.65.

Au sein de l'ensemble des protéines Argonautes codées par les génomes des organismes métazoaires, certains membres de cette famille de protéines ont conservé des acides aminés importants pour l'activité endonucléasique. La signification fonctionnelle de ces résidus (composés des résidus DDH), pour les Argonautes spécifiques des miARN chez les animaux, est encore inconnue puisque le ciblage des ARNm par les miARN ne provoque pas de clivage site spécifique comme c'est le cas pour les siARN. In vitro, nous avons mis en évidence, chez le nematode C. elegans, que les protéines Argonautes spécifiques aux miARN, ALG-1 et ALG-2, conservant ce motif, possèdent une activité de clivage similaire à celle impliquée dans la voie des si ARN. Nous démontrons également que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 ont la capacité de lier et d'utiliser comme substrats différents duplexes de courts ARN, similaires aux duplexes de miARN produits par l'enzyme DCR-1. Les Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont capables de coupure endonucléolytique sur ces duplexes, lorsque le degré de complémentarité entre les deux brins le permet, et de séparer les deux brins d'un duplex de courts ARN contenant des mésappariements. In vivo, l'activité endonucléasique de ALG-1 ou ALG-2 est essentielle pour la voie des miARN, et la perte de cette activité conduit à une accumulation des précurseurs de miARN tronqués et une altération de la formation de miRISC fonctionnel. Prises dans leur ensemble, nos données indiquent que l'activité endonucléasique des protéines Argonaute ALG-1 ou ALG-2 contribue à la maturation des miARN chez le nematode C. elegans.

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique. / Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale extrêmement agressive associée à un mauvais pronostic. C'est pourquoi, il apparaît nécessaire d'identifier les mécanismes moléculaires participant au développement des GBM ainsi qu'à leurs résistances aux traitements afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Récemment, il a été montré que les régulations traductionnelles jouent un rôle fondamental dans les propriétés agressives du GBM. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) sont des acteurs majeurs de ces régulations dont l'expression/activité est altérée dans les GBM. Les RBP hnRNP HF (HF) font partie des RBP les plus surexprimées dans les GBM et leur contribution dans la régulation traductionnelle des GBM n'a encore jamais été investiguée. Nous avons émis l'hypothèse que hnRNP H et hnRNP F soient au centre d'un réseau de régulations post-transcriptionnelles impactant la machinerie traductionnelle qui contrôle le développement tumoral et la résistance aux traitements des GBM. Nos résultats montrent qu'HF régulent la prolifération et la réponse aux traitements car leur perte d'expression (i) diminue la prolifération des GBM (modèle cellulaire, sphéroïde et xénogreffes in vivo), (ii) active les voies de réponse aux dommages à l'ADN et (iii) sensibilise les cellules de GBM aux irradiations. De plus, nous avons identifié un nouveau rôle pour HF en tant que régulateurs de la traduction. En effet, nos données montrent que les hnRNP HF contrôlent la traduction d'un ensemble d'ARNm en régulant l'expression et l'activité de facteurs d'initiation ainsi qu'en collaborant avec des ARN hélicases partenaires en ciblant des ARNm impliqués dans des processus reliés au développement tumoral et la résistance aux traitements possédant des structures secondaires G-quadruplexe dans leurs 5'UTR. Les données que nous avons générées suggèrent que hnRNP H et hnRNP F sont des régulateurs traductionnels essentiels au développement tumoral et à la résistance aux traitements des GBM. / Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most aggressive brain tumors with poor prognosis. Understanding the molecular mechanisms involved in the development and resistance to treatments of gliomas could improve treatment efficiency. Recently, it has been demonstrated that translational regulations play a key role in the GBM aggressivity. RNA binding proteins (RBP) are major regulators of these processes and have altered expression / activity in GBM. The RBP hnRNP H and hnRNP F (HF) are among the most overexpressed RBP in GBM and their role in GBM translational regulation has never been investigated yet. We hypothesize that HF are at the core of a post-transcriptional regulation network which impacts the translational machinery that controls GBM tumor development and resistance to treatment. We have demonstrated that hnRNP H and hnRNP F regulate proliferation and response to treatment because their depletion (i) decreases the GBM proliferation (cell line model, spheroid and in vivo xenografts), (ii) activates the DNA damage response pathways and (iii) sensitizes the GBM cells to irradiation. We have identified HF as new regulators of GBM translation. Indeed, our data show that hnRNP H and hnRNP F control mRNA translation by regulating expression/activity of initiation factors and in collaboration with RNA helicases by targeting mRNA involved in oncogenic processes and containing secondary structures called G-quadruplex in their 5'UTR. The data that we have generated suggest that HF are essential translational regulators involved in tumor development and resistance to treatment in GBM.

Mes travaux ont porté sur l'étude de deux familles de protéines de liaison à l'ARN, la famille des ARE-BP (AU-rich elements binding protein) et la famille des PTB (Polypyrimidine tract binding protein) au cours du développement chez le xénope. L'étude de l'expression de cinq membres de la famille ARE-BP a mis en évidence une redondance d'expression tissulaire et temporelle entre quatre de ces ARE-BP (AUF1, KSRP, HuR et TIA1). A l'inverse, l'expression atypique de TTP a permis de suggérer son implication dans l'hématopoïèse. Mes travaux sur la famille PTB (PTBP1, PTBP2, PTBP3) ont montré que chacun des paralogues présente une expression spécifique ce qui suggère qu'elles aient des fonctions différentes lors du développement. Des résultats du laboratoire montraient que l'inactivation de PTBP1 ou de EXOSC9, un composant de l'exosome ARN, entraînait des défauts de morphogenèse de l'épiderme dorsal. Afin d'identifier l'origine moléculaire de ces défauts, j'ai réalisé l'analyse transcriptomique par séquençage à haut débit (RNA-Seq) des morphants PTBP1 et EXOSC9. J'ai produit des banques d'ADNc à partir des morphants ou d'embryons témoins et celles-ci ont été séquencées au Génoscope. L'analyse d'une cible connue de PTBP1 a montré que des modifications minoritaires de l'épissage étaient détectées à partir de ces données. De plus ces défauts d'épissage ne sont pas retrouvés dans les morphants EXOSC9, validant son utilisation comme crible additionnel permettant d'exclure les évènements d'épissage qui ne sont pas impliqués dans le défaut d'épiderme. Une approche gène candidat a été initiée afin de cibler l'analyse de transcrits impliqués dans la morphogenèse de l'épiderme dorsale.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.