Zugl.: Berlin, Charité, University-Med., Diss., 2006.

Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main).

Konstanz, Univ., Diss., 2006.

Techn. Hochsch., Diss., 2003--Aachen.

Universiẗat, Diss., 2000--Kiel.

Univ., Diss., 2004--Frankfurt (Main) / Enthält Sonderabdr. aus versch. Zeitschr.

Univ., Diss., 2004--Frankfurt (Main)

University, Diss., 2005--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Opioid receptors (ORs) are among the most intensively studied members of the G protein-coupled receptor (GPCR) family due to their important role in pain management and their involvement in psychological and neurological disorders. However, currently available opioid drugs exhibit both serious drawbacks, such as addiction, and life-threatening side effects, such as respiratory depression. Contrary to the classic monomeric model, indirect evidence suggests that ORs might form dimers, which could be endowed with a distinct pharmacological profile, and, thus, be exploited to develop innovative drugs. However, direct evidence for the spontaneous formation of OR dimers in living cells under physiological condition are missing. The focus of this thesis was the design, synthesis and characterization of new, highly subtype-selective OR fluorescent ligands to be used as tools for state-of-the-art microscopy methods, such as single molecule microscopy (SMM), in heterologous cells and potentially in native tissue, in order to investigate OR organization and mobility on the surface of intact, living cells, at low/physiological expression levels. The μOR is the OR subtype which plays the most critical role in pain modulation, while mediating the effects of the most powerful analgesic drugs. Also, it is the OR subtype which is mostly responsible for the major adverse effects of the currently marketed opioid drugs. We aimed to develop a new μOR-selective fluorescent ligand with a potential irreversible binding mode. Although the approach was in principle successful, i.e. the labelled cells were visible and distinguishable; this initial attempt was not suitable for SMM due to the ligands’ poor selectivity and affinity as well as due to its high background noise. A second generation of the fluorescent ligand was designed; however the synthesis and characterization are part of another doctoral thesis. Lately, δOR has received attention as a promising drug target, due to its distinct pharmacological profile which features low abuse liability and lack of physical dependence. In addition, δOR expression has been associated with cancer regulation in the periphery, thus further highlighting the interest of imaging tools for this receptor. In this thesis, the development and characterization of two new δOR-selective fluorescent probes with excellent optical properties, based on the well-studied ligand naltrindole (NTI) is presented. Their application in SMM studies is currently underway at the group of Prof. Dr. Davide Calebiro at the University of Birmingham. The κOR is a subtype which has also emerged as a drug target due to its low abuse potential. Despite a growing interest in this receptor, κOR-selective fluorescent probes have been particularly scarce in literature. Herein, the design, synthesis and characterization of the first reported set of fluorescent κOR-selective probes with antagonistic properties, based on the established ligand 5’-guanidinonaltrindole (5’-GNTI) is presented. Two of these were employed for SMM experiments to investigate κOR homodimerization, localization and trafficking. Our findings do not support homodimerization of the κOR-bound probe complexes, while showing that the majority of them follow a normal Brownian diffusion on the cell surface. / Opioid-Rezeptoren (OR) gehören aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei der Schmerztherapie und ihrer Beteiligung an physiologischen und neurologischen Störungen zu den am intensivsten untersuchten Mitgliedern der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Familie. Jedoch haben aktuell erhältliche Opioid-Arzneimittel schwerwiegende Nachteile, wie Abhängigkeit, und lebensbedrohliche Nebenwirkungen, wie Atemdepression. Im Gegensatz zu dem klassischen Monomer-Modell legen indirekte Hinweise nahe, dass ORs Dimere formen können, welche mit einem spezifischen pharmakologischen Profil ausgestattet sein könnten und daher für die Entwicklung innovativer Arzneimittel verwendet werden könnten. Jedoch gibt es keinen direkten Beweis für die spontane Bildung von OR-Dimeren in lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen. Der Fokus dieser Doktorarbeit war daher das Design, die Synthese und Charakterisierung von neuen hoch subtyp-selektiven fluoreszierenden OR Liganden, welche als Hilfsmittel für hochmoderne Mikroskopie-Anwendungen Anwendung finden sollen, wie Einzelmolekül-Mikroskopie (EMM) in heterologen Zellen und potentiell in nativem Gewebe, um OR-Organisierung und Mobilität auf der Oberfläche von intakten lebenden Zellen bei niedrigen/physiologischen Expressions-Spiegeln zu untersuchen. Der μOR ist der OR Subtyp, der die entscheidenste Rolle bei der Schmerzmodulierung spielt, indem er die Wirkung der stärksten analgetischen Arzneien vermittelt. Des Weiteren ist dieser OR-Subtyp der Subtyp, der größtenteils für die wesentlichen unerwünschten Nebenwirkungen der aktuell vermarkteten Opioid-Arzneimittel verantwortlich ist. Das Ziel dieser Arbeit war daher, einen neuen μOR-selektiven fluoreszierenden Liganden mit einem potentiell irreversiblen Bindungsmodus zu entwickeln. Obwohl dieser Ansatz prinzipiell erfolgreich war, das heißt die markierten Zellen waren sicht- und unterscheidbar, war dieser erste Ansatz aufgrund der geringen Selektivität und Affinität des Liganden und aufgrund seines hohen Hintergrundrauschens nicht für EMM geeignet. Daher wurde eine zweite Generation fluoreszierender Liganden entworfen. Deren Synthese und Charakterisierung ist jedoch Teil einer anderen Doktorarbeit. Kürzlich erhielt der δOR aufgrund seines spezifischen pharmakologischen Profils, welches ein geringes Missbrauchsrisiko und das Fehlen körperlicher Abhängigkeit beinhaltet, vielseitige Beachtung als ein vielversprechendes Arznei-Target. Des Weiteren wurde δOR-Expression mit Krebsregulation in der Peripherie assoziiert, was das Interesse an einem bildgebenden Werkzeug für diesen Rezeptor zusätzlich unterstreicht. In dieser Doktorarbeit wird die Entwicklung und Charakterisierung von zwei neuen, auf dem gut untersuchten Liganden Naltrindol (NTI) basierenden, δOR-selektiven fluoreszierenden Sonden mit sehr guten optischen Eigenschaften gezeigt. Ihre Anwendung in EMM Untersuchungen läuft derzeit bei Kooperationspartnern im Arbeitskreis von Professor Davide Calebiro an der Universität Birmingham an. Der κOR ist der Subtyp, der auch als Arznei-Target aufgrund seines geringen Missbrauchspotentials in Erscheinung getreten ist. Obwohl steigendes Interesse an diesem Rezeptor besteht, sind κOR-selektive fluoreszierende Sonden in der Literatur bisher kaum beschrieben. In dieser Arbeit wird das Design, die Synthese und Charakterisierung des ersten beschriebenen Sets von fluoreszierenden κOR-selektiven Sonden mit antagonistischen Eigenschaften, basierend auf dem Liganden 5’-Guanidinonaltrindol (5’-GNTI) gezeigt. Zwei dieser Liganden wurden für EMM Experimente verwendet, um die κOR Homodimerisierung, Lokalisation und Transportwege zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen keine Homodimerisierung des κOR-gebundenen Sondenkomplexes und außerdem, dass die Mehrheit der Rezeptoren einer normalen Brown’schen Diffusion auf der Zelloberfläche folgt.

Ziel der Dissertation „Neue künstliche Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren zur Komplexierung von Oxo-Anionen in Wasser“ war die Weiterentwicklung dieser Rezeptoren nach Schmuck für die Komplexierung insbesondere von Carboxylaten, um sie hinsichtlich Bindungsaffinität und Substratspezifität zu optimieren. Dazu wurde zunächst die Synthese zweier wichtiger Grundbausteine in einzelnen Schritten vollständig überarbeitet, wobei veränderte Reaktionsbedingungen und Aufarbeitungsschritte zu gesteigerten Ausbeuten führten. Dadurch ist es nun möglich, diese Bausteine effizienter zu synthetisieren und im Multigramm-Maßstab für die Darstellung von Rezeptoren zur Oxo-Anionen-Erkennung einzusetzen. Weiterhin wurde die Verbesserung der Komplexierungseigenschaften gegenüber Carboxylaten auf zwei Arten untersucht: zum einen durch das Anbringen eines zusätzlichen Seitenarms an der Guanidinio-Einheit zur Bildung von Guanidiniocarbonylpyrrol-Tweezer-Rezeptoren, zum anderen durch das Einführen einer zweiten positiven Ladung neben der Carboxylat-Bindungsstelle (CBS) zur Darstellung biskationischer Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren. Zur Darstellung von Tweezer-Rezeptoren wurde ein zusätzlicher Seitenarm an der N’-Position der Guanidinio-Einheit angebracht. Die beiden Arme sollten ein Substrat pinzettenartig von zwei Seiten, mit der CBS als Kopfgruppe, komplexieren können. Durch zusätzliche Wechselwirkungen des neuen Seitenarms sollte neben einer stärkeren Komplexierung vor allem eine höhere Substratspezifität erzielt werden. Die experimentell ermittelten Bindungskonstanten lagen allerdings im Bereich der N’-unsubstituierten Rezeptoren. Somit stellen die Tweezer-Modifikationen daher keine Verbesserung der Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren dar. In einem weiteren Projekt zur Rezeptor-Optimierung wurden, durch Einführung einer zweiten positiven Ladung in Form einer terminalen Ammonium-Gruppe, biskationische Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren erfolgreich synthetisiert. Die Komplexierungseigenschaften dieser biskationischen Rezeptoren wurden in Bindungsstudien vornehmlich mit Aminosäurecarboxylaten mittels UV- und Fluoreszenz-Spektroskopie, Massenspektrometrie, NMR-Spektroskopie, ITC und Molecular Modeling Berechnungen untersucht. Anhand der Substratspezifität der biskationischen Rezeptoren wurde deutlich, dass die Spacerlänge, an der die zusätzliche positive Ladung angebracht ist, eine entscheidende Rolle bei der Komplexierung spielte. Galten eigentlich starre, präorganisierte, kurze Linker als vorteilhaft hinsichtlich der Entropie, so ist hier zu erkennen, dass längere, flexiblere Linker zu einer besseren Komplexierung führen können, wenn geeignete zusätzliche nichtkovalente Wechselwirkungen möglich sind. Die biskationischen Rezeptoren stellen damit eine Optimierung des Carboxylat-Bindungsmotivs der Guanidiniocarbonylpyrrol-Rezeptoren nach Schmuck in der Anionen-Erkennung dar. / The main focus of the thesis “New artificial guanidiniocarbonyl pyrrole receptors for the complexation of oxo-anions in water” is the optimization of these receptors introduced by Schmuck for the oxo-anion recognition, especially carboxylates, in aqueous solution. Therefore, the details of the synthesis of two important building blocks were completely revised and yields increased by changing reaction conditions, workup and isolation steps. The new optimized, facile and efficient synthetic route to these N-protected guanidinocarbonyl pyrrole derivatives allows now a multi-gram synthesis of these versatile compounds as needed for the synthesis for a variety of supramolecular anion binding motifs. Furthermore two strategies to optimize the anion recognition have been pursued: On the one hand tweezer receptors were developed by connecting an additional side chain to the head group at the N’-position of the guanidino group. On the other hand another second positive charge was introduced into the receptor besides the carboxylate binding site (CBS) by an ammonium group to get bis-cationic receptors The tweezer receptors were developed in order to complex the guest from more than one side. A second side chain, connected to the N’-position of the guanidinio motif, leads to this kind of receptor, with the CBS as a head group. By using additional non covalent interactions in both side chains, the association constant as well as the specificity should be increased. In case of the optimization of the binding properties, the tweezer receptors have showen binding properties similar to the N’-unsubstituted guanidiniocarbonyl pyrrole receptors with respect to association constants and specificity. For this reason the tweezer receptors were no improvement of the guanidiniocarbonyl pyrrole receptors. In another project for optimization of the binding properties several bis-cations were synthesized, with a simple primary ammonium cation attached via flexible linkers of varying length to a guanidiniocarbonyl pyrrole. In UV-binding studies in aqueous buffer these bis-cations have shown efficient binding of various N-acetyl amino acid carboxylates. Further investigations by fluorescence spectroscopy, mass spectrometry, NMR spectroscopy, ITC as well as molecular mechanics calculations confirm the complexation by participation of the second charge in the complexation of the carboxylic function and therefore an increasing in complex stability. It is generally assumed, that short and rigid linkers are better for complexation due to the entropy and that a steady decrease of a linker length increase the complex stability. However, this case shows, that complex stability can increase while increasing the flexibility of a linker until other non covalent interactions are possible. Hence, the bis-cationic receptors indeed represent an optimisation of the guanidiniocarbonyl pyrrole receptors for oxo-anion-binding.