L'obésité est maintenant perçue comme un problème de santé majeur dans notre société. C'est pourquoi la compréhension des mécanismes moléculaires liés au développement de cette maladie est primordiale. Des études comparatives entre des poulets de lignées grasses et des poulets de lignées maigres ont montré que la lipogénèse hépatique était plus élevée chez les animaux gras. La Synthétase des Acides Gras (FAS) est connue comme étant responsable de la synthèse des lipides saturés à longues chaînes. Des études antérieures ont démontré que ce gène est régulé à la fois par l'état nutritionnel et hormonal. Dans ce contexte, l'objectif de la présente étude était d'examiner le rôle de l'hormone thyroïdienne (T3), et aussi d'un mélange de T3 et d'insuline, sur l'activité transcriptionnelle du gène aviaire de la FAS. Certains des éléments agissant au niveau de la réponse à l'insuline ont déjà été identifiés chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Afin d'identifier l'effet de la T3 et d'un mélange de T3 et d'insuline, un fragment d'ADN de 1,6 Kpb de la partie promotrice de FAS a été isolé, séquencé et cloné dans un vecteur contenant le gène rapporteur codant pour la chloramphénicol acétyl transférase (CAT). Cette construction nommée 1.6FAS-pJFCAT1 a ensuite été transfectée de façon transitoire dans les cellules HepG2 et les hépatocytes embryonnaires de poulet. Les analyses d'expression ont démontré une augmentation de l'activité du gène rapporteur codant pour CAT de 2.5 fois, suite à une stimulation de 48 heures avec 1.6µM de T3. Ce promoteur posséderait donc un élément de réponse nécessaire à la modulation par cette hormone. Des constructions contenant des délétions successives de ce grand fragment d'ADN et des alignements de séquences ont permis l'identification de la région interne localisée entre -902/ -577 pb où se retrouve l'élément de réponse à la T3, appelé TRE pour 'Thyroïd Hormone Response Element'. Des analyses de retard sur gel (EMSA) utilisant comme TRE un oligonucléotide contenant les bases -732 à -692 ont ensuite permis d'identifier des protéines se fixant sur ce fragment d'ADN en réponse à la T3, renforçant ainsi la présence possible d'un TRE. Une augmentation de l'activité CAT de 2.3 fois a d'ailleurs aussi été obtenue après 48 heures de stimulation à la T3 lors d'expériences de transfections transitoires avec la construction contenant le fragment -765/-663 placé devant le promoteur TK. Le TRE correspondrait donc à la séquence CGCCCTgtggTAACCT, séquence très différente du consensus établi et très différente des T3RE retrouvés dans la partie promotrice du gène de l'enzyme malique. Il a toutefois une forte homologie avec un TRE retrouvé dans le gène FAS chez l'humain, le poulet, la souris et le rat. Ceci semble démontrer la forte variation de ces éléments de réponse. L'analyse par retard sur gel révèle qu'en présence de T3 seulement il y a fixation du récepteur TR alors que lorsque l'insuline est aussi présente, il semble que le facteur de transcription RXR se fixe aussi. Ceci suggérerait l'idée que la formation d'hétérodimères TR/RXR serait grandement favorisée en présence d'insuline. Ces informations, en combinaison avec les résultats récents obtenus par d'autres équipes sur la régulation de la FAS, serviront à la compréhension des mécanismes de régulation de la transcription d'un gène clé de la lipogenèse hépatique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Hormone thyroïdienne, TRE, Synthétase des acides gras, FAS, Lipogenèse.

L'acide gras synthétase (FAS) est une enzyme clé dans la synthèse de novo des lipides. Son inhibition représente donc une approche intéressante dans la réduction de la lipogenèse. En présence de NADPH (nicotinamide adénine dinucléotide phosphate), cette enzyme synthétise la palmitate à partir de l'acétyl-CoA et du malonyl-CoA. Des facteurs hormonaux tels que l'insuline et la triiodothyronine (T3) et nutritionnels tels que les acides gras à chaîne moyenne (MCFAs) régulent l'activité de la FAS au niveau de la transcription. Toutefois, l'interaction entre ces facteurs est peu connue et mérite d'être explorée afin de comprendre la régulation de la FAS. Dans un premier temps, nous avons testé l'effet des MCFAs, hexanoate ou octanoate (1mM), sur l'activité enzymatique de la FAS sur des hépatocytes de poulet de 19 jours stimulés à la T3 (1 ,6 µM), à l'insuline (100 µM), et aux deux hormones sur une période de 24 heures. Deux inhibiteurs de protéine kinase, la H7 et la génistéine, ont également été utilisés pour déterminer l'impact de la phosphorylation sur la régulation de la FAS. L'activité enzymatique de la FAS a été déterminée dans ces différentes conditions de culture par mesure de la dégradation de NADPH à 340 nm par spectrophotométrie. La capacité des hépatocytes à capter les MCFAs ainsi que leur métabolisme intracellulaire ont également été évalués par des études de captation au C¹⁴ et de profil lipidique. Individuellement, l'insuline et la T3 stimulent faiblement l'activité de la FAS. Un effet synergique important est observé lorsque les cellules sont stimulées simultanément aux deux hormones. L'incubation avec la H7 réduit fortement l'activité de la FAS indépendamment des conditions de stimulation tandis que la génistéine a un faible potentiel inhibiteur. Ensemble, ces résultats suggèrent une coopération entre l'insuline et la T3 ainsi que l'existence d'une voie de signalisation impliquant une serine/ thréonine kinase dans la régulation de la FAS. L'insuline est impliquée dans le métabolisme des MCFAs, toutefois, l'inhibition n'est observée qu'en présence de la T3. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : FAS, Acides gras à chaîne moyenne, Insuline et triiodothyronine, Phosphorylation, Estérification.

In eukaryotic organisms, polyubiquitination is the modification of a protein with polymerized ubiquitin (Ub) chain. This process is well known for its function in targeting proteins for degradation by the 26S proteasome. However, a polyUb chain assembled through the lysine 63 residue of the Ub moiety (Lys63-linked polyubiquitination) has been shown to play a signaling role rather than targeting proteins for degradation. In plants, the functions of Lys63-linked polyubiquitination are currently not well understood. Ub-protein ligase (E3) catalyzes the last step in the ubiquitination reactions, and to a large extent it also determines the substrate specificity of protein ubiquitination. In order to study the roles of Lys63-linked polyubiquitination in plants, two E3s of Arabidopsis thaliana, proteins encoded by AtCHIP and At1g74370 (tentatively named E3-A1), were chosen for functional studies, since they interacted with AtUbc13A protein. Sequence analysis showed that AtCHIP is the only member in the family. A T-DNA insertion mutant line (Atchip-1) was obtained to study the AtCHIP gene knock-out effect. The mutant line was grown in normal conditions and further tested in a variety of conditions: hormonal treatments, osmotic stress, seed deterioration, high temperature stress, high-intensity light stress, oxidative stress and DNA damaging stress. However, no clear difference was observed between the mutant and wild type plants based on the several parameters measured. Sequence analysis of E3-A1 indicated two closely related proteins, tentatively named E3-A2 and E3-A3. As E3-A1 and E3-A2 appeared to share more sequence similarity, RNA interference (RNAi) transformants, with the level of transcripts for either of the two E3-A genes reduced by over 90% were generated. Selected RNAi mutant lines for E3-A1 and E3-A2 were crossed with each other, and double RNAi mutants were obtained. However, no distinct phenotype was detected under normal, high-sucrose or hormonal conditions for either single or double RNAi lines. Although various assays did not reveal a significant phenotype in the mutants in this study, the materials generated and the assays used will benefit a wider range of phenotypic survey in the future.

<p>The Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C) is a RING E3 ligase that plays essential roles both within and outside of the cell cycle. At the onset of anaphase, the APC/C targets cyclin B and securin for degradation, initiating chromosome separation and mitotic exit. Regulation of APC/C activity is critical for a functional cell cycle, and this is largely mediated by cytostatic factor (CSF) activity and the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). </p> <p>Prior to fertilization, vertebrate eggs are arrested in metaphase of meiosis II by CSF activity, a key component of which is the APC/C inhibitor Emi2. Although the roles and regulation of Emi2 in maintaining CSF arrest have been extensively studied, its function during the oocyte maturation process, especially at the meiosis I to meiosis II (MI-MII) transition, was not well understood. Studies presented in this dissertation characterize an Emi2-mediated auto-inhibitory loop of the APC/C that provides the molecular basis of a critical biochemical event during the MI-MII transition--the partial degradation of cyclin B. In brief, phosphorylation of the Emi2 N-terminus by Cdc2/cyclin B targets it for proteasomal degradation in meiosis I (MI). During anaphase of MI, the APC/C triggers its own inactivation by degrading cyclin B, therefore stabilizing its inhibitor, Emi2. The timely inactivation of APC/C activity prevents the complete inactivation of Cdc2 kinase, which is crucial for prohibiting S phase onset and parthenogenetic activation of the oocytes.</p> <p>To better understand the regulation of the APC/C, a number of the studies presented here are aimed at identifying the mechanism for Emi2 inhibition of the APC/C. Many APC/C inhibitors have been reported to function as "pseudosubstrates", which inhibit the APC/C by preventing substrate binding. After carefully examining the ubiquitin reactions mediated by the APC/C in vitro, we have found that it is the last step in the ubiquitylation process, where ubiquitin is transferred from a charged E2 to the substrate, that is targeted by Emi2. In addition, biochemical studies have also revealed that Emi2 itself has RING-dependent ligase activity and this activity enables it to inhibit the APC/C in a sub-stoichiometrical manner. </p> <p>Although the ultimate goal for both CSF activity and the SAC signaling pathway is APC/C inhibition, a much more complicated regulatory network is known to control SAC. Previous researches in our lab have identified Xnf7 to be an APC/C inhibitor that is required for the SAC pathway in Xenopus egg extract. In an effort to characterize the human Xnf7 homolog, we have found that Trim39, a protein that has been implicated in apoptosis regulation, is required for the SAC pathway in RPE cells. Like Emi2, both Xnf7 and Trim39 are RING E3 ligases whose activity is essential for their function. Interestingly, the ligase activity of both proteins appears to be regulated by the checkpoint. While we continue to characterize the roles and regulation of both Trim39 and Xnf7 in the SAC, future investigations into the mechanisms that underlie APC/C inhibition by all the three E3 ligases--Emi2, Xnf7 and Trim39--would be of great interest.</p> / Dissertation

Thèse de doctorat : Sciences du vivant : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 225-249.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 72-81).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 98-106).

?4 phosphoprotein (also known as IGBP1) is a component of the mammalian target-of-rapamycin (mTOR) pathway that controls the initiation of translation and cell-cycle progression in response to nutrients and growth factors. Aberrant signaling of the mTOR pathway has been reported in many cancers. ?4 interacts with the catalytic subunit of protein phosphtase 2A (PP2Ac) to mediate the dephosphorylation of eukaryotic initiation factor 4E-binding protein1 (4E-BP1) and p70S6 kinase (p70S6K). Our laboratory has reported that EDD E3 ubiquitin ligase (EDD/UBR5) and poly(A)-binding protein (PABP) are novel binding partners of ?4 phosphoprotein. In the present study, the interaction of EDD and PABP with ?4 was confirmed in human MCF-7 breast cancer and African green monkey COS-1 kidney cell lines, using immunoprecipitation and immunoblotting (IP/IB) analysis. However, co-IP of total MCF-7 cell lysates with anti-EDD antibodies revealed that EDD does not physically interact with PP2Ac. Several ?4 deletion constructs, that contained either the N-terminal or C-terminal regions of ?4, were transfected into MCF-7 and COS-1 cells. Co-IP studies with anti-EDD and PABP antibodies revealed that EDD interacts with the C-terminal region of ?4 whereas PABP, like PP2Ac, binds to the N-terminal region. EDD and PABP were found to interact with ?4 in both quiescent and actively growing cells. EDD is known to ubiquitinate poly(A)-binding protein-interacting protein 2 (Paip2), targeting it for proteosomal degradation. Paip2 is an antagonist of PABP activity. When ?4 levels in MCF-7 cells were knocked down using small interfering RNA (siRNA), there was no effect on EDD protein levels. There was also no effect on Paip2 levels, indicating that ?4 is not involved in the EDD- mediated ubiquitination of Paip2. Knockdown of EDD gene expression by siRNA did not alter mono-ubiquitination of ?4, indicating that ?4 is not a substrate of EDD. However, knockdown of EDD gene expression decreased poly-ubiquitination of PP2Ac and increased the overall cellular levels of PP2Ac, suggesting PP2Ac as a novel substrate of EDD. The present study suggests a potential role for ?4 in PABP-mediated initiation of mRNA translation. Furthermore, this study suggests a role for EDD in regulating PP2Ac levels through its interaction with ?4. In summary, the ?4 partners EDD, PABP and PP2Ac interact at specific regions of ?4. PP2Ac, but not ?4, is a substrate of EDD. The interaction of PABP with ?4 suggests a potential role for ?4 in PABP-mediated initiation of mRNA translation.

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The covalent modification of proteins with a suite of molecular tags, a process termed post-translational modification, is a powerful means to enhance the proteomic complexity of an organism far beyond that which is directly encoded by its genome. A particularly widespread form of modification involves the conjugation of the protein ubiquitin to specified substrates, which serves to regulate numerous cellular processes. The mechanism of ubiquitin conjugation, known as ubiquitylation, requires E3 ubiquitin ligases that specify and recruit substrate proteins for ubiquitin conjugation. Recent insights into the mechanisms of ubiquitylation demonstrate that E3 ligases can possess active regulatory properties beyond those of a simple assembly scaffold. This thesis describes the dimeric structure of the E3 ligase adaptor protein SPOP in complex with the N-terminal domain of Cul3 at 2.4 Å resolution. Here, it is demonstrated that SPOP forms large oligomers that can form heteromeric species with the closely related paralog SPOPL. In combination, SPOP and SPOPL form a molecular rheostat that can fine-tune E3 ubiquitin ligase activity by affecting the oligomeric state of the E3 complex. These results reveal a mechanism through which adaptor protein self-assembly may provide a graded level of regulation of the SPOP/Cul3 E3 ligase toward its multiple protein substrates.