Dairy products are important sources of calcium and other nutrients but are a poor source of dietary iron. Cheese comprises a substantial portion of dairy food consumption and has been determined an appropriate medium for iron-fortification. However, iron may promote the potentially harmful process in food and biological systems known as lipid peroxidation. Therefore, the safety of consuming iron-fortified cheese was examined. Commercial-scale batches of Cheddar cheese were iron-fortified to a level of two milligrams of iron per ounce with either ferric chloride, ferric-casein complex, or ferric-whey protein complex. Fifty-four premenopausal females were divided into three treatment groups and supplemented one and one-half ounces of iron-fortified Cheddar cheese into their normal diet on a daily basis for six consecutive weeks. Lipid peroxidation was measured as thiobarbituric acid-reactive substances in serum, urine, and feces. A significant increase in serum thiobarbituric acid-reactive substances occurred in all treatment groups sixteen days after initiation of iron-fortified cheese consumption. Thiobarbituric acid-reactive substances in serum returned to baseline levels after thirty days of iron-fortified cheese consumption. Thiobarbituric acid-reactive substances in serum, urine, and feces did not differ among iron-fortification methods. Average daily intake of iron during the six weeks of iron-fortified cheese consumption significantly increased above baseline intake levels without cheese by the approximate amount of iron fortified into the cheese. Increased dietary iron intakes were not correlated with increased lipid peroxidation as measured by thiobarbituric acid-reactive substances in serum, urine, or feces. These results indicated that the daily consumption of iron-fortified cheese increased dietary iron intake and produced a transient increase in lipid peroxidation as measured by thiobarbituric acid-reactive substances in human serum.

Die Multigenfamilie der Lipid Transfer Proteine (LTP) stellt eine Gruppe von kleinen Proteinen dar, welche in allen höheren Landpflanzen vorkommen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden 92 Proteine zur Klasse der LTPs gezählt. Die Benennung der Proteinfamilie basiert auf dem beobachteten in vitro Transfer von Lipiden zwischen zwei Membranen. Alle LTPs weisen ein konserviertes, 8 Cysteine beinhaltendes Motiv und eine hydrophobe Tasche auf, welche für die Bindung hydrophober Moleküle verantwortlich ist. Aufgrund ihrer Signalsequenz werden LTPs über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum geschleust. Für einige pflanzliche LTPs konnte eine derartige Sekretion bereits nachgewiesen werden. Für andere LTPs wird eine Funktion in der Kutinbildung, der Embryogenese oder der pflanzlichen Immunantwort gegen Phytopathogene postuliert. Letzteres wurde für DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) und AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) nachgewiesen, während von LTPIV.4 (At4g55450) nur bekannt ist, dass die Expression spezifisch in Antwort auf Pathogene induziert ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktion von LTPIV.4 und AZI1 in Bezug auf die pflanzliche Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana untersucht. Anhand von GFP-Fusionsproteinen konnte für LTPIV.4 und AZI1 eine Endoplasmatische Retikulum-Lokalisierung detektiert werden. Auch eine gewebespezifische Promotoraktivität von LTPIV.4 an den Leitgeweben und in jungen sich entwickelnden Blättern konnte identifiziert werden. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass LTPIV.4 möglicherweise an der Signaltransduktion am/im Leitgewebe mitverantwortlich ist. Im Fokus dieser Arbeit stand die spezifische Einordnung von LTPIV.4 in der Ausbildung der lokalen bzw. systemischen Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Anhand einer Infektion von Wildtyppflanzen und LTPIV.4 Mutanten mit zwei verschiedenen Pseudomonasstämmen konnte eine LTPIV.4-abhängige Steigerung der pflanzlichen Resistenz gegen die biotrophen Bakterien nachgewiesen werden. In der Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia hingegen zeigte sich keine LTPIV.4 Abhängigkeit. Da die Hormone Salicylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA) in der Ausbildung der pflanzlichen Abwehr gegen verschiedene Pathogene wichtig sind, wurden die Hormonlevel von SA und JA in ltpIV.4, 35S::LTPIV.4 sowie in Wildtyppflanzen analysiert. Die untersuchten Phytohormongehalte zeigten eine LTPIV.4 unabhängige, schnelle Akkumulation von SA nach der Infektion mit virulenten (vir) Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) und eine spätere Erhöhung der JA-Gehalte. Es konnte somit kein regulatorischer Effekt von LTPIV.4 auf die SA- sowie die JA-Gehalte detektiert werden. Die Expression von SAG13 (SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 13) und OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE 1), welche eine Funktion im programmierten Zelltod (PCD) haben beziehungsweise durch oxidativen Stress induziert werden, war hingegen erhöht in konstitutiv LTPIV.4 exprimierenden Pflanzen, verglichen mit dem Wildtyp von LTPIV.4. Als ein weiterer Ansatzpunkt für die funktionelle Charakterisierung von LTPIV.4 wurde die in vitro Identifizierung möglicher Substrate mittels Lipid-Protein-Interaktionsanalysen, sowie einer unspezifischen Metabolomanalyse herangezogen. Bei den Interaktionsanalysen konnten Phosphatidsäuren (PA), Phosphatidylglycerine (PG), Monogalactosyldiacylglycerole (MGDG) und auch Digalactosyldiacylglycerole (DGDG) als Interaktionspartner von LTPIV.4 identifiziert werden. Die Metabolomanalyse zeigte einen quantitativen Unterschied zwischen Wildtyp/35S::LTPIV.4 und ltpIV.4 bei einigen MGDG, DGDG und PG Spezies. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich somit schließen, dass LTPIV.4 nach Pathogen/Schaden-assoziierte molekulare Muster- (PAMP/ DAMP-) Erkennung, z.B. von Psm, SA-abhängig vermehrt gebildet wird. Da die konstitutive Expression von LTPIV.4 sowohl zu erhöhter OXI1 und SAG13 Expression als auch zu erhöhter Resistenz gegenüber Psm führt, lässt sich ein Modell aufstellen, in dem LTPIV.4 als positiver Regulator des PCD die Pathogenresistenz von Arabidopsis erhöht. Der zugrunde liegende Mechanismus ist unbekannt. Die Bindung von PAs, PGs, MGDGs und DGDGs an LTPIV.4 in vitro könnte darauf hindeuten, dass auch in vivo hydrophobe Moleküle gebunden und möglicherweise transportiert werden und dies ein Teil der Pathogenantwort ist. Es wäre z.B. denkbar, dass eine mögliche Translokation von LTPIV.4 über das ER in das Zytoplasma oder den apoplastischen Raum erfolgt. Dort interagiert LTPIV.4 mit durch ROS gebildeten, oxidierten Lipiden oder DAMPs und löst entweder symplastisch durch eine Interaktion in der Infizierten Zelle oder in intakten Nachbarzellen durch eine weitere Signaltransduktionskaskade den PCD sowie eine erhöhte ROS Bildung aus, oder das LTP interagiert spezifisch mit oxidierten Lipiden oder DAMPs von abgestorbenen Nachbarzellen, und löst eine intrazelluläre Signalkaskade mit Initiierung des PCD sowie erhöhter ROS-Bildung aus. AZI1 wurde als zweites LTP in dieser Arbeit einbezogen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die konstitutive Expression von AZI1 die Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogene Botrytis cinerea erhöht, sollte in der vorliegenden Arbeit detailiert untersucht werden, ob AZI1 eine Rolle in der Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogen Sclerotinia sclerotiorum spielt. Die azi1-1 Mutante zeigte hierbei jedoch eine erhöhte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum. Da bisher keine Unterschiede in der Genexpression von spezifischen Markergenen in WT und azi1-1 Pflanzen nach Sklerotiniainfektion festgestellt werden konnte und es auch für LTPs bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Kutikulasynthese spielen, wäre eine Hypothese, dass die unterschiedlichen Infektionsphänotypen mit Sclerotinia und Botrytis auf eine strukturelle Veränderung der Kutikulabeschaffenheit zurückzuführen sind. Weiterhin konnte für AZI1 eine mögliche Rolle in der Verwundungsantwort detektiert werden, da sowohl die AZI1 Genexpression, als auch die erhaltenen basal signifikant erhöhten 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA)-Gehalte auf eine negativ regulatorische Rolle von AZI1 in der Verwundungs-abhängigen JA-Signaltransduktion hindeuten. / Functional characterization of two lipid transfer proteins involved in Arabidopsis thaliana pathogen defense response

In Tumoren an Arabidopsis thaliana, induziert über Agrobacterium tumefaciens (Stamm C58), ist von den 49 bekannten Lipidtransferproteinen (LTPs) nur die Expression von LTP2 stark erhöht (Deeken et al., 2006). Mutanten ohne LTP2-Transkripte (ltp2KO) entwickeln deutlich kleinere Tumore als der Wildtyp. Durch die permanenten Zellstreckungs- und Dehnungsprozesse besitzen Tumore keine intakte Epidermis (Efetova et al., 2007). Dies wiederum führt zum Verlust einer vollständigen Cuticula-Schicht, welche von der Epidermis produziert wird und dieser als Barriere zur Umwelt aufgelagert ist. Um den transpirationsbedingten Wasserverlust zu minimieren, werden in Tumoren langkettige Aliphaten in die äußeren Zellschichten eingelagert (Efetova et al., 2006). Ein ähnliches Szenario findet um Verwundungsareale statt (Kolattukudy et al., 2001). Die Gen-Expression von LTP2 wird nicht durch tumorinduzierende Agrobakterien ausgelöst. Faktoren wie Verwundung, sowie die Applikation des Trockenstress-Phytohormons Abscisinsäure (ABA) begünstigen die LTP2-Gen-Expression positiv. Außerdem ist der LTP2-Promotor in Gewebe aktiv, in welchem sekundäre Zellwandmodifikationen auftreten, sowie insbesondere in Abscissionsschichten von welkenden Organen. Ungerichtete Lipidanalysen der ltp2KO-Mutante im Vergleich zum Wildtyp zeigten nur signifikante Veränderungen in der Menge definierter Sphingolipide – obwohl bislang eine Beteiligung von LTP2 am Transfer von Phospholipiden postuliert wurde. Allerdings kann das LTP2-Protein, wie Protein-Lipid-Overlay-Analysen demonstrierten, weder komplexen Sphingolipide noch Sphingobasen binden. Neben Sphingobasen sind auch langkettige Fettsäuren Bestandteile von Sphingolipiden und diese sind wiederum Bindepartner von LTP2. Um eine eventuelle Beteiligung von LTP2 an der Bildung von Suberin von Tumoren zu zeigen, wurde dieses analysiert. Die GC-MS-Analysen des Tumor-Suberins haben jedoch veranschaulicht, dass durch das Fehlen von LTP2-Transkripten das Lipidmuster nicht beeinträchtigt wird. Eine Überexpression von LTP2 im gesamten Kormophyten war trotz drei unabhängiger experimenteller Ansätze nicht möglich. Daher wurde das Protein ektopisch in epidermalen Zellen exprimiert (CER5Prom::LTP2). Die Transgenen CER5Prom::LTP2 wiesen einige morphologische Besonderheiten auf, wie verminderte Oberflächenhydrophobizität, aberrante Blüten- und Blattmorphologien etc., die typisch für Wachsmutanten sind. GC-MS-Analysen der cuticulären Wachse dieser transgenen Pflanzen zeigten, einen erhöhten Gehalt an C24- und C26-Fettsäuren, wohingegen die korrespondierenden Aliphaten wie Aldehyde und Alkane dezimiert waren. Unterstützend zeigten Lokalisationsanalysen, dass das LTP2-Protein an/in der Plasmamembran assoziiert ist. Somit kann die These aufgestellt werden, dass LTP2 langkettigen, unverzweigten Aliphaten (Fettsäuren) an der Grenzfläche Plasmamembran/Zellwand transferiert, die zur Versieglung und Festigung von Zellwänden benötigt werden. / Out of 49 known lipid transfer protein (LTP) only the expression of LTP2 is highly increased in tumors induced on Arabidopsis thaliana via Agrobacterium tumefaciens (strain C58; Deeken et al., 2006). Mutants with no LTP2 transcripts (ltp2KO) develop significantly smaller tumors than the wild-type. Due to the permanent cell stretch and elongation processes tumors do not possess an intact epidermal layer (Efetova et al., 2007). This leads to the loss of a complete cuticle layer, which is produced by the epidermis and builds up a barrier to the environment. To minimize the transpirational water loss, long-chain aliphatic compounds are incorperated into the outer cell layers of tumors (Deeken et al., 2006). The gene expression of LTP2 is not triggered by tumor-inducing agrobacteria. Instead, factors such as wounding and the application of the phytohormone abscisic acid (ABA) induce the LTP2 gene expression. In addition, the LTP2 promoter is highly active in tissue, in which secondary cell wall modifications occur, and in the abscission zone of wilting organs. Untargeted lipid analyzes of ltp2KO mutant in comparison to the wild type showed significant changes in the amount of defined sphingolipids only - although the involvement of LTP2 has been postulated for the transfer of phospholipids. However, the LTP2 protein, as protein-lipid overlay analysis demonstrated, binds neither complex sphingolipids nor sphingobases. Instead LCFAs, which are part of sphingolipids are binding partners of LTP2. In order to show a possible involvement of LTP2 in the formation of tumor-suberin GC-MS analyzes were performed. These demonstrated that the composition of the lipid-pool is not altered in ltp2KO plants. Overexpression of LTP2 was not possible in spite of three independent experimental approaches. The protein was instead expressed ectopically in epidermal cells (CER5Prom::LTP2). The transgenes CER5Prom::LTP2 showed some morphological abnormities, such as reduced surface hydrophobicity, aberrant flowers and leaf morphologies, which are typical for wax mutants. GC-MS analyzes of the cuticular wax of those transgenic lines revealed an increased amount of C24- and C26- fatty acids. Furthermore LTP2 was localized at the plasma membrane. Thus, this thesis proposes a role of LTP2 in the transfer of long chain, unbranched aliphatics (fatty acids), which are needed to seal up and strengthen cell walls at the interface plasma membrane and cell wall.

<p>The synthesis and breakdown of sugars is one of the most important functions in Nature. Consequently, sugar structures are used both as energy storage and as building blocks to stabilise and protect the cell. The formation of these structures is performed by glycosyltransferases (GT), an enzyme group structurally conserved within all kingdoms. Until now, only two different folds have been discovered by crystallisation of GTs, i.e. GT-A and GT-B. A third fold family has however been proposed by fold predictions. In this thesis, a multivariate data analysis was successfully used in classifying and predicting both fold and reaction mechanism (inverting or retaining) of GTs. This method was also used to obtain information about the separating parameters for the reaction mechanism classification. This information could be traced back to the amino acid sequence. The method could as well be used to analyse and identify the properties of membrane binding regions of GTs, and subsequently distinguish soluble from membrane-associated enzymes. Most functionally characterised enzymes only use one substrate, synthesising one product. <i>Mycoplasma pneumoniae</i>, a common human pathogen with a small genome has only three proposed GTs. The bacterium was, however expected to have a greater number of GTs, due to its ability to make both glycolipids and capsule. Here we have determined the function of one of these enzymes, MPN483 and discovered its ability to both use different acceptors, and make elongated glycolipids with up to three galactose residues, with both DAG and ceramide as the base. Many of the synthesised glycolipids were also found to be immunogenic, hence showing their biological importance. The properties of lipids are known to be important for the function of a biological membrane. We have here shown that not only the charge but also the shape of the lipids are important for several protein mediated membrane processes in <i>Echerichia coli</i>, such as the function of the LacY.</p>

This study was conducted to examine the antioxidative effect of conjugated linoleic acid (CLA) in irradiated, cooked ground beef patties. The hypothesis was that CLA would be retained during irradiation and would reduce lipid oxidation that is caused by irradiation. The objective was to evaluate the effects of CLA alone and in combination with irradiation on lipid oxidation, fatty acid composition, cooking loss, moisture and fat content, and trained panel sensory evaluations of beef patties. CLA was added at 0, 1, 2, or 4% level during the grinding process. Addition of CLA during the grinding process increased CLA cis-9,trans-11 and CLA trans-10,cis-12 isomers in both irradiated and non-irradiated cooked ground beef patties (irradiated at 1.6 kGy) (P = 0.0001). Weight loss during cooking was greater in irradiated beef patties than in non-irradiated patties (P = 0.004). Irradiation reduced the serumy/bloody aromatic attribute and increased browned aromatic attribute, browned aftertaste, and wet dog/hairy aromatic attribute (P < 0.05). There was no significant main effect of irradiation on the basic tastes. The linoleic acid, CLA cis-9,trans-11, and CLA trans-10,cis-12 were decreased by irradiation (P < 0.05). Although irradiation decreased the CLA isomers, higher percentages of CLA isomers were retained in irradiated patties containing a 4% free fatty acid preparation of CLA (FFA-CLA), reflecting the ability of the FFA preparation to reduce lipid oxidation that is caused by irradiation. The thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) values were significantly higher in irradiated, cooked ground beef patties than in non-irradiated ground beef patties (P = 0.004). Although the FFA-CLA was effective in reducing lipid oxidation that is caused by irradiation, it increased painty aromatic attribute, bitter taste, and astringent aftertaste due to the soapy flavor of the free fatty acid (all P < 0.05). The FFA-CLA decreased cooked beef/brothy and serumy/bloody aromatic attribute and browned aftertaste (all P < 0.05). The 1% triacylglycerol (TAG) preparation of CLA reduced TBARS in irradiated, cooked patties to levels seen in control, non-irradiated patties. The 1% TAG concentration also provided good retention of CLA in the cooked ground beef.

Micro/nano-patterning of supported lipid bilayers (SLBs) has shown considerable potential for addressing fundamental biophysical questions about cell membrane behavior and the creation of a new generation of biosensors. Herein are presented several novel lithographic methods for the size-controlled patterning of SLBs from the microscale to the nanoscale. Using these methods, chemically distinct types of phospholipid bilayers and/or Escherichia Coli (E. Coli) membranes can be spatially addressed on a single microchip. These arrays can, in turn, be employed in the studies of multivalent ligand-receptor interactions, enzyme kinetics, SLBs size limitation, and membrane-associated species separation. The investigations performed in the Laboratory for Biological Surface Science include the following projects. Chapters II and III describe the creation of lab-on-a-chip based platforms by patterning SLBs in microfluidic devices, which were employed in high throughput binding assays for multivalent ligand-receptor interactions between cholera toxin B subunits (CTB) and ganglioside GM1. The studies on the effect of ligand density for multivalent CTB-GM1 interactions revealed that the CTB-GM1 binding weakened with increasing GM1 density. Such a result can be explained by the clustering of GM1 on the supported phospholipid membranes, which in turn inhibits the binding of CTB. Chapter IV characterizes the enzymatic activity of phosphatase tethered to SLBs in a microfluidic device. Higher turnover rate and catalytic efficiency were observed at low enzyme surface densities, ascribing to the low steric crowding hindrance and high enzyme fluidity, as well as the resulting improvement of substrate accessibility and affinity of enzyme catalytic sites. Chapter V presents sub-100 nm patterning of supported biomembranes by atomic force microscopy (AFM) based nanoshaving lithography. Stable SLBs formed by this method have a lower size limit of ~ 55 nm in width. This size limit stems from a balance between a favorable bilayer adhesion energy and an unfavorable bilayer edge energy. Finally, chapter VI demonstrates the electrophoretic separation of membrane-associated fluorophores in polymer-cushioned lipid bilayers. This electrophoretic method was applied to the separation of membrane proteins in E. Coli ghost membranes.

The multidrug transporter LmrP, member of the major facilitator superfamily (MFS), confers L. lactis and recombinant E. coli cells resistance to an array of cytotoxic compounds including antibiotics. LmrP mediates drug extrusion from the plasma membrane by an electrogenic proton/drug exchange reaction, whereby a positively charged substrate may move towards the external medium in exchange for two or more protons moving towards the cytoplasm. Recent studies have suggested that MFS transporters require phosphatidylethanolamine (PE) for function and proper topology. However, the specificity of the PE requirement, as well as the contribution of the electrochemical gradient (the driving force of the substrate transport) to this lipid requirement was not addressed. Here we report a new approach for addressing PE specific requirement for the function and the structure of membranes transporters. We used methyl-PE and dimethyl-PE analogs of PE to show that only replacement of the three hydrogens by methyl moieties leads to changes in the biochemical and biophysical properties of the reconstituted protein. This suggests that LmrP does not depend on the bulk properties of the phospholipids tested but solely on the hydrogen bonding ability of the headgroup. We then show that a single point mutation in LmrP, D68C, is sufficient to recapitulate precisely every biochemical and biophysical effect observed when PE is replaced by phosphatidylcholine (PC) ( including energy transfer between the protein tryptophan residues and the lipid headgroups). We conclude that the negatively charged Asp-68 is likely to participate in the interaction with PE and that such interaction is required for proton gradient sensing, substrate binding, and transport. Because Asp-68 belongs to a highly conserved motif in the Major Facilitator Superfamily (which includes LacY and EmrD), this interaction might be a general feature of these transporters that is involved in proton gradient sensing and lipid dependence.

Actuellement le criblage en vue de la recherche de nouveaux agents antitumoraux se base principalement sur la qualité cytotoxique d’une molécule. Le principal défaut de cette approche est qu’aucune sélection n’est faite sur le mode d’action du médicament. L’objectif de ce travail est la mise au point d’une méthode permettant un classement rapide et objectif du mode d’action de molécules à visée thérapeutique par spectroscopie infrarouge. La spectroscopie infrarouge est une technique d’absorption de la lumière fournit la signature chimique d’un échantillon. L’excellente qualité du signal rend possible son utilisation comme outil discriminant. En outre, cette technique d’analyse se démarque des autres par son caractère non destructif et la rapidité d’acquisition des données. Elle se révèlerait donc une méthode de choix pour effectuer du criblage de molécules en vue de la recherche de nouveaux agents thérapeutiques. Dans un premier temps nous avons voulu évaluer la possibilité d’utiliser la spectroscopie infrarouge pour isoler la signature spectrale du mode d’action induit par des concentrations sub-létales de ouabaïne, un composé de la famille des cardénolides, sur une lignée tumorale de prostate. Nous avons montré que cette signature évolue au cours du temps et peut-être corrélée aux données biologiques décrites dans la littérature. Nous avons également mis en évidence pour la première fois une modification de la composition lipidique de la cellule. Cette altération a été caractérisée au cours du temps par spectrométrie de masse. Nous avons ensuite voulu définir les limites de la méthode. La littérature souligne la diversité des modes d’action que peut induire un agent thérapeutique selon sa concentration. Nous avons montré que cette diversité se reflète sur le spectre infrarouge de cellules tumorales traitées à la ouabaïne en distinguant au moins deux modes d’action distincts, dépendant de la concentration en ouabaïne. Par ailleurs, nous avons montré que la confluence pouvait modifier significativement le spectre infrarouge d’une cellule. Neanmoins cette signature est unique et orthogonale à celle induite par la ouabaïne. Finalement, nous avons évalué le potentiel de la spectroscopie infrarouge à distinguer des modes d’action induits par des molécules à la structure chimique proche. Nous avons montré qu’il était possible de caractériser spécifiquement chacun des modes d’action. D’autre part nous avons mis en évidence que les modes d’action de molécules issues d’une même classe d’agent thérapeutique conduisaient à des signatures spectrales similaires. Cette partie du travail souligne la possibilité d’utilisation de la spectroscopie infrarouge pour un classement objectif, uniquement basé sur leur mode d’action d’agents thérapeutiques potentiels.

The thesis is divided into two major parts. The first part focuses on the localisation of probes in lipid/polymeric bilayers and in GM1 micelles. Included in this thesis is a new approach based on electronic energy transfer/migration (FRET/DDEM), which efficiently determines transversal positions of fluorescent molecules in lipid bilayers. This approach has been used to locate newly synthesized lipid probes in DOPC bilayers. The label was introduced at the end of sn-2 acyl chains of variable length. Analytical models accounting for FRET exist for a limited number of basic geometries. Here, a combination of FRET and Monte Carlo simulations enables the localisation of probes in bicelles and in bilayers containing pores, i.e. in lipid systems with variable curvature, or in non-homogenous lipid systems. This approach has been used to test whether conical-like fluorescence probes have an increased affinity to highly curved regions, which would enable preferential labelling of membrane pores. A simplified FRET model has been applied to localize 2-pyridones, a class of potential drugs, in GM1 micelles. Since the localisation of drugs within nanoparticles might influence the release kinetics and loading efficiency, knowledge about the drug location is highly relevant. It turned out that all derivatives were localised at the core-shell interface of GM1 micelles. The second part of the thesis focuses mainly on the estimation of lipid nanodomain size by means of FRET, which still remains the most powerful method in this field. Limitations of FRET in the determination of domain size have been explored. We showed that the limitations of FRET are mainly caused by a low probes affinity to either the liquid-ordered or liquid-disordered phase. In the continuing work we provided a detailed dynamic and structural study of crosslinker-triggered formation of nanodomains. Here, two different domains have been revealed, i.e. i) domains whose size grows with increasing amount of added cholera toxin (CTxB), and to which CTxB binds tightly; ii) domains formed in membranes containing a slightly increased amount of sphingomyelin (as compared to i) whose size does not change during titration by additional CTxB and to which CTxB binds less tightly. / Disertace je rozdělena do dvou hlavníchčástí. Prvníčást se zabývá lokalizací značek v lipidových/polymerních dvojvrstvách a v GM1micelách. V práci prezentujeme nový přístup založený na přenosu/migraci elektronické energie (FRET/DDEM), jež umožňuje efektivně určovat vertikální pozici fluorescenčních molekul uvnitř lipidové dvojvrstvy. Tato metoda byla použita k lokalizaci nově syntetizovaných lipidových značek značených na konci sn-2 acylového řetězce s různou délkou v DOPC dvojvrstvách. Analytické modely popisující FRET existují pouze pro limitovaný počet základních geometrií. Kombinace FRETu s Monte Carlo simulacemi nicméně umožňuje lokalizaci značek v bicelách a v dvojvrstvách obsahujících póry, tj. v lipidových systémech s proměnlivým zakřivením a v nehomogenních lipidových útvarech. Tento přístup umožnil např. zjistit, zda kuželovitětvarované značky mají zvýšenou afinitu k vysoce zakřiveným oblastem dvojvrstvy, což by umožnilo preferenční značení pórů. Lokalizovány byly rovněž tři deriváty 2-pyridonů(potencionálních léčiv) v GM1micelách za použití jednoduchého modelu zohledňujícího FRET mezi donory a akceptory nacházejícími se v micelách. Lokalizace léčiv v nanočásticích ovlivňuje kinetiku uvolňování (release kinetics) a množství látky solubilizované v micelách (loading efficiency). Druhá část se především zabývá určováním velikostí lipidových nanodomén pomocí FRETu, který stále zůstává nejvíce výkonnou metodou v této oblasti. Zkoumány byly limitace FRETu v určování lipidových nanodomén. Ukázalo se, že tato omezení jsou především způsobena nízkou afinitou značek buď k Lonebo k Ldfázi. V navazující studii jsme poskytnuli detailní dynamickou a strukturní studii formace nanodomén indukované crosslinkerem. Objevili jsme dva typy domén: a) domény, jejichž velikost se zvětšuje s rostoucím množstvím přidaného cholera toxinu (CTxB) a k nimž se CTxB váže pevně a b) domény vzniklé v membránách se zvýšeným množstvím sfingomyelinu (ve srovnání s a)), jejichž velikost se nemění během titrace dodatečným CTxB a k nimž se CTxB váže méně pevně. / This thesis has been elaborated within the framework of the Agreement on JointSupervision (co-tutelle) of an International Doctoral Degree Programmebetween Charles University in Prague, Czech Republic and the Department of Chemistry at Umeå University, Sweden.

<p>Several abnormal conditions, including some cancers, have been associated with changes in the membrane lipid and FA composition. Dietary fat serves as a major source of lipids and FA, particularly the polyunsaturated fatty acids (PUFA), n-6 and n-3. High intakes of n-6 PUFA have been linked to the development of colon cancer in association with low n-3 PUFA intake. Therefore understanding the differences in the lipid and FA profiles between cancer and normal cells in the colon, and the role diet plays in these factors may be invaluable in understanding their role in carcinogenesis. This study compares the lipid profile of azoxymethane (AOM) induced colon polyps to that of the surrounding mucosa tissue in rats fed a diet high in n-6 PUFA. Male Fischer rats were fed the AIN-76A diet containing sunflower oil that has high n-6 PUFA content for a period of nine months. Results indicate that the lipid and FA content of the colon polyps differs significantly from the surrounding mucosa. Colon polyps had an increase in membrane phopholipids phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE). Changes in membrane fluidity were indicated by the decrease (p&lt / 0.05) in the PC/PE and cholesterol/phospholipids (chol/PL) ratios, and increase (p&lt / 0.05) in the polyunsaturated FA/saturated FA (P/S) ratio. Metabolism of FA was significantly altered in the polyps favouring n-6 FA metabolism and the production of prostaglandin E2. No clear indication of impaired &Delta / 6-desauturase enzyme activity was noticed. Increases in the n-6 PUFA content could be a reflection of the dietary FA intake that increases FA incorporation in the polyps. Changes in the FA parameters of the polyps, particularly an increase in C20:4n-6 and the n6/n3 ratio have been shown to contribute to the rapid growth of cancer tissue. These lipid changes associated with the development of colon polyps could provide unique targets for developing strategies in chemoprevention by dietary manipulation.</p>