De nombreux processus biologiques liés aux membranes cellulaires lipidiques sont encore très mal connus. La présence d'eau et d'ions à l'interface influence les propriétés structurelles et dynamiques de la bicouche lipidique. Les techniques de fluorescence sont très utiles pour étudier les membranes en raison de la grande sensibilité des sondes à leur environnement. Nous avons utilisé la technique de relaxation de solvant (SR) pour explorer l'hydratation et la mobilité de l'eau. Nous avons également réalisé des calculs quantiques (QM) et des dynamiques moléculaires (DM) pour étayer nos expériences. Les résultats SR montrent qu'un petit cation (Na+) est très attiré par la membrane et augmente sa rigidité à l'opposé des cations (NH4+, Cs+) plus gros. Les anions (CI04-, SCN-) s'adsorbent à l'interface plus facilement que Cl-. Ces anions changent la mobilité et l'hydratation des têtes polaires des lipides de la bicouche. Les études SR de la zone hydrophobe de la membrane montrent que les processus de relaxation sont ici très complexes. lis reflètent des processus rapides intramoléculaire (relaxation de torsion, transferts de charge) et des processus intermoléculaires lents. Les calculs QM ont permis de créer les champs de force de trois sondes fluorescentes (Prodan, Laurdan et C-laurdan). Les simulations DM ont permis de déterminer les positions des sondes dans une membrane DOPC. La modélisation reproduit correctement les résultats SR, en particulier les temps de relaxation : de l'ordre de la ps en solvant aqueux et de la ns dans la membrane. Les simulations MD sont complémentaires des méthodes SR et permettent de surveiller le comportement de molécules uniques. / Many biologically important processes and phcnomena in lipid membranes are still not fully understood. The presence of ions and water molœules has a significant influence on the structural and dynamical properties of lipid bilayers. Fluorescent techniques are versatile tools for studying the lipid membranes, because the fluorescence emission is strongly sensitive to dye environment. We have conducted fluorescent solvent relaxation (SR) experiments to explore the hydration and mobility properties in lipid membranes in the presence of different chaotropic ions. We have also carried out Quantum Mechanical (QM) calculations and Molecular Dynamics (MD) simulations for supporting the SR experiments. SR experiments show that small cation (Na+) is attracted to the membrane and increases rigidity ofbilayer, while larger cations (NH/, Cs+) should not. Large anions (CI04·, SCN') adsorl, at the membrane interface more easily than smaller ones (Cl') and significantly change tl!e mobility and hydration of the headgroup region oflipid bilayer. SR study ofhydrophobic part of the membrane show that SR processes are complex there and reflect botl!: faster, intramolecular (torsional relaxation or fonnation of charge transfer state) and slower, intermolecular (SR) relaxation processes. QM calculatiom were used to create force-field for three fluorescent dyes (Prodan, Laurdan and C-laurdan). MD simulations allow detennining position of the dye in the lipid membrane in the ground state and after excitation and reproduce correctly SR timescale- ps in water and ns in the membrane. MD simulations extend the capabilities of SR method and allow observing the behaviour of individual molecules.

This work addresses properties of two-component lipid membranes on the experimentally relevant spatial scales of order of a micrometer and time intervals of order of a second by means of lattice-based Monte Carlo (MC) simulations. To be able to do that with reasonable computational efforts the lipid membrane is modeled as a square lattice of lipid molecules with next-neighbor interaction. This allows for efficient computation and thus provides a large-scale simulation with which it was possible to obtain important results previously not reported in simulation studies of lipid membranes. After properly tuning the next-neighbor interaction energies the simulation reproduces the experimental phase diagram of the DMPC/DSPC lipid system which is used as a model system in this work. Beyond that, the MC simulation provides a more detailed description of the phase behavior of the lipid mixture than the experimental data. It is found that, within a certain range of lipid compositions, the phase transition from the fluid phase to the fluid–gel phase coexistence proceeds via near-critical fluctuations, while for other lipid compositions this phase transition has a quasi-abrupt character. The complete combined state and component phase diagram is constructed by structure function analysis which confirms the existence of a critical point in the system. The dynamics of membrane coarsening after an abrupt temperature quench to the fluid–gel coexistence region of the phase diagram are studied. In this context, it is found that lateral diffusion of lipids plays an important role in the fluid–gel phase separation process. Dynamic scaling is observed only if the ratio of gel and fluid phase in the membrane stays constant in time. The line tension characterizing lipid domains in the fluid–gel coexistence region is found to be in the pN range thus matching values both predicted theoretically and measured experimentally. When approaching the critical point, the line tension, the inverse correlation length of fluid–gel spatial fluctuations, and the corresponding inverse order parameter susceptibility of the membrane vanish in agreement with recent experimental findings for model lipid membranes. By simulating single particle tracking and fluorescence correlation spectroscopy experiments it is found that in the presence of near-critical fluctuations lipid molecules show transient subdiffusive behavior, which is a new result important for understanding the origins of subdiffusion in cell membranes which are believed to be close to a critical point. The membrane–cytoskeleton interaction strongly affects phase separation, enhances subdiffusion, and eventually leads to hop diffusion of lipids. Thus, a minimum realistic model for membrane rafts showing the features of both microscopic phase separation and subdiffusion is established.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales. / The blood-brain barrier (BBB), composed of tightly bound endothelial cells (ECs), regulates the entry of blood-borne molecules and immune cells into the CNS. Recent studies indicate that the Hedgehog (Hh) signaling pathway in adult tissues plays an important role in vascular proliferation, differentiation and tissue repair. Using a lipid membrane raft-based proteomic approach, I have identified the Hedgehog (Hh) pathway as a signaling cascade involved in preserving and upkeeping BBB functions. My study shows that human astrocytes express and secrete Sonic Hh (Shh) and conversely, that human BBB-ECs bear the Hh receptor Patched-1 (Ptch-1), the signal transducer Smoothened (Smo) as well as transcription factors of the Gli family. Furthermore, activation of the Hh pathway in BBB-ECs restricts the passage of soluble tracers in vitro. By blocking the Hh signaling in vitro and by using Shh knock-out (-/-) embryonic mice, I demonstrate a reduced expression of TJ molecules claudin-5, occludin and ZO-1. Hh activation also decreases the surface expression of cell adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, and decreases BBB-ECs secretion of pro-inflammatory chemokines IL-8/CXCL8 and monocytes chemoattractant protein 1 MCP-1/CCL2, resulting in a reduction of migrating CD4+ lymphocytes across human BBB-EC monolayers. In vitro treatment with inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ, upregulates the production of astrocytic Shh and the BBB-EC surface expression of Ptch-1 and Smo. In active Multiple Sclerosis (MS) lesions, in which the BBB is disrupted, Shh expression is drastically upregulated in hypertrophic astrocytes, while Ptch-1 and Smo expression is down-regulated or left unchanged, suggesting that a deregulation in the Hh signaling pathway may prevent the barrier stabilizing properties of Hh. Our data demonstrate an anti-inflammatory and BBB-promoting effect of astrocyte-secreted Hh and suggest that a pro-inflammatory environment disrupt the BBB by impacting, at least in part, on Hh signaling in brain ECs.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales. / The blood-brain barrier (BBB), composed of tightly bound endothelial cells (ECs), regulates the entry of blood-borne molecules and immune cells into the CNS. Recent studies indicate that the Hedgehog (Hh) signaling pathway in adult tissues plays an important role in vascular proliferation, differentiation and tissue repair. Using a lipid membrane raft-based proteomic approach, I have identified the Hedgehog (Hh) pathway as a signaling cascade involved in preserving and upkeeping BBB functions. My study shows that human astrocytes express and secrete Sonic Hh (Shh) and conversely, that human BBB-ECs bear the Hh receptor Patched-1 (Ptch-1), the signal transducer Smoothened (Smo) as well as transcription factors of the Gli family. Furthermore, activation of the Hh pathway in BBB-ECs restricts the passage of soluble tracers in vitro. By blocking the Hh signaling in vitro and by using Shh knock-out (-/-) embryonic mice, I demonstrate a reduced expression of TJ molecules claudin-5, occludin and ZO-1. Hh activation also decreases the surface expression of cell adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, and decreases BBB-ECs secretion of pro-inflammatory chemokines IL-8/CXCL8 and monocytes chemoattractant protein 1 MCP-1/CCL2, resulting in a reduction of migrating CD4+ lymphocytes across human BBB-EC monolayers. In vitro treatment with inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ, upregulates the production of astrocytic Shh and the BBB-EC surface expression of Ptch-1 and Smo. In active Multiple Sclerosis (MS) lesions, in which the BBB is disrupted, Shh expression is drastically upregulated in hypertrophic astrocytes, while Ptch-1 and Smo expression is down-regulated or left unchanged, suggesting that a deregulation in the Hh signaling pathway may prevent the barrier stabilizing properties of Hh. Our data demonstrate an anti-inflammatory and BBB-promoting effect of astrocyte-secreted Hh and suggest that a pro-inflammatory environment disrupt the BBB by impacting, at least in part, on Hh signaling in brain ECs.