Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Après avoir été considéré pendant des années comme un polluant environnemental, il a récemment été mis en évidence que le sulfure d’hydrogène est le troisième transmetteur gazeux, aux côtés des monoxydes d’azote et de carbone. Dans ce travail de thèse, deux types d’outils moléculaires ont été visés : a) Des sondes fluorescentes pour détecter H2S, basées sur une utilisation originale de la chimie de coordination cherchant à favoriser l’attaque du sulfure d’hydrogène sur le ligand plutôt que sur le métal. Malgré leur forte réponse à H2S en solution tampon, celles-ci ne se sont malheureusement pas révélées sélectives vis-à-vis d’autres thiols biologiques. b) Des donneurs lents de sulfure d’hydrogène. Les premiers composés développés, basée sur la chimie de coordination, se comportent malheureusement comme des donneurs rapides. Par contre, la seconde famille, constituée de molécules organiques, s’est révélée être un excellent substitut des sels d’H2S couramment utilisés dans les études biologiques malgré leurs effets indésirables. De plus, nous avons aussi répondu à un défi synthétique en obtenant le premier complexe Fe—SH comportant un ligand hydrosulfure impliqué dans une liaison hydrogène, telle que celle trouvée dans les hémoglobines des bactéries Bacillus subtilis et Thermobifida fusca. / Pas de résumé en anglais

Les métalloprotéinases de matrice (MMPs) sont des enzymes impliquées dans la restructuration tissulaire et la migration cellulaire. La MMP-2, en particulier, a été reconnue comme biomarqueur de la progression ou du pronostic de plusieurs pathologies, comme l'arthrite, l'athérosclérose, l'infarctus et le cancer. Son rôle exact est mal caractérisé. Pour ces raisons, il est important de développer des outils pour nous permettre d'étudier la MMP-2 de manière spécifique et non invasive. Actuellement, il existe une grande quantité de sondes optiques (imagerie optique), d'agent de contrastes (imagerie par résonance magnétique) et de radiotraceurs (tomographie d'émission par positrons et tomographie d'émission monophotonique) ciblant les MMPs. Par contre, aucune de ces molécules ne permet de quantifier spécifiquement l'activité MMP-2, particulièrement envers la MMP-9 qui possède des substrats similaires. De plus, la plupart des études publiées sur le sujet sont incomplètes. Cette Thèse résume nos progrès dans le développement de molécules permettant de cibler spécifiquement et d'effectuer l'imagerie de la MMP-2. Toutes les molécules testées sont activées rapidement par la MMP-2 et se révèlent sélectives in vitro par rapport aux MMP- 3, MMP-7 et MMP-9. Tout d'abord, un agent de contraste (PCA2-switch) est évalué dans un modèle de tumeur sous-cutanée chez la souris et nous permet de différencier entre des tumeurs possédant des niveaux d'activité faible ou élevé de la MMP-2. Nous explorons ensuite une série de sondes fluorescentes activables, dont l'une permet l'obtention de résultats prometteurs in vitro (haut rendement de l'atténuation et haute spécificité d'activation par la MMP-2 par rapport à la MMP-9). Toutefois, cette sonde ne se révèle pas spécifiques in vivo - plutôt, toutes les sondes testées résultent en l'obtention d'une distribution similaire à la distribution d'une molécule contrôle (non spécifique). L'une des principales limitations du domaine de l'imagerie des MMPs est le manque de contrôle pour différencier la captation et l'activation spécifique de la captation non spécifique des molécules testées. La dernière section de cette Thèse inclut une étude de captation tumorale dans un modèle de tumeur sous-cutanée et de radiothérapie. Cette étude met en évidence l'implication de la captation non spécifique dans le signal observé en imagerie.

Le monoxyde d’azote (NO), un neurotransmetteur important en biologie, a attiré l’attention ces dernières années pour son rôle majeur joué dans l’apparition d’une myriade de maladies telles que certains cancers, diabètes etc. Comprendre les mécanismes biologiques liés à la production du NO pourrait aboutir à la découverte de nouveaux moyens thérapeutiques. Cependant, le fonctionnement de l’enzyme qui produit le monoxyde d’azote, la NO-Synthase, n’est pas complétement élucidé. Dans ce but, des approches biomimétiques peuvent apporter une solution. Les microréacteurs ou proto-cellules, enveloppes imitant sommairement la compartimentation cellulaire sont un outil de choix, permettant de répliquer un environnement contrôlé où les concentrations et distances de réactions sont proches d’une cellule, permettant ainsi d’étudier le fonctionnement de la NO-Synthase. Cette thèse présente trois problématiques qui ont pour but de développer un tel microréacteur encapsulant la NO-Synthase : (1) la libération contrôlé d’espèces réactives déclenchée par un stimulus lumineux, (2) le suivi de l’activité de l’enzyme par des sondes fluorescentes et (3) le contrôle de la réaction enzymatique dans l’espace et dans le temps. Deux systèmes ont été étudiés pour libérer de manière contrôlée des espèces: la première consiste à déstabiliser des nano polymersomes par photo-clivage du copolymère qui le constitue. Le deuxième système est basé sur une rapide augmentation de la pression osmotique par irradiation à l’intérieur des polymersomes, induisant un éclatement de ceux-ci et la libération d’espèces encapsulées. La deuxième problématique abordée est le suivi de l’activité enzymatique au moyen de sondes hydrophobes et hydrophiles fluorescentes qui détectent le monoxyde d’azote à différent endroits du microréacteur. Le dernier point abordé est l’étude des microréacteur et la libération contrôlé en leur sein. / Nitric oxide (NO) has been identified as an important chemical messenger in cells and living organisms. Understanding the mechanism involved in NO production by NO-synthase is of fundamental importance. Mimicking basic cell functions by encapsulating NO-synthase in a controlled and confined cell like environment, could help provide information about the enzyme. Polymersomes resulting from the self-assembly of amphiphilic block copolymers were used as the synthetic cell like microreactor. To this end, three major challenges were addressed in this thesis: (1) controlling species release and concentration inside the microreactor, (2) measuring the enzyme response by NO detection and (3) controlling enzymatic reactions in space and time inside a microreactor. Light was used as the exogenous stimulus to induce release; its application is instantaneous, non-invasive and easy to control spatially and temporally. Two different ways to release species via light excitation were explored. The first strategy involves destabilization of nanopolymersomes by block separation, induced by copolymer photocleavage. The second strategy was to induce fast osmotic pressure increase of the polymersomes internal medium, resulting in bursting and species release. In order to monitor NO production by NO-synthase in different parts of the microreactor, hydrophobic and hydrophilic fluorescent NO probes have been synthesized and studied showing excellent correlation with NO concentration. The release of species inside microreactor was finally achieved in order to control enzymatic reaction.

Ce manuscrit porte sur la synthèse et les applications d'une nouvelle série de composés hétéroaromatiques : les 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones. La première partie de ce manuscrit présente la préparation de ces squelettes via une réaction d'O-arylation intramoléculaire. La seconde partie du manuscrit repose sur la réactivité de ces entités chimiques et de leur utilisation en tant qu'intermédiaires de synthèse. La fonctionnalisation des 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones, via des réactions de couplage pallado-catalysées, a permis d'obtenir des systèmes polyfonctionnalisés plus complexes. Les pyrido-oxazinones ont également été transformées, en une étape, en divers petits hétérocycles d'intérêt : les 1,3,5-triazines, les 1,2,4-triazoles et les 1,2,4-oxadiazoles. La dernière partie du manuscrit est consacrée à l'utilisation des molécules synthétisées comme potentielles sondes fluorescentes pour la détection de protéines oxydées. / This work focused on the synthesis and applications of a novel series of heteroaromaticcompounds: the 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones. The first part of this thesis presents thepreparation of these pyrido-oxazinones via an intramolecular O-arylation reaction. The secondpart of this work relies on the reactivity of these chemical entities and their use as buildingblocks. The functionalization of the 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones has been studied viacross-coupling reactions to obtain more elaborated structures. The pyrido-oxazinones werealso converted, in one step, into other diverse small molecules of interest: 1,3,5-triazines,1,2,4-triazoles and 1,2,4-oxadiazoles. The last part of this thesis was devoted to the use of theobtained heterocycles as potential fluorescent probes for the detection of carbonylatedproteins.

Cette étude a consisté en le développement et l’évaluation de nouvelles molécules pour la radiochimiothérapie concomitante. Ce travail a abouti à la conception de nouveaux agents chimiothérapeutiques duaux basés sur la combinaison covalente de deux radiosensibilisateurs: un inhibiteur de la PARP d’une part, et un alkylant de l’ADN (complexe de platine ou témozolomide) d’autre part. Les évaluations biologiques ont permis de mettre en évidence l’intérêt d’une molécule duale inhibiteur de la PARP/platine. Parallèlement à ce projet, le développement d’outils moléculaires pour l’étude d’inhibiteurs de la PARP a été entrepris. Ainsi, plusieurs sondes d’affinité ont été conçues pour une étude d’inhibiteurs de la PARP par protéomique chimique. Ce travail a permis de valider la spécificité d’une sonde d’affinité pour la PARP1 et la PARP2. Finalement, des molécules fluorescentes inhibitrices de la PARP ont été développées dans l’objectif d’un criblage d’inhibiteurs de PARP3 par anisotropie de fluorescence. / The main topic of this work was the development and biological evaluation of dual molecules for concomitant chemoradiotherapy. To this end, new dual chemotherapeutic agents were designed by linking covalently two radiosensitizers: a PARP inhibitor and an alkylating agent (platinum complex or temozolomide). This study led to an efficient PARP inhibitor/platinum dual molecule. A complementary approach was to develop affinity probes to study PARP inhibitors by a chemical proteomic method. This study permitted to validate the selectivity of an affinity probe for PARP1 and PARP2. Finally, fluorescent PARP inhibitor probes were synthesised and evaluated for a PARP3 screening by fluorescence anisotropy.

La fluorescence excitée à deux photons est actuellement largement utilisée pour l'imagerie de tissus biologiques, mais la faible sensibilité des fluorophores utilisés en microscopie confocale (excitation à un photon) à une excitation à deux photons (ADP) rend nécessaire la conception et la synthèse de nouveaux fluorophores spécifiques pour la microscopie de fluorescence par excitation bi-photonique (MFEB). Mon travail de thèse a ainsi porté sur l'ingénierie moléculaire (conception, synthèse et caractérisations) de nouveaux fluorophores pour la MFEB. Nous nous sommes particulièrement intéressés à des systèmes unidimensionnels (1D) de petite taille comportant des systèmes π étendus autour d'un cœur rigide (dicétopyrrolopyrrole ou DPP) et entourés de différents systèmes électro-actifs. Nous avons modifié par la suite les fluorophores précédents de manière à pouvoir les conjuguer à des molécules d'intérêt biologique, comme des protéines. Ces fluorophores bio-conjugables ont été greffés sur un peptide du virus HIV étudié au laboratoire : TAT (Trans-Activator of Transcription). L'imagerie par microscopie biphotonique a été effectuée avec succès sur des cellules HeLa. Nous nous sommes ensuite tourné vers la mise au point de nouvelles sondes multimodales pour associer la MEBP à une autre modalité d'imagerie : la résonance magnétique nucléaire et la microscopie électronique (imagerie corrélative). Pour ce faire nous avons développé des colorants fluorescents par excitation bi-photonique comportant une entité paramagnétique ou dense aux électrons (nanoparticules de magnétite, ion gadolinium III ou atomes lourds comme le platine et l'or).

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La fluorescence excitée à deux photons est actuellement largement utilisée pour l’imagerie de tissus biologiques, mais la faible sensibilité des fluorophores utilisés en microscopie confocale (excitation à un photon) à une excitation à deux photons (ADP) rend nécessaire la conception et la synthèse de nouveaux fluorophores spécifiques pour la microscopie de fluorescence par excitation bi-photonique (MFEB). Mon travail de thèse a ainsi porté sur l’ingénierie moléculaire (conception, synthèse et caractérisations) de nouveaux fluorophores pour la MFEB. Nous nous sommes particulièrement intéressés à des systèmes unidimensionnels (1D) de petite taille comportant des systèmes π étendus autour d’un cœur rigide (dicétopyrrolopyrrole ou DPP) et entourés de différents systèmes électro-actifs. Nous avons modifié par la suite les fluorophores précédents de manière à pouvoir les conjuguer à des molécules d’intérêt biologique, comme des protéines. Ces fluorophores bio-conjugables ont été greffés sur un peptide du virus HIV étudié au laboratoire : TAT (Trans-Activator of Transcription). L’imagerie par microscopie biphotonique a été effectuée avec succès sur des cellules HeLa. Nous nous sommes ensuite tourné vers la mise au point de nouvelles sondes multimodales pour associer la MEBP à une autre modalité d’imagerie : la résonance magnétique nucléaire et la microscopie électronique (imagerie corrélative). Pour ce faire nous avons développé des colorants fluorescents par excitation bi-photonique comportant une entité paramagnétique ou dense aux électrons (nanoparticules de magnétite, ion gadolinium III ou atomes lourds comme le platine et l’or). / Two-photon induced fluorescence is nowadays widely used for the imaging of biological tissues. The classical fluorophores used in confocal microscopy exhibit low sensitivity to two-photon excitation for the two-photon excitation microscopy (TPEM), led the researchers towards the development of new fluorophores, specifically engineered for TPEM. This manuscript describes our work on conception, synthesis and characterizations of new one-dimensional fluorophores based on dicétopyrrolopyrrole (DPP) central core, surrounded by various electro-active systems through π conjugated systems. We also modified such fluorophores to be able to conjugate them to molecules of biological interest, such as proteins. These bio-conjugable fluorophores were grafted on a peptide of HIV virus studied in our laboratory: TAT (Trans-Activator of transcription). The imaging by TPEM was successfully performed on HeLa cells. In addition we developed new multimodal probes for the correlative light electronic microscopy and for the correlative imaging fluorescence microscopy/ Magnetic resonance imaging (MRI). Theses multimodal probes associate a fluorescent moiety based on the DPP core associated to a paramagnetic or electron dense entity (magnetite nanoparticles, gadolinium III or heavy atoms such as platinum or gold).