Comme nous l’indiquions dans le But du Travail, le mélanome figure parmi les cancers associés aux pronostics les plus sombres, et ce en raison de son taux de réponse très faible à la radiothérapie et à la chimiothérapie. Cette résistance à la radiothérapie et à la chimiothérapie provient essentiellement du fait que les cellules de mélanomes sont résistantes à l’apoptose, et que la radiothérapie ainsi que bon nombre d’agents chimiothérapiques induisent la mort des cellules cancéreuses en y induisant l’apoptose. Nous avons voulu investiguer les rôles de la gastrine et de la galectine 1 sur le comportement biologique des cellules de mélanomes afin de voir s’il était possible de proposer la gastrine et/ou la galectine 1 comme nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cas du mélanome. Notre stratégie de recherche est basée sur le principe (démontré sur le plan expérimental par de nombreuses études) selon lequel les cellules cancéreuses migrantes résistent à l’apoptose, et sont dès lors protégées contre les effets pro-apoptotiques de la chimiothérapie et de la radiothérapie qui représentent la quasi totalité de l’arsenal thérapeutique dont disposent les oncologues pour combattre les cancers. Diverses études expérimentales ont démontré que le fait de réduire le taux de migration de cellules cancéreuses résistantes à l’apoptose conférait à celles-ci une sensibilité accrue aux agents pro-apoptotiques. Nos résultats démontrent que la gastrine modifie de manière très significative les propriétés migratoires des cellules de mélanomes, sans toutefois modifier leur sensibilité à des agents pro-apoptotiques. Au contraire, la gastrine protègerait les cellules de mélanomes contre l’apoptose. Nous démontrons également dans notre travail, in vivo, un rôle pro-angiogénique pour la gastrine au sein de xénogreffes de mélanomes humains. Signalons que notre travail est le premier à démontrer un rôle potentiel de la gastrine au niveau de la biologie des mélanomes, tout au moins sur le plan expérimental. Tout comme nous l’avons observé pour la gastrine, la galectine 1 semble également conférer aux cellules de mélanomes un certain degré de résistance aux agressions chimiothérapiques. Cette fois, le fait de diminuer le taux d’expression de la galectine 1 au sein de cellules du mélanome murin expérimental B16F10 (qui exprime des quantités importantes de galectine 1) renforce l’effet thérapeutique du témozolomide qui est une molécule cytotoxique. Cet effet semble survenir, tout au moins partiellement, suite à une diminution du taux d’expression de la protéine Hsp70 (suite à la diminution du taux d’expression de la galectine 1), avec pour conséquence une augmentation de la mort cellulaire par perméabilisation de la membrane des lysosomes. Nous proposons une nouvelle approche thérapeutique pour combattre les mélanomes en faisant appel à la technique des petits ARN interférants (siRNA), dirigés dans le cas présent contre la galectine 1.

Les tumeurs primitives du système nerveux central les plus fréquentes sont les gliomes et se classent en deux grandes catégories : les astrocytomes et les oligodendrogliomes. La survie des patients porteurs d'oligodendrogliomes est de 70 % à 5 ans alors qu'elle ne dépasse pas une année en moyenne pour les glioblastomes. La divergence de pronostic observée entre ces deux types de gliomes résulte d'une différence de sensibilité aux traitements conventionnels. La chimiothérapie classique appliquée à ces tumeurs permet en effet d'obtenir une réponse pour 90 % des oligodendrogliomes contrastant avec moins de 10 % pour les glioblastomes. La chimio-sensibilité particulière des oligodendrogliomes peut être la conséquence des altérations géniques survenant lors du processus oncogène. Elle résulterait de l'absence d'expression de gènes de résistance des régions chromosomiques 1p et 19q, gènes ainsi distinctement exprimés entre les deux entités tumorales. Les gènes de réparation de l'ADN peuvent rendre compte de la résistance aux traitements, puisque responsables de la correction des adduits créés par la chimiothérapie. Nous avons recherché grâce à une évaluation fonctionnelle in vitro, quels gènes de réparation de la région 1p/19q sont impliqués dans la correction des adduits du CDDP. Quatre gènes ont ainsi été identifiés : ercc1, ercc2, mutyh et pnkp. Ces résultats ont été vérifiés avec du témozolomide, la drogue de référence dans le traitement des gliomes. L'expression des ces gènes a été mesurée dans des extraits de tumeurs de patients, résistantes (glioblastomes) et sensibles (oligodendrogliomes) à la chimiothérapie, et les 3 premiers sont effectivement surexprimés dans les glioblastomes. Ces gènes définissent ainsi les cibles d'un traitement chimio-sensibilisant. Nous avons entrepris l'étude préclinique de ce traitement basé sur l'utilisation concomitante de siRNA dirigés contre les gènes d'intérêt et de chimiothérapie. Des modèles de gliomes humains sous-cutanés et intra-cérébraux résistants à la chimiothérapie ont été utilisés chez les souris. Le traitement chimio-sensibilisant ciblant ercc1 a significativement augmenté l'effet du témozolomide sur les tumeurs, permettant ainsi de diminuer leur volume. Il pourrait faire prochainement l'objet d'essais cliniques. Nos travaux, menés de l'in silico au stade préclinique, d'une part démontrent la validité de notre hypothèse, c'est-à-dire l'implication des gènes de réparation du 1p/19q dans la chimio-résistance, et conduisent surtout à une opportunité thérapeutique nouvelle de chimio-sensibilisation.

<p align="justify">Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus répandues chez l’adulte et l’enfant, et les plus agressives avec une médiane de survie inférieure à quinze mois. Deux caractéristiques biologiques rendent leur traitement particulièrement difficile. Tout d’abord, la capacité d’invasion du parenchyme cérébral par les cellules gliales tumorales rend la résection chirurgicale totale impossible. De plus, ces cellules développent une résistance aux stimuli pro-apoptotiques rendant la plupart des agents chimiothérapeutiques peu efficaces contre ce type de tumeur. Actuellement, le seul agent chimiothérapeutique efficace dans le traitement des glioblastomes est le témozolomide. Malheureusement des mécanismes de résistance acquise peuvent apparaître chez des patients traités avec cette molécule. Nous avons donc étudié ces mécanismes moléculaires de résistance acquise au témozolomide et dans un deuxième temps nous avons tenté de trouver de potentielles molécules susceptibles de lutter contre les gliomes. </p align="justify"><p><p align="justify">Nous avons rendu résistants deux modèles de cellules gliales tumorales au témozolomide par un traitement incrémental durant plusieurs mois. Grâce à une analyse de type Affymétrix, nous avons comparé l’expression de l’ensemble des gènes entre les lignées normales et les lignées rendues résistantes. Deux familles de gènes sont ressorties comme impliquées dans ce processus de résistance :les transporteurs glucose et les aldo-kéto réductase 1C (akr1c). Pour les transporteurs glucose, il se pourrait que leur implication se fasse au niveau du métabolisme des cellules résistantes en permettant d’apporter plus de substrat énergétique et ainsi contourner les effets pro-autophagiques du témozolomide. Dans le cas des akr1c, il semblerait que leur surexpression ait pour but d’augmenter la prolifération des cellules tumorales résistantes. </p align="justify"><p><p align="justify">Nous avons, par la suite, étudié les propriétés anticancéreuses de métabolites fongiques, les phyllostictines, extraites du champignon Phyllosticta cirsii. Quatre métabolites naturels et deux dérivés hémisynthétiques ont été testés démontrant des activités plus ou moins importantes sans toutefois montrer in vitro de biosélectivité entre cellules tumorales et cellules normales. Les phyllostictines semblent se lier au groupement thiol libre comme nous l’avons déterminé sur le glutathion ou la cystéine. Il reste à déterminer la cible des phyllostictines dans les cellules tumorales et à améliorer la sélectivité de ces molécules.</p align="justify"> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Comme nous l’indiquions dans le But du Travail, le mélanome figure parmi les cancers associés aux pronostics les plus sombres, et ce en raison de son taux de réponse très faible à la radiothérapie et à la chimiothérapie. Cette résistance à la radiothérapie et à la chimiothérapie provient essentiellement du fait que les cellules de mélanomes sont résistantes à l’apoptose, et que la radiothérapie ainsi que bon nombre d’agents chimiothérapiques induisent la mort des cellules cancéreuses en y induisant l’apoptose. Nous avons voulu investiguer les rôles de la gastrine et de la galectine 1 sur le comportement biologique des cellules de mélanomes afin de voir s’il était possible de proposer la gastrine et/ou la galectine 1 comme nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cas du mélanome. <p>Notre stratégie de recherche est basée sur le principe (démontré sur le plan expérimental par de nombreuses études) selon lequel les cellules cancéreuses migrantes résistent à l’apoptose, et sont dès lors protégées contre les effets pro-apoptotiques de la chimiothérapie et de la radiothérapie qui représentent la quasi totalité de l’arsenal thérapeutique dont disposent les oncologues pour combattre les cancers. Diverses études expérimentales ont démontré que le fait de réduire le taux de migration de cellules cancéreuses résistantes à l’apoptose conférait à celles-ci une sensibilité accrue aux agents pro-apoptotiques. Nos résultats démontrent que la gastrine modifie de manière très significative les propriétés migratoires des cellules de mélanomes, sans toutefois modifier leur sensibilité à des agents pro-apoptotiques. Au contraire, la gastrine protègerait les cellules de mélanomes contre l’apoptose. Nous démontrons également dans notre travail, in vivo, un rôle pro-angiogénique pour la gastrine au sein de xénogreffes de mélanomes humains. Signalons que notre travail est le premier à démontrer un rôle potentiel de la gastrine au niveau de la biologie des mélanomes, tout au moins sur le plan expérimental. <p>Tout comme nous l’avons observé pour la gastrine, la galectine 1 semble également conférer aux cellules de mélanomes un certain degré de résistance aux agressions chimiothérapiques. Cette fois, le fait de diminuer le taux d’expression de la galectine 1 au sein de cellules du mélanome murin expérimental B16F10 (qui exprime des quantités importantes de galectine 1) renforce l’effet thérapeutique du témozolomide qui est une molécule cytotoxique. Cet effet semble survenir, tout au moins partiellement, suite à une diminution du taux d’expression de la protéine Hsp70 (suite à la diminution du taux d’expression de la galectine 1), avec pour conséquence une augmentation de la mort cellulaire par perméabilisation de la membrane des lysosomes.<p>Nous proposons une nouvelle approche thérapeutique pour combattre les mélanomes en faisant appel à la technique des petits ARN interférants (siRNA), dirigés dans le cas présent contre la galectine 1.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette étude a consisté en le développement et l’évaluation de nouvelles molécules pour la radiochimiothérapie concomitante. Ce travail a abouti à la conception de nouveaux agents chimiothérapeutiques duaux basés sur la combinaison covalente de deux radiosensibilisateurs: un inhibiteur de la PARP d’une part, et un alkylant de l’ADN (complexe de platine ou témozolomide) d’autre part. Les évaluations biologiques ont permis de mettre en évidence l’intérêt d’une molécule duale inhibiteur de la PARP/platine. Parallèlement à ce projet, le développement d’outils moléculaires pour l’étude d’inhibiteurs de la PARP a été entrepris. Ainsi, plusieurs sondes d’affinité ont été conçues pour une étude d’inhibiteurs de la PARP par protéomique chimique. Ce travail a permis de valider la spécificité d’une sonde d’affinité pour la PARP1 et la PARP2. Finalement, des molécules fluorescentes inhibitrices de la PARP ont été développées dans l’objectif d’un criblage d’inhibiteurs de PARP3 par anisotropie de fluorescence. / The main topic of this work was the development and biological evaluation of dual molecules for concomitant chemoradiotherapy. To this end, new dual chemotherapeutic agents were designed by linking covalently two radiosensitizers: a PARP inhibitor and an alkylating agent (platinum complex or temozolomide). This study led to an efficient PARP inhibitor/platinum dual molecule. A complementary approach was to develop affinity probes to study PARP inhibitors by a chemical proteomic method. This study permitted to validate the selectivity of an affinity probe for PARP1 and PARP2. Finally, fluorescent PARP inhibitor probes were synthesised and evaluated for a PARP3 screening by fluorescence anisotropy.

Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes avec une incidence en France de l'ordre de 4 nouveaux cas par an et pour 100 000 habitants (2400/ an). Le traitement standard pharmacologique des glioblastomes nouvellement diagnostiqués consiste en première ligne en une administration de témozolomide (75 mg/m2/j) pendant la radiothérapie, suivie d’une consolidation de 6 cycles. Cependant, malgré ce traitement, la médiane de survie n’est que de 15 mois et de 3 à 9 mois pour les rechutes. De nouvelles approches thérapeutiques sont donc indispensables. Parmi elles, ont été évalués le recours à d’autres chimiothérapies (irinotecan) et à l’inhibition de l’angiogénèse. L'angiogenèse est en effet un processus critique dans la progression GBM. L'inhibition de l'angiogenèse, induisant une réduction des vaisseaux sanguins, permet une diminution de l’apport des nutriments et d'oxygène à la tumeur. De manière générale, l’efficacité des traitements du glioblastome est soumise, dans un premier temps, à leur passage intra-cérébral au travers de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’objectif de notre travail était d’une part d’étudier l’impact de l’expression du transporteur d’efflux ABCB1 sur la distribution cérébrale du témozolomide (TMZ) et de l’irinotecan (CPT-11), et d’autre part, d’évaluer le rôle du bevacizumab (BVZ)(inhibiteur de l’angiogénèse) dans la modulation du passage intra-cérébral et intra-tumoral du TMZ et du CPT-11. A l'aide d'une étude pharmacocinétique comparative chez les souris CF1 mdr1a (+/+) et les souris CF1 mdr1a (-/-), nous avons mis en évidence un efflux actif du TMZ, du CPT-11 et de son métabolite actif le SN-38 du cerveau vers le plasma, impliquant ABCB1 au niveau de la BHE. Nous avons également démontré in vivo que le TMZ s'accumule dans la tumeur cérébrale et que le prétraitement par BVZ augmente la distribution tumorale de TMZ. En revanche, le BVZ n’a montré aucun effet sur la distribution cérébrale ou tumorale du CPT-11. Le BVZ apparaitrait donc comme un moyen intéressant d’augmenter la distribution intratumorale du TMZ. Dans ce même objectif, une collaboration initiée dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence l’intérêt de l’utilisation d’ultrasons dans l’ouverture de la BHE et l’amélioration de la distribution cérébrale des médicaments. / Glioblastomas are the most common brain tumors occurring in France with an incidence of 4 new cases per year per 100 000 population (2400/year). The gold standard pharmacological treatment of newly diagnosed glioblastoma relies on temozolomide administration (75 mg/m2/d) concomitant to radiotherapy, followed by six cycles consolidation. However, despite this treatment, the median survival is only 15 months and relapse occurs within 3 to 9 months. New therapeutic approaches are needed. Among them, other chemotherapies (irinotecan) and inhibition of angiogenesis were explored. Angiogenesis is a critical process in GBM progression. Inhibition of angiogenesis, inducing a reduction of the blood vessels, reduces supply of nutrients and oxygen to the tumor. The effectiveness of GBM treatment is subjected to intra-brain diffusion through the blood-brain barrier. The objective of this study was firstly to study the impact of efflux transporter ABCB1 brain expression on temozolomide (TMZ) and irinotecan (CPT-11) brain distribution, and secondly, to assess the role of bevacizumab (BVZ)(angiogenesis inhibitor) in the modulation of TMZ and CPT-11 brain and tumor distribution. Using a comparative pharmacokinetic study in CF1 mdr1a (+/+) and CF1 mdr1a (-/-) mice, we demonstrated an active efflux of TMZ, CPT-11 and its active metabolite SN-38 from the brain to the plasma involving ABCB1. We also demonstrated in vivo that TMZ accumulates in brain tumor and BVZ pretreatment increased TMZ tumor distribution. However no effect of BVZ on CPT-11 brain or tumor distribution was evidenced. Therefore BVZ would appear to be an interesting way to increase TMZ tumor distribution. The same objective was pursued through a different approach using ultrasound unfocused to open the BBB (Carthera collaboration).

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire la plus fréquente et agressive chez l’adulte. Son traitement, une exérèse chirurgicale maximale suivi d’un traitement adjuvant (radiothérapie et témozolomide [TMZ]), n’offre qu’un bénéfice modeste de survie médiane (14.6 mois vs. 12.1 mois pour radiothérapie post-chirurgie seule) (STUPP et al., 2005). Le TMZ demeure l’agent de choix pour le traitement du GBM. Malgré sa biodisponibilité approchant 100% suivant son administration per os (PO) (Diez et al., 2009), sa pénétration dans le liquide céphalorachidien n’est que de 20% (Ostermann et al., 2004). Ainsi, il se peut que les limites thérapeutiques du TMZ soient reliées aux barrières hémato-encéphalique (BHE) et hémato-tumorale (BHT). Plusieurs stratégies alternatives tentent de contourner ces barrières comme l’administration intra-artérielle (IA) avec une ouverture osmotique de la BHE (OBHE). Cette technique permet une plus grande distribution d’agent thérapeutique au système nerveux central (SNC). L’utilisation de cette stratégie avec le témozolomide n’a jamais été étudiée à ce jour. Nous avons émis l’hypothèse que son utilisation permettra d’augmenter la concentration de TMZ dans le SNC et que, lorsque combiné avec la radiothérapie, permettra de rehausser son activité anti-tumorale. Les objectifs du projet sont : (1) l’évaluation de la sensibilité des cellules F98 au TMZ in vitro; (2) la caractérisation de la neuropharmacocinétique du TMZ in vivo, selon différents modes d’administration; et (3) l’évaluation de l’effet anti-tumoral du TMZ in vivo, selon différents modes d’administration. Les expérimentations in vivo ont été exécutées dans le modèle syngénique Fischer-F98, porteur de tumeur gliale. L’expérimentation in vitro a démontré une résistance importante des cellules F98 au TMZ. La méthodologie développée a permis de démontrer que l’infusion IA avec et sans OBHE augmente la concentration maximale et l’aire sous la courbe du TMZ dans la tumeur cérébrale et dans le parenchyme cérébral ipsilatéral du rat Fischer-F98. Par contre, aucun bénéfice de survie n’a été observé en utilisant ces stratégies alternatives. Au contraire, l’acheminement augmenté du TMZ au SNC semble toxique. Un bénéfice de survie a été mesuré suite à l’ajout d’un traitement de radiothérapie, mais de façon indépendante au mode de livraison de TMZ ou de solution saline normale (groupe contrôle). Enfin, nos résultats témoignent de l’impact du mode d’acheminement sur la distribution d’un agent thérapeutique au SNC. En détournant la BHE, l’utilisation judicieuse d’approches alternatives combinée à un agent thérapeutique approprié a un grand potentiel clinique dans le traitement des GBM. / Abstract : Glioblastoma (GBM) is the most frequent and aggressive primary brain tumor in adults. Its’ standard treatment, maximal surgical resection followed by an adjuvant treatment (radiotherapy and temozolomide [TMZ]) offers only a modest median survival benefit of 14.6 months (vs. 12.1 months with post-surgery radiotherapy alone) (Stupp et al., 2005). TMZ remains the therapeutic agent of choice for the treatment of GBM. Despite its bioavailability approaching 100% after a per os administration (Diez et al., 2009), its cerebrospinal fluid penetration is only of 20% (Ostermann et al., 2004). Thus, TMZ’s therapeutic limitations could be due to the blood-brain barrier (BBB) and blood-tumor barrier (BTB). Alternative routes of drug delivery attempt to bypass these barriers. For example, intra-arterial (IA) administration with an osmotic blood-brain barrier disruption (OBBBD) allows greater drug distribution to the central nervous system (CNS). Its use with TMZ, with or without radiotherapy, has never been studied. We hypothesized that it will increase TMZ concentration in the CNS and that, when combined to radiotherapy, it will intensify its anti-neoplastic activity. The project was divided in three parts: (1) the evaluation of F98 cells’ in vitro sensitivity to TMZ; (2) the in vivo caracterization of TMZ’s neuropharmacokinetics, following different routes of administration; and (3) the in vivo evaluation of TMZ’s anti-tumoral effect, following different routes of administration. The syngenic glioma Fischer-F98 model was used in all in vivo experiments. Our results showed the F98 cells to be resistant to TMZ in vitro. The methodology developed showed that an IA infusion with and without OBBBD increased TMZ’s peak concentration and area under the curve in the brain tumor and ipsilateral brain parenchyma in the Fischer-F98 rat. All the while limiting systemic exposure. However, no survival benefit was observed with the use of these alternative strategies. More so, TMZ’s enhanced delivery to the CNS seemed toxic. A survival benefit was measured following the addition of radiotherapy. This was independent of the route of delivery of TMZ or normal saline. In summary, our results provide evidence that the method of TMZ administration does impact its CNS delivery. By bypassing the BBB, the judicious use of local delivery approaches combined with the appropriate therapeutic agent can have a great clinical potential in the treatment of glioblastomas.