Thèse de doctorat : Biochimie : Metz : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre. Notes bibliogr.

Die schubförmige Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche, demyelinisierende, multifokale Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS). Autoreaktive immunologische Prozesse, insbesondere der T-Zell vermittelten Immunität, leisten einen entscheidenden Beitrag zur Pathogenese der schubförmigen MS. Ein wesentlicher Schritt in immunpathogenetischen Modellen ist die transendotheliale Migration von Immunzellen über die Blut-Hirn-Schranke. Die Interaktion des very late antigen 4 (VLA-4) mit dem vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) und mit Fibronectin leistet einen wesentlichen Beitrag zur Extravasation von T Zellen in das ZNS. Auf dieser Schlüsselfunktion des VLA-4 gründet die Therapie mit Natalizumab, einem monoklonalen Antikörper gegen die α4 Integrinkette. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Auswirkungen der Therapie der schubförmigen MS mit Natalizumab auf die transendotheliale Migration von CD4+CD25+FOXP3+ und CD4+HLA-G+ regulatorischen T Zellen (Treg) und auf die antiproliferative Funktion von FOXP3+ Treg zu untersuchen. Zentrale Hypothese war, dass Natalizumab über eine universelle Blockade der Immunzellinvasion in das ZNS hinaus immunmodulatorisch wirkt. Unter Verwendung eines prospektiven, longitudinalen Studiendesigns wurden die T Zellen von RR-MS Patienten unter Therapie mit Natalizumab (n=31) sowie von stabilen RR-MS Patienten ohne Therapie und gesunden Spendern in jeweils zwei in vitro Modellen der Blut-Hirn-Schranke sowie Treg vermittelter Immuntoleranz untersucht. FOXP3+ regulatorische T-Zellen banden weniger Natalizumab und exprimierten weniger VLA-4 als nicht-regulatorische T Helferzellen, bewahrten unter Therapie jedoch einen höheren Anteil ihrer ursprünglichen VLA-4 Expression. FOXP3+ Treg gesunder Spender wiesen in vitro höhere Migrationsraten über mikrovaskuläre humane Hirnendothelzellen als nicht-regulatorische T Helferzellen auf und akkumulierten innerhalb der T-Zell Population nach Migration. Dagegen reicherten sich FOXP3+ Treg von MS Patienten in Folge der Migration nur nach Vorbehandlung des Endothel mit inflammatorischen Zytokinen an, nicht jedoch ohne diese Vorbehandlung. Natalizumab beeinträchtigte die transendotheliale Migration von FOXP3+ Treg und nicht-regulatorischen T Helferzellen von MS Patienten in vergleichbaren Ausmaßen. HLA-G+ Treg zeigten in den Migrationsanalysen ein den FOXP3+ Treg entgegengesetztes Muster und wiesen ausschließlich in der MS, nicht jedoch im Gesunden, eine höhere Migrationsrate auf als HLA-G- T Helferzellen. Diese Akkumulation von HLA-G+ Treg in der migrierten Zellfraktion ließ sich nach Therapiebeginn nicht mehr nachweisen. Eine ergänzende Einzelfallstudie zu Auswirkungen des LFA-1 Antagonisten Efalizumab auf Treg ergab Hinweise auf eine Schlüsselfunktion dieses Integrins für die Migration von FOXP3+ Treg. Die Analyse der FOXP3+ Treg Suppressorfunktion zeigte eine schrittweise Zunahme des suppressiven Einflusses von FOXP3+ Treg auf die Reifung dendritischer Zellen unter Natalizumabtherapie. Zeitlich parallel kam es zu einem Ungleichgewicht in der Expression von LFA-1 auf der Oberfläche von FOXP3+ Treg und nicht-regulatorischen T Helferzellen. Zusammenfassend stützt die Studie die Hypothese immunmodulatorischer Effekte von Natalizumab in der schubförmigen Multiplen Sklerose, insbesondere auf den Antagonismus von regulatorischen und Effektor-T Zellen. Die Arbeit belegt, dass Natalizumab in vivo über die Blockade von VLA-4 hinaus modulatorisch in das Netzwerk von Adhäsionsmolekülen auf T Zellen eingreift. Die Studienergebnisse ergeben ein Überwiegen regulatorischer Einflüsse auf die Reifung dendritischer Zellen unter Therapie. Berichte zum Beitrag von LFA-1 zur Suppressorfunktion von FOXP3+ Treg werden durch Daten der vorliegenden Studie unterstützt und um Hinweise auf eine zusätzliche, spezifische Bedeutung des Integrins zur präferentiellen Diapedese dieser Treg über die Blut-Hirn-Schranke im Gesunden erweitert. Zudem liefert die Arbeit erstmals Hinweise auf einen Defekt der transendothelialen Migration von FOXP3+ Treg über die Blut-Hirn-Schranke in der schubförmigen Multiplen Sklerose, der zur Entstehung neuer Läsionen beitragen könnte. / Relapsing-remitting multiple sclerosis (MS) is a multifocal, chronic, inflammatory, demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Autoreactive processes, in particular T-cell mediated immunity, are essential to the pathogenesis of MS. A pivotal step in immunopathogenetic models is the diapedesis of immune cells across the blood-brain barrier. Transendothalial migration of encephalitogenic T cells across the blood-brain barrier depends critically on the interaction between very late antigen 4 (VLA-4) and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) as well as fibronectin. The therapeutic rationale for natalizumab, a monoclonal antibody against the α4 chain of VLA-4, is based on this pivotal role of VLA-4 for T-cell diapedesis. This study aimed to examine transendothelial migration of CD4+CD25+FOXP3+ and CD4+HLA-G+ regulatory T cells (Treg) as well as the suppressive capacity of FOXP3+ Treg in relapsing-remitting multiple sclerosis under natalizumab therapy. The study tested the hypothesis that natalizumab exerts immunmodulatory effects beyond a universal blockade of immune cell invasion into the CNS. T cells from MS patients under natalizumab therapy (n=31) were compared to T cells from stable MS patients without treatment and from healthy controls according to a prospective, longitudinal study design. Two in vitro models of the blood-brain barrier and two models of Treg-mediated tolerance were employed. FOXP3+ regulatory T cells exhibited reduced natalizumab binding and VLA-4 expression when compared to non-regulatory T helper cells but preserved a greater proportion of their initial VLA-4 expression under natalizumab therapy. FOXP3+ Treg from healthy controls showed enhanced migration across human brain microvascular endothelial cells when compared to non-regulatory T cells in vitro and accumulated within the T-cell population after migration. FOXP3+ Treg from MS patients, in contrast, accumulated only after pre-treatment of the endothelium with inflammatory cytokines. Natalizumab inhibited transendothelial migration of FOXP3+ Treg and non-regulatory T cells to a similar extent. HLA-G+ Treg showed a reverse pattern in these migration assays: HLA-G+ Treg from MS patients, but not from healthy controls, exhibited enhanced migratory rates when compared to non-regulatory, HLA-G- TH cells. This accumulation of HLA-G+ Treg within the fraction of migrated cells could no longer be detected any more after initiation of natalizumab therapy. The results of a supplementary single case study on the effects of the LFA-1 antagonist efalizumab on Treg pointed towards a pivotal role of this integrin for the preferential migration of FOXP3+ Treg. Suppression of the maturation of dendritic cells by FOXP3+ Treg gradually increased under natalizumab therapy. A growing imbalance in the surface distribution of LFA-1 among FOXP3+ Treg and non-regulatory TH cells parallelled this recovery of MS Treg suppression. In summary, this study supports the hypothesis of immunomodulatory effects of natalizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis, particularly on the antagonism between regulatory and effector T cells. The study documents interference of natalizumab with the network of adhesion molecules on T cells in vivo that extends beyond its blockade of VLA-4. Furthermore, it demonstrates a dominance of Treg-mediated suppression on the maturation of dendritic cells under therapy. It supports recent reports on a pivotal role of LFA-1 for suppressive mechanisms of FOXP3+ Treg and points towards a similar relevance for preferential Treg migration across the blood-brain barrier. Lastly, the study provides the first evidence for deficient transendothelial migration of FOXP3+ Treg in multiple sclerosis, which could contribute to early lesion formation.

Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob dendritische Zellen eine Rolle beim ischämischen Schlaganfall spielen. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurde ein Mausmodell gewählt, in dem es nach Administration von Diphterietoxin zur selektiven Depletion CD11c positiver Zellen kommt (C.FVB-Tg(Itgax-DTR/EGFP)57Lan/J). Hierbei wird der Diphterietoxinrezeptor unter dem CD11c Promotor (ITGAX) exprimiert. Aufgrund der Wiederherstellung dendritischer Zellen nach ca. 24 Stunden waren wiederholte Applikationen von Diphterietoxin notwendig. Die Zusammensetzung anderer Immunzellen wurde dabei im Wesentlichen nicht geändert. Für eine Schlaganfallinduktion wurde eine tMCAO (transient middle cerebral artery occlusion) durchgeführt. Hierbei wird durch Okklusion der A. cerebri media mittels Verschlussfilament für 30 oder 60 Minuten ein Schlaganfall im Mediastromgebiet induziert. Es wurden unterschiedliche Verschlusszeiten, Zeitpunkte und Depletionsraten untersucht. In keinem der Versuchsansätze kam es zu einer signifikanten Veränderung des Schlaganfallvolumens nach Depletion CD11c positiver Zellen. Mittels quantitativer real-time PCR wurde die Expression unterschiedlicher Zytokine nach tMCAO und CD11c-Depletion untersucht. An Tag 1 nach Schlaganfallinduktion und hoher Depletionsrate ergab sich eine Verminderung der Expression von IL-1β und IL-6, während an Tag 3 und niedriger Depletionsrate die Expression dieser Zytokine nach CD11c-Depletion zunahm. Grund hierfür könnte die Expression dieser Zytokine durch andere Zellen des Immunsystems, wie etwa neutrophile Granulozyten oder Mikroglia/Makrophagen sein, die möglicherweise einer regulatorischen Funktion durch die Interaktion von Dendritischen Zellen und regulatorischen T-Zellen unterliegen. Weitere experimentelle Ansätze sind notwendig, um diese Fragestellung beantworten zu können. TGF-β zeigte durchgehend in allen Versuchsanordnungen eine verminderte Expression nach der Depletion dendritischer Zellen. Es ist naheliegend, dass dieses neuroprotektiv-regulatorische Zytokin direkt einer Produktion durch dendritische Zellen oder von nachfolgend aktivierten T-Zellen unterliegt. In immunhistochemischen Studien konnte des Weiteren keine Änderung des Immigrationsverhaltens von CD11b+ Zellen ins Gehirn gesehen werden. Diese Studie unterliegt jedoch einigen Limitationen. So stellte sich im Laufe der Experimente heraus, dass die wiederholte Applikation von Diphterietoxin zu einer erhöhten Mortalität der Versuchstiere führte. Nach Fertigstellung der Experimente erschien hierzu eine Publikation, welche die wiederholte Administration von DTX und die Entwicklung einer Myokarditis im gewählten Mausmodell in Zusammenhang brachte. / The aim of this study was to investigate whether dendritic cells play a role in ischemic stroke. To address the subject we chose a mouse model in which administration of diphteria toxin induces selective depletion of CD11c positive cells (C.FVB-Tg(Itgax-DTR/EGFP)57Lan/J). In these the diphteria toxin receptor is expressed under the CD11c promotor (ITGAX). Due to reconstitution of dendric cells after 24 hours repeated application of diptheria toxin was necessary. In general, the composition of other immune cells was not affected. To induce ischemic stroke, we performed tMCAO (transient middle cerebral artery occlusion). Here ischemic stroke in the perfusion area of the middle cerebral artery is induced by occlusion of the middle cerebral artery via insertion of a blocking filament for 30 or 60 minutes. Different times of blocking, points in time and depletion rates were examined. None of our experimental setups showed significant changes in stroke volumetry after depletion of CD11c positive cells. By means of quantitative real-time PCR we assessed the expression of different cytokines after tMCAO and CD11c depletion. On day 1 after stroke induction and high depletion rate we found a reduction in IL-1β and IL-6 expression, whereas on day 3 and low depletion rate there was an increase of the expression of these two cytokines. This might be due to expression of these cytokines by other cell types of the immune system like neutrophils or microglia/macrophages which may underly regulatory functions due to interaction with dendritic cells and regulatory T cells. Further experiments will be necessary to address these issues thoroughly. In all our experiments TGF-β expression was reduced after depletion of dendritic cells. It appears likely that this neuroprotective-regulatory cytokine is regulated by the production of dendric cells or activated T cells. In immune-histochemical studies there was no change in the migration of CD11b+ cells into the brain. There are some limitations to this study. During our experiments there was evidence that repeated application of diphteria toxin increases mortality in our test animals. After completion of our studies, it was published that repeated administration of DTX favours the development of myocarditis in the chosen mouse model.

Lors d’un stress, l’activation de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS) conduit à une augmentation de la production de glucocorticoïdes (tel que la corticostérone) par les glandes surrénales. Le rôle de la corticotropin-releasing hormone (CRH), à l’origine de l’activation de l’axe HHS, est encore méconnu. En effet, les récepteurs à la CRH sont présents aussi bien au niveau du système nerveux central (SNC), notamment au niveau du cervelet, qu’au niveau du système immunitaire (SI). Cela suggère donc une action directe possible de cette hormone sur ces deux systèmes. Au cours de ce projet, nous avons étudié les régulations des SNC et SI lors d’un stress, et plus particulièrement le rôle de la CRH et de ses récepteurs dans ces régulations. Suite à des injections chroniques de corticostérone, mimant un stress, nous avons observé une altération des fonctions locomotrices qui semble être reversée lorsque le CRH-R1 est inhibé avec un antagoniste. Ces premiers résultats permettent de mettre en avant un éventuel rôle de la CRH dans la régulation des fonctions motrices au niveau du cervelet en conditions de stress. En parallèle, d’autres études in vitro réalisées sur des splénocytes murins stimulés avec de la CRH ont montré une diminution de la viabilité des lymphocytes B (LB). Suite à ces résultats, nous avons caractérisé pour la première fois la présence de récepteurs à la CRH sur cette population de LB murins. Ces résultats montrent l’importance de la CRH dans les régulations des SNC et SI en condition de stress et le rôle de cette hormone dans les interactions entre les deux systèmes / In stress conditions, the Hypothalamo-Pituitary-Adrenal (HPA) axis activation leads to an overproduction of glucocorticoïds (such as corticosterone in rodent) by adrenal glands and this activation is well characterized. However, various questions remain about the precise role of corticotropin-releasing hormone (CRH), which is at the beginning of the HPA activation. Indeed, CRH receptors are presents both in central nervous system (CNS), especially in cerebellum, and in immune system (IS). This suggest a possible direct action of this hormone on both system. In this project, we studied the regulations on CNS and IS in stress conditions and more particularly the CRH role and these receptors in these regulations. After chronic corticsterone injections, to mimic a stress, we observed a locomotor alteration which seems to be inverted when CRH-R1 were inhibited with an antagonist. These first results show an possible CRH role in locomotor regulation in cerebellum under stress condition. In parallel, others in vitro studies performed on murine splenocytes stimulated with CRH showed a B lymphocyte (LB) viability decrease. Furthermore, we are the first to characterise the CRH receptors on murine LB. This work show the CRH importance in CNS and IS regulations under stress conditions and its role in interactions between the two systems

L'accumulation des peptides Aβ40-42 au niveau cérébral est un élément physiopathologique majeur de la Maladie d'Alzheimer (MA) et une cible thérapeutique potentielle. A l'issue de résultats encourageants de vaccination par Aβ dans des modèles murins de la MA, un essai clinique a été entrepris chez l'Homme. Mais il a dû être interrompu en raison de la survenue de méningo-encéphalites chez 6% des patients, supposées liées à une activation inappropriée de lymphocytes T. Une meilleure compréhension des réponses T CD4+ induites par la vaccination semble donc primordiale pour l'optimisation des stratégies vaccinales. Nous avons cherché à identifier les facteurs génétiques qui pourraient avoir un rôle sur l'amplitude et la nature des réponses vaccinales T CD4+ anti-Aβ chez la souris. Nous avons mis en évidence que l'amplitude de la réponse variait en fonction des haplotypes H-2 mais aussi de facteurs génétiques indépendants du CMH et liés à la capacité de générer des réponses T régulatrices (Tregs) anti-Aβ. De plus, l'analyse des réponses vaccinales dans un modèle murin de MA (souris APPPS1) semble suggérer qu'une réponse Treg inhiberait des réponses T CD4 effectrices anti- Aβ spontanées. Ces observations nous ont conduits à rechercher l'impact de ces réponses effectrices et régulatrices dans la physiopathologie de la maladie. En inactivant les cellules Tregs, nous avons pu mettre en évidence les fonctions anti-neuroinflammatoires et les effets bénéfiques de ces cellules sur la pathologie amyloïde et la cognition. Ensemble, nos résultats suggèrent donc que les réponses Treg pourraient limiter l'efficacité vaccinale mais auraient une action neuroprotectrice dans la physiopathologie de la MA.

Chez les patients atteints de sclérose en plaques (SEP), l'inflammation induit une demyélinisation et une mort neuronale. La capacité de remyélinisation, hétérogène chez les patients, est intimement corrélée à la sévérité des symptômes. Les raisons de cette hétérogénéité ne sont pas connues, principalement car ce mécanisme n'a jamais été étudié dans un contexte expérimental approprié. Afin d'y remédier, nous avons développé un nouveau modèle en combinant une démyélinisation focale chez des souris nude à une greffe de lymphocytes (LT) provenant de donneurs sains ou de patients SEP. Cette modèle nous a permis de reproduire l'hétérogénéité de remyélinisation. En comparant le profil de sécrétion des patients selon leur capacité de réparation, nous avons mis en évidence des différences dans celui-ci, qui induisait selon le cas une activation bénéfique ou délétère des microglies ayant pour conséquence une différentiation efficace ou entravée des cellules précurseur d'oligodendrocytes. Cette capacité hétérogène des LT à répondre à une stimulation est partiellement expliqué par le background génétique du patients : les patients porteurs de variants associés à des gènes impliqués dans la fonction des LT folliculaires et des LT CD4+ naïfs induisaient un défaut de remyélinisation lorsque greffés dans une lésion démyélinisée, et ce en dirigeant l'activation microgliale vers un phénotype délétère. En résumé, les LT dirigent l'activation microgliale lors de la remyélinisation et sont donc au moins partiellement responsables de l'échec ou de la réussite de ce mécanisme. La façon dont ils réagissent à la démyélinisation est au moins en partie due au patrimoine génétique du patient. / Inflammation in the central nervous system leads to demyelination and neurodegeneration in patients with multiple sclerosis (MS). MS severity is closely correlated with the efficacy of myelin repair, a process whose effectiveness is very heterogeneous among patients. The reasons of this heterogeneity are largely unknown, mainly because it has never been addressed in a humanized pathological context. To tackle this question, we developed a new model combining focal demyelination in nude mice and graft of MS or healthy donor (HD) lymphocytes (LT). We were able to reproduce partially remyelination heterogeneity. Comparing the secretory profile of patients LT according to their repair capacities, we highlighted an heterogeneous cytokine response leading to a differential microglial (MIG) activation and ultimately an efficient or inefficient maturation of precursor cells during remyelination. To decipher why LT from patients display an heterogeneous response, we hypothesized that the genetic variants known for MS susceptibility could also drive disease severity by influencing LT functions. We found that the interaction of variants associated with genes responsible for T Folicular Helper and naïve Th0 cells functions induce the secretion by patient LT induce a pro-inflammatory activation in MIG, leading to remyelination failure.LT orchestrate MIG activation and are therefore responsible for the success or failure of remyelination. Capitalizing on patients with high repair capacities to understand the cellular and molecular actors leading to successful remyelination in pathological conditions seem to be a key approach to develop therapeutical targets.

Seit der Entdeckung, dass das ZNS ein immunprivilegiertes Organ ist, wurde dies vor allem durch das Fehlen einer afferenten zellulären immunologischen Versorgung erklärt, also dem Fehlen einer zur Auswärtsmigration fähigen APZ- Population im Parenchym und der fehlenden Versorgung des ZNS mit Lymph- gefäßen. In letzter Zeit wurde dieses Erklärungsmodell sowohl prinzipiell als auch experimentell in Frage gestellt. Durch die Verwendung von transgenen Mäusen, die unter dem Promoter von CD11c GFP (green fluorescent protein) exprimieren, konnten wir zum ersten Mal im ZNS-Parenchym von gesunden Mäusen eine CD11c-positive Zellpopulation nachweisen. Diese Zellen zeigen morphologisch starke Ähnlichkeit zu DZs und sind vor allem dort zu finden, wo sich im Rahmen der MS-Erkrankung Demyelinisierungen finden lassen. Mit ihren Fortsätzen sind sie teilweise an der Bildung der glia limitans beteiligt, stehen also in enger anatomischer Beziehung zum perivaskulären Raum. In diesem Raum findet die Selektion der Lymphozyten statt, denen ein Übertritt in das ZNS ermöglicht wird. Eine Beteiligung der CD11c-positiven Zellpopulation an diesem Prozess ist wahrscheinlich. Um diese Zellen genauer zu typisieren isolierten wir mithilfe eines einheitlichen Isolationsprotokolls mononukleäre Zellen aus Gehirn, Lunge, Leber und Milz von Wildtypmäusen und untersuchten diese nach immunologischer Färbung von CD11b, CD11c, CD45, CD80, CD86, F4/80, CD103, CCR2, CX 3 CR1 und Flt 3 mittels Durchflusszytometrie. Hiermit konnten wir zeigen, dass sich in den verschiedenen Organen stark heterogene, umgebungsspezifische CD11c-positive Zellpopulationen finden. Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass Mikro- glia, charakterisiert durch ihre intermediäre Expression von CD45, eine äußerst geringe Expressivität von MHC-II aufweisen. Zusätzlich kultivierten wir isolier- te mononukleäre Zellen aus Hirngewebe und aus der Milz von MHC-II-eGFP Mäusen auf organotypischen Schnittkulturen, die aus dem Hippocampus (engl.: organotypical hippocampal slice cultures - OHSC), respektive der Milz (engl.: organotypical spleen slice cultures - OSSC) von Wildtyptieren gewonnen wurden. Hier konnten wir am lebenden Gewebe über einen Zeitraum von mindestens 72 Stunden mittels konfokaler Mikroskopie eine umgebungsspezifische Adaption der eingebrachten transgenen MHC-II-eGFP-positiven Zellpopulation zeigen. Aus Milzgewebe isolierte mononukleäre Zellen, die auf OHSC kultiviert wurden, ramifizierten und verringerten ihre Expression von MHC-II; wurden diese auf OSSC kultiviert, behielten sie ihre amöboide Form und zeigten eine hohe Ex- pression von MHC-II. Mononukleäre Zellen aus Hirngewebe ramifizierten auf OHSC und zeigten eine geringe Expression von MHC-II; auf OSSC blieben diese Zellen amöboid und zeigten keine signifikante Expression von MHC-II. Diese Befunde lassen den Schluss zu, dass sowohl Umgebungsfaktoren als auch der Ur- sprung dieser mononukleären Zellen ihre immunologische Funktion beeinflussen können. Um der Frage nachzugehen, welche immunologische Funktion die CD11c-positive Zellpopulation im ZNS unter neuroinflammatorischen Bedingungen besitzt und ob sich Anzeichen für eine Auswärtsmigration dieser Zellen finden lassen, verwendeten wir myeloablativ bestrahlte CD11-GFP transgene Tiere, denen wildtyp Knochenmark transplantiert wurde und in denen EAE induziert wurde. Vorangegangene Arbeiten hatten eine mechanische Zerstörung von natürlichen Barrieren, u.a. von Blutgefäßen mit ihren Endothelien, Lymphgefäßen der Haut und der Subcutis, neuronalem Gewebe, Hirnhäuten, etc., in Kauf genommen, um Farbstoffe oder Zellen einzubringen. Durch die Chimärisierung wird eine – nicht vollumfängliche – Trennung der zentralnervösen DZ-Population und ihrem systemischen Gegenstück ohne o.g. mechanische Zerstörung von physiologischen Barrieren erreicht. So kann die Mehrheit der transgener Zellen, die sich 6 bis 8 Wochen nach Chimärisierung findet, dem ZNS zugeordnet werden. Mono- nukleäre Zellen aus homogenisiertem Hirngewebe dieser Tiere wurde mittels Durchflusszytometrie nach Färbung von CD11b, CD45, CD11c, CD80, CD86, F4/80 und MHC-II untersucht. ZNS-ständige Mikroglia, in unserem Modell charakterisiert durch GFP-Positivität und die intermediäre Expression von CD45, zeigen in der Gruppe der stark erkrankten Tiere eine signifikante Erhö- hung ihrer Expression von CD11c-GFP, MHC-II und CD80. Dieses Muster der Oberflächenmarker zeigt die Fähigkeit zur Stimulation von T-Zellen. Verschie- dene Lymphknotenstationen wurden homogenisiert und mittels quantitativer PCR auf ihren Gehalt an transgener DNA hin untersucht. Hier konnten wir eine signifikante Zunahme dieser transgenen DNA in zervikalen und axillären Lymhpknoten stark erkrankter Tiere zeigen. Zusätzlich ließen sich in der Fluo- reszenzmikroskopie ramifizierte Zellen in diesen Lymphknoten finden, welche sowohl GFP als auch P2Y 12 -positiv waren. P2Y 12 ist ein rezent beschriebener Oberflächenmarker, der spezifisch für Mikroglia ist. Zusammenfassend lassen sich diese Ergebnisse dahingehend deuten, dass die CD11c-positive Population im ZNS im Rahmen eines neuroinflammatorischen Prozesses in ZNS-assoziierte Lymphknoten migrieren und dort T-Zellen stimulieren kann. Bei an MS erkrank- ten Patienten könnten diese Lymphknoten ein lohnenswertes anatomisches Ziel darstellen, um zu versuchen mittels immunmodulierender oder -suppressiver Medikamente den neuroinflammatorischen Prozess zu lindern. Auf diese Wei- se ließe sich eventuell die Effektivität dieser Medikamente erhöhen und die systemische, unerwünschte, Wirkung reduzieren.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le système immunitaire contribue au maintien de l'intégrité de l'organisme en s'opposant à la pénétration d'agents extérieurs, en particulier des agents infectieux, et en éliminant les cellules malignes. L'activation des cellules du système immunitaire met en jeu plusieurs mécanismes de signalisation intracellulaire, incluant la translocation nucléaire du facteur de transcription ubiquitaire, NF-KB. Celui-ci joue un rôle important dans les réponses immunes et inflammatoires, et particulièrement dans la prolifération et la survie des lymphocytes T et B. Le fonctionnement du système immunitaire est fortement régulé par les interactions entre les diverses cellules de ce système, et par l'action des anticorps et des cytokines. De plus, il existe des communications bidirectionnelles entre le système immunitaire et le système neuro-endocrinien par l'intermédiaire des neurotransmetteurs, hormones et cytokines qui agissent sur leurs récepteurs spécifiques. Les organes lymphoïdes primaires et secondaires sont innervés par des terminaisons nerveuses qui libèrent des neurotransmetteurs qui sont impliqués dans le contrôle de la différenciation, la prolifération et le fonctionnement des cellules immunitaires. En l'occurrence, la sérotonine est colibérée avec la noradrénaline au niveau des terminaisons nerveuses innervant les organes lymphoïdes primaires et secondaires. Les plaquettes, les mastocytes (chez les rongeurs), les monocytes et les lymphocytes T activés sont aussi des sources importantes de sérotonine au niveau des organes lymphoïdes et des sites inflammatoires. Plusieurs études suggèrent l'implication du système sérotoninergique dans la régulation de la réponse immunitaire. Cependant, les récepteurs impliqués dans ces effets ne sont pas encore bien caractérisés. Dans la présente étude, notre but était de caractériser le récepteur 5-HTiA des lymphocytes B et T, ses fonctions, et ses mécanismes de signalisation cellulaire. Les objectifs spécifiques étaient: (i) étudier et comparer l'expression du récepteur 5-HTiA dans les lymphocytes T et B avant et après activation par des mitogènes; (ii) évaluer le rôle du facteur de transcription NF-KB dans la régulation de l'expression du récepteur 5-HTiA des lymphocytes; (iii) étudier le rôle du récepteur 5-HTiA dans la régulation de la proliferation et la survie des lymphocytes; et (iv) évaluer l'implication du facteur de transcription NF-KB dans les mécanismes de transduction du signal du récepteur 5-HTiA des lymphocytes. Les résultats montrent que les lymphocytes T et B expriment faiblement l'ARN messager 5-HTiA, et le niveau d'expression est fortement augmenté après activation mitogénique. Les niveaux d'expression du 5-HTiA sont comparables chez les deux populations de lymphocytes. Les mitogènes n'influencent pas la stabilité de l'ARN messager 5-HTiA, mais son induction est bloquée par l'actinomycine D, et par les inhibiteurs du NF-KB. De plus, l'expression membranaire de la protéine 5-HTiA augmente après stimulation mitogénique, en parallèle avec l'augmentation de la transcription de l'ARN messager. D'autres part, les agonistes sélectifs 5-HTiA augmentent la prolifération et la survie des lymphocytes activés; ils inhibent la mort des lymphocytes par apoptose, en association avec une augmentation de la translocation du NF-KB dans le noyau. Ainsi, le facteur de transcription NF-KB joue un rôle central dans la surexpression du récepteur 5-HTiA et dans la transmission des signaux de ce récepteur dans l'amélioration de la survie et l'augmentation de la prolifération des lymphocytes activés. Ces résultats suggèrent que le récepteur 5-HTiA des lymphocytes joue un rôle dans l'amplification des réponses immunes et inflammatoires, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle pour moduler l'immunité.

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische neuro-degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems, die durch auto-immun-bedingte Prozesse charakterisiert ist. T Zellen wurden als wesentliche pro-inflammatorische Mediatoren mit der Pathogenese der MS assoziiert. In gesunden Individuen passen Immunzellen ihren Metabolismus, wie die mitochondriale Atmung und Glykolyse, ihrer jeweiligen Funktion und ihrem inflammatorischen Phänotyp an. Im Krankheitsverlauf der MS ist die Bedeutung der metabolischen Anpassung und der damit verbundenen pro-inflammatorischen Mechanismen von T Zell-Subpopulationen noch nicht eindringlich erforscht. Um dieser Fragestellung nachzugehen wurden Relapsing Remitting MS (schubförmig, RRMS) Patienten und sorgfältig aufeinander abgestimmte gesunde Kontrollprobanden als Teil der Studie Depression und Immunfuktion bei MS rekrutiert (n=62). Den Patienten und gesunden Kontrollprobanden wurde Nüchternblut entnommen, woraus periphäre mononukleäre Blutzellen (PBMC) aufgearbeitet wurden, um anschließend CD4+ und CD8+ T Zellen zu isolieren. Die erzielten Ergebnisse zeigten CD4+ T Zell-spezifische Verringerungen der mitochondrialen Atmung und glykolytischen Aktivität in der MS Patienten Kohorte im Vergleich zur Kohorte der gesunden Kontrollprobanden. Darüberhinaus wurden, zusätzlich zu den umfangreichen phänotypischen Charakterisierungen der PBMCs via Durchflußzytometrie, erhöhte Werte des mitochondrialen Membranproteins CPT1a in CD4+ T Zell-Subpopulationen in der MS Patienten Kohorte detektiert. Die Analyse der CD4+ CD25- CD127+ konventionellen T Zell- Subpopulation ergab leicht erniedrigte Werte von IL7-Rα in MS Patienten. Genexpressionsanalysen, die mit pro-inflammatorischen und metabolischen Genen assoziiert sind, ergaben keine Veränderungen in den T Zell-Subpopulationen der MS Patienten. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse weisen auf Funktionsstörungen bei der metabolischen Anpassung in T-Zell-Subpopulationen bei MS Patienten hin und helfen, den Beitrag des Immunmetabolismus bei der Pathogenese der MS Erkrankung besser zu verstehen. / Multiple Sclerosis (MS) is a chronic neurodegenerative disease of the central nervous system characterized by autoimmune-mediated mechanisms. T cells have been associated as central pro-inflammatory mediators in MS pathogenesis. In healthy individuals, immune cells adapt metabolic programs like mitochondrial respiration and glycolysis based on their function and inflammatory phenotype. However, the relevance of metabolic reprogramming and associated pro-inflammatory mechanisms in T cell subpopulations in MS disease is not well understood yet. To address this question, Relapsing Remitting MS (RRMS) patients and meticulously matched healthy control (HC) participants were recruited as part of the clinical study Depression and Immune Function in MS (n=62). Blood samples, after a period of fasting, were collected and CD4+ and CD8+ T cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The results obtained demonstrated decreased mitochondrial and glycolytic activity specific to CD4+ T cells in the MS patient cohort compared to the HC participant cohort. Furthermore, increased CPT1a mitochondrial membrane protein levels were detected in CD4+ T cell subpopulations in the MS patient cohort as assessed in comprehensive flow cytometry PBMC phenotype investigations. The analysis of the CD4+ CD25- CD127+ conventional T cell subpopulation moreover revealed a trend of decreased IL7-Rα expression levels in MS patients. Gene expression measurements of pro-inflammatory and metabolic genes did not reveal alterations in MS patients’ T cell subpopulations. The results obtained in this study allude to dysfunctions in metabolic reprogramming in T cell subpopulations in MS patients and help to better understand the contribution of immunometabolism in the pathogenesis of MS disease.

Objectives: The management of patients with multifocal motor neuropathy (MMN) under everyday clinical conditions has been insufficiently studied. We therefore collected comprehensive observational data on patients with MMN who received intravenous (IV) or subcutaneous (SC) immunoglobulins (IGs) as maintenance therapy. Methods: This was a prospective, noninterventional study (registry) in neurological centres (hospitals and offices) throughout Germany. Results: As of 1 December 2015, 80 patients with MMN were included (mean age 55.4 ± 9.8 years, 67% males, mean disease duration 10.7 ± 10.2 years). The affected limb regions were predominantly distal muscle groups of the upper extremities. On the inflammatory neuropathy cause and treatment (INCAT) scale, 94% of the patients had some disability in the arms and 61% in the legs. At inclusion, 98.8% received IVIG and 1.3% SCIG. Substantial variation was observed between IVIG treatment intervals (every 0.7 to 17.3 weeks) and dosage (0.2–2.1 g/kg body weight received during a single administration; mean monthly dosage, 0.9 g/kg body weight). However, the mean monthly dosage was steady over time. At 1-year follow up, improvement was seen in muscle strength, INCAT and quality of life (QoL) scores (SF-36 questionnaire). Conclusions: The management of patients with MMN in everyday clinical practice demonstrates a wide range of absolute dosages and treatment intervals of IG, supporting the recommended practice of determining treatment dose on an individual patient basis. The improvements in muscle strength and reduction in disability, accompanied by increased QoL, strengthen the case for use of IG as a maintenance treatment for MMN.