Atualmente, a malária é considerada a principal infecção parasitária existente e apresenta distribuição mundial. Dentre as alternativas terapêuticas utilizadas, destacam-se cloroquina (CQ), mefloquina (MQ) e, recentemente, arteméter (ART). Segundo a literatura, estudos farmacocinéticos destes fármacos têm sido dificultados pela ausência de métodos adequados de análise em fluidos biológicos e, no caso dos fármacos quirais (CQ e MQ), com capacidade de determinar os enantiômeros individualmente. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o emprego da microextração em fase líquida (LPME) na preparação de amostras para a determinação destes três fármacos antimaláricos e respectivos metabólitos em plasma. O método para análise enantiosseletiva de CQ e metabólitos teve a LPME como técnica de preparação de amostras, a qual apresentou valores de recuperação no intervalo de 28-66%. Estes analitos foram separados na coluna Chirobiotic V em fase polar-orgânica, com posterior detecção por espectrometria de massas (MS), com interface de eletronebulização (ESI) no modo positivo. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 5-500 ng mL-1 para todos os analitos avaliados. A disposição cinética de CQ e do principal metabólito monodesetilcloroquina (DCQ) em ratos sugere enantiosseletividade após administração do fármaco na forma racêmica, com maiores concentrações de (+)-(S)-CQ e (-)-(R)-DCQ. O método para análise dos enantiômeros de MQ e do metabólito aquiral carboximefloquina (CMQ) também foi desenvolvido empregando LPME na preparação das amostras. A extração destes analitos foi realizada em duas etapas para eficaz recuperação dos mesmos (valores entre 35-38%). Os analitos foram separados na coluna Chirobiotic T em fase polarorgânica, com detecção por absorção no ultravioleta em 285 nm. O método apresentou linearidade no intervalo de 50-1500 e 50-3000 ng mL-1 para os enantiômeros de MQ e CMQ, respectivamente. A disposição cinética de MQ em ratos indica enantiosseletividade com maiores concentrações de (+)-(RS)- MQ após administração do fármaco na forma racêmica. A separação cromatográfica em fase reversa de ART e metabólito diidroartemisinina (DHA) foi alcançada utilizando-se coluna contendo Si-Zr-PMTDS como fase estacionária e a detecção destes analitos foi realizada empregando-se MS no modo ESI positivo. O procedimento otimizado de LPME em duas fases para extração de ART e DHA em plasma resultou em valores de recuperação de 32 e 25%, respectivamente. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 5- 1000 ng mL-1 para ambos os analitos. O estudo piloto de disposição cinética em ratos evidenciou maiores concentrações de DHA. Os resultados obtidos confirmam a viabilidade da LPME para extração destes antimaláricos e respectivos metabólitos em plasma. / Currently, malaria is the main parasitic infection and shows worldwide distribution. Among therapeutic options used, chloroquine (CQ), mefloquine (MQ) and, more recently, artemether (ART) have been standing out. According to the literature, pharmacokinetic studies of these drugs have been hampered by the lack of proper methods of analysis in biological fluids and, regarding the chiral drugs (CQ and MQ), with the ability to determine the individual enantiomers. Therefore, the aim of this work was to evaluate the utilization of liquid-phase microextraction as the sample preparation technique for the determination of these antimalarial drugs and their metabolites in plasma. The enantioselective analysis of CQ and its metabolites was carried out using LPME as technique of sample preparation, which yielded recovery rates within 28- 66%. These analytes were resolved on a Chirobiotic V column in the polarorganic mode and further detected using mass spectrometry (MS) with electrospray interface (ESI) in the positive mode. The developed method was linear in the range of 5-500 ng mL-1 for all analytes studied. The kinetic disposition of CQ and its main metabolite monodesethylchloroquine (DCQ) in rats suggests enantioselectivity following the administration of the racemic drug, with higher concentrations of (+)-(S)-CQ and (-)-(R)-DCQ. The method for the analysis of the enantiomers of MQ and its achiral metabolite carboxymefloquine (CMQ) also had LPME as technique of sample preparation. The extraction of these analytes was carried out in two-steps to obtain efficient recovery rates (values within 35-38%). The analytes were resolved on a Chirobiotic T column in polar-organic mode and ultraviolet detection was performed at 285 nm. The method was linear in the range of 50-1500 and 50-3000 ng mL-1 for the enantiomers of MQ and CMQ, respectively. The kinetic disposition of MQ in rats indicates enantioselectivity with higher concentrations of (+)-(RS)-MQ following the administration of the racemic drug. The chromatographic resolution of ART and its metabolite dihydroartemisinin (DHA) in the reversed mode was achieved utilizing a column containing Si-Zr-PMTDS as stationary phase and their detection was conducted employing MS in the positive ESI mode. The optimized two-phase LPME procedure for the extraction of ART and DHA from plasma showed recovery values of 32 and 25%, respectively. The developed method was linear over the range of 5-1000 ng mL-1 for both analytes. The pilot study of kinetic disposition in rats showed higher concentrations of DHA. The obtained results confirm the feasibility of LPME for the extraction of these antimalarial drugs and their metabolites from plasma.

Atualmente, a malária é considerada a principal infecção parasitária existente e apresenta distribuição mundial. Dentre as alternativas terapêuticas utilizadas, destacam-se cloroquina (CQ), mefloquina (MQ) e, recentemente, arteméter (ART). Segundo a literatura, estudos farmacocinéticos destes fármacos têm sido dificultados pela ausência de métodos adequados de análise em fluidos biológicos e, no caso dos fármacos quirais (CQ e MQ), com capacidade de determinar os enantiômeros individualmente. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar o emprego da microextração em fase líquida (LPME) na preparação de amostras para a determinação destes três fármacos antimaláricos e respectivos metabólitos em plasma. O método para análise enantiosseletiva de CQ e metabólitos teve a LPME como técnica de preparação de amostras, a qual apresentou valores de recuperação no intervalo de 28-66%. Estes analitos foram separados na coluna Chirobiotic V em fase polar-orgânica, com posterior detecção por espectrometria de massas (MS), com interface de eletronebulização (ESI) no modo positivo. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 5-500 ng mL-1 para todos os analitos avaliados. A disposição cinética de CQ e do principal metabólito monodesetilcloroquina (DCQ) em ratos sugere enantiosseletividade após administração do fármaco na forma racêmica, com maiores concentrações de (+)-(S)-CQ e (-)-(R)-DCQ. O método para análise dos enantiômeros de MQ e do metabólito aquiral carboximefloquina (CMQ) também foi desenvolvido empregando LPME na preparação das amostras. A extração destes analitos foi realizada em duas etapas para eficaz recuperação dos mesmos (valores entre 35-38%). Os analitos foram separados na coluna Chirobiotic T em fase polarorgânica, com detecção por absorção no ultravioleta em 285 nm. O método apresentou linearidade no intervalo de 50-1500 e 50-3000 ng mL-1 para os enantiômeros de MQ e CMQ, respectivamente. A disposição cinética de MQ em ratos indica enantiosseletividade com maiores concentrações de (+)-(RS)- MQ após administração do fármaco na forma racêmica. A separação cromatográfica em fase reversa de ART e metabólito diidroartemisinina (DHA) foi alcançada utilizando-se coluna contendo Si-Zr-PMTDS como fase estacionária e a detecção destes analitos foi realizada empregando-se MS no modo ESI positivo. O procedimento otimizado de LPME em duas fases para extração de ART e DHA em plasma resultou em valores de recuperação de 32 e 25%, respectivamente. O método desenvolvido foi linear no intervalo de 5- 1000 ng mL-1 para ambos os analitos. O estudo piloto de disposição cinética em ratos evidenciou maiores concentrações de DHA. Os resultados obtidos confirmam a viabilidade da LPME para extração destes antimaláricos e respectivos metabólitos em plasma. / Currently, malaria is the main parasitic infection and shows worldwide distribution. Among therapeutic options used, chloroquine (CQ), mefloquine (MQ) and, more recently, artemether (ART) have been standing out. According to the literature, pharmacokinetic studies of these drugs have been hampered by the lack of proper methods of analysis in biological fluids and, regarding the chiral drugs (CQ and MQ), with the ability to determine the individual enantiomers. Therefore, the aim of this work was to evaluate the utilization of liquid-phase microextraction as the sample preparation technique for the determination of these antimalarial drugs and their metabolites in plasma. The enantioselective analysis of CQ and its metabolites was carried out using LPME as technique of sample preparation, which yielded recovery rates within 28- 66%. These analytes were resolved on a Chirobiotic V column in the polarorganic mode and further detected using mass spectrometry (MS) with electrospray interface (ESI) in the positive mode. The developed method was linear in the range of 5-500 ng mL-1 for all analytes studied. The kinetic disposition of CQ and its main metabolite monodesethylchloroquine (DCQ) in rats suggests enantioselectivity following the administration of the racemic drug, with higher concentrations of (+)-(S)-CQ and (-)-(R)-DCQ. The method for the analysis of the enantiomers of MQ and its achiral metabolite carboxymefloquine (CMQ) also had LPME as technique of sample preparation. The extraction of these analytes was carried out in two-steps to obtain efficient recovery rates (values within 35-38%). The analytes were resolved on a Chirobiotic T column in polar-organic mode and ultraviolet detection was performed at 285 nm. The method was linear in the range of 50-1500 and 50-3000 ng mL-1 for the enantiomers of MQ and CMQ, respectively. The kinetic disposition of MQ in rats indicates enantioselectivity with higher concentrations of (+)-(RS)-MQ following the administration of the racemic drug. The chromatographic resolution of ART and its metabolite dihydroartemisinin (DHA) in the reversed mode was achieved utilizing a column containing Si-Zr-PMTDS as stationary phase and their detection was conducted employing MS in the positive ESI mode. The optimized two-phase LPME procedure for the extraction of ART and DHA from plasma showed recovery values of 32 and 25%, respectively. The developed method was linear over the range of 5-1000 ng mL-1 for both analytes. The pilot study of kinetic disposition in rats showed higher concentrations of DHA. The obtained results confirm the feasibility of LPME for the extraction of these antimalarial drugs and their metabolites from plasma.

A new solid phase microextraction system composed of nanotubes coating fixed on a stainless steel support is suggested. Thermal stability and selectivity of the system was examined. It was determined that the system can be used for direct and headspace extraction of volatile aromatic hydrocarbons. Possibilities of four liquid phase microextraction techniques – hollow fibre liquid phase microextraction, liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop, dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction – for the extraction of volatile aromatic hydrocarbons were investigated. Extraction conditions of the investigated methods were optimized and the main analytical characteristics were determined. For all the methods detection limits and repeatability of the results are close. An exception is dispersive liquid-liquid microextraction with slightly higher detection limits. An extraction is especially fast using dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction. The most time-consuming method is liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop. All the methods are suitable for clean sample extraction. For the extraction from complex matrices the most suitable methods are headspace solid phase microextraction and hollow fibre liquid phase microextraction. The prepared microextraction techniques were applied for water and snow... [to full text] / Pasiūlyta nauja kietafazės mikroekstrakcijos sistema, kurioje nerūdijančio plieno strypelis dengtas anglies nanovamzdeliais, ištirtas jos terminis stabilumas ir atrankumas, nustatyta, kad sistema tinka lakių aromatinių angliavandenilių ekstrakcijai iš tirpalo ir iš viršerdvės. Ištirtos keturių skysčių-skysčių mikroekstrakcijos metodų - skysčių-skysčių mikroekstrakcijos kapiliare, mikroekstrakcijos užšaldomu tirpiklio lašu, dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos ir dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos užšaldant ekstraktą - galimybės ekstrahuoti lakius aromatinius angliavandenilius. Optimizuotos tirtų metodų ekstrakcijos sąlygos, nustatytos pagrindinės analizinės charakteristikos. Visų metodų rezultatų pasikartojamumas ir aptikimo ribos artimi. Išimtis – dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija, kuria gautos kiek didesnės aptikimo ribos. Greičiausi ekstrakcijos metodai - dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija ir dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija užšaldant ekstraktą, ilgiausiai trunka mikroekstrakcija užšaldomu tirpiklio lašu. Švarių mėginių ekstrakcijai tinka visi tirti metodai, užterštiems mėginiams geriau tinka kietafazė mikroekstrakcija iš viršerdvės arba skysčių-skysčių mikroekstrakcija kapiliare. Paruoštos lakių aromatinių angliavandenilių mikroekstrakcijos metodikos pritaikytos vandens ir sniego mėginių analizei.

Os benzodiazepínicos (BDZ) são amplamente utilizados no tratamento da ansiedade. Aumentam a neurotransmissão GABAérgica por ação em sítios receptores específicos para BDZ presentes no complexo ionóforo no canal do receptor GABAA, onde modulam alostericamente suas atividades. Porém, além de atuar nesses receptores, têm sido relatado, também, a existência de receptores periféricos para benzodiazepínicos (PBR). Evidências sugestivas de uma ação imunomodulatória direta para os BZD emergem de estudos que demonstraram a presença de PBR em células imunes/inflamatórias. Este trabalho avaliou os efeitos da administração de diazepam sobre parâmetros imunológicos de ratos e desenvolveu um método para dosagem plasmática desse benzodiazepínico utilizando a técnica de microextração em fase líquida. Foram realizados tratamentos agudo e prolongado (21 dias) com as doses de 1 e 10 mg/kg. Os resultados mostraram que a dose de 1 mg/kg não alterou qualquer um dos parâmetros imunes analisados; porém, diminuiu a quantidade de hemoglobina e de hemácias, assim como o valor de hematócrito, quando administrado prolongadamente. Entretanto, a dose de 10 mg/kg, após ambos os tratamentos, foi capaz de diminuir as células apoptóticas e, conseqüentemente, de aumentar a porcentagem de células viáveis, aumentar a porcentagem de células Thelper e Tcitotóxicas, diminuir a porcentagem de células B e aumentar os níveis séricos de corticosterona. Além destes, observou-se, também, um aumento do número de reticulócitos e um aumento do número das células segmentadas no sangue periférico, após administração prolongada do diazepam, assim como um aumento do número de células segmentadas no baço, após administração aguda. A menor dose de diazepam (1 mg/kg) também não foi capaz de induzir tolerância, diferente da maior dose (10 mg/kg), que levou ao desenvolvimento de tolerância funcional. Esses resultados sugerem que a administração de diazepam em baixas doses (< 1mg/kg) não interfira com os parâmetros imunes analisados. Entretanto, o uso de diazepam em doses mais elevadas (> 10 mg/kg) é capaz de alterar tais parâmetros. Muito provavelmente esses efeitos tenham a ver com o número de receptores PBR presentes nas células imunes avaliadas e/ou com a dose de diazepam administrada. Com relação ao método analítico, encontrou-se linearidade na faixa de interesse (intervalo dinâmico de 25 a 2000 ng/mL) para o diazepam e o desmetildiazepam. Os limites de detecção e quantificação foram de 20 e 25 ng/mL, respectivamente, e os parâmetros analisados mostraram-se satisfatórios. Desta forma, o método desenvolvido utilizando a técnica de microextração em fase líquida mostrou-se prático, de baixo custo e com grande potencial para extração prévia à injeção no CG. / Benzodiazepines (BZD) are widely used for the treatment of anxiety. They enhance GABA-ergic neurotransmission through binding on specific BDZ recognition sites, within the GABAA receptor-ion channel complex, where they allosterically modulate its activity. However, recents studies showed that BZD also act on peripheral benzodiazepine receptor sites (PBR). Evidence for a direct immunomodulatory action for BZD emerged from studies that demonstrated the presence of PBR on immune/inflammatory cells. The present experiment was designed to analyze the effects of diazepam on rat immune parameters and to develop a method to detect diazepam on rat plasma through a liquid-phase microextraction technique (LPME). The effects of both acute and long-term (21 days) diazepam (1 and 10 mg/kg/day) administrations were evaluated. Results showed that diazepam (1 mg/kg) treatment did not change the immune parameters analyzed; however, long-term diazepam treatment decreased erytrocytes, hemoglobin and hematocrit values. Both diazepam (10mg/kg) acute and long-term treatments decreased the number of apoptotic cells and, consequently, enhanced the percentage of viable cells; they also increased the percentage of Thelper and Tcitotoxic cells; decreased the percentage of B cells and increased the corticosterone serum levels. Long-term diazepam (10 mg/kg) treatment enhanced reticulocytes and segmented cells in the peripheric blood; however, only acute diazepam (10mg/kg) treatment increased the number of segmented cells on spleen. The low dose of diazepam used (1 mg/kg) was unable to induce tolerance, differently of that found after the high dose of diazepam (10 mg/kg). This latter treatment indicated the development of functional tolerance, at least for diazepam effects on corticosterone serum levels. These results suggested that low doses of diazepam (< 1 mg/kg) were not able to change the immune parameters analyzed; however, high doses of diazepam (> 10 mg/kg) changed many of these immune parameters. It is possible that the observed effects were related to the number of PBR receptor sites present on immune cells and/or to the levels of serum diazepam after the treatments used. The analytical method provided to be linear in the interest range (dynamic range from 25 to 2000 ng/mL) for diazepam and its main metabolite, desmethyldiazepam. The limits of detection and quantification were 20 and 25 ng/mL, respectively, and the parameters analyzed provided to be satisfactory. Finally, the method developed utilizing the liquid-phase microextraction technique showed to be practical, with low costs and thus presenting potential to be used previously to the extraction procedures, i.e., prior to the injection into the gas-chromatography apparatus.

Os benzodiazepínicos (BDZ) são amplamente utilizados no tratamento da ansiedade. Aumentam a neurotransmissão GABAérgica por ação em sítios receptores específicos para BDZ presentes no complexo ionóforo no canal do receptor GABAA, onde modulam alostericamente suas atividades. Porém, além de atuar nesses receptores, têm sido relatado, também, a existência de receptores periféricos para benzodiazepínicos (PBR). Evidências sugestivas de uma ação imunomodulatória direta para os BZD emergem de estudos que demonstraram a presença de PBR em células imunes/inflamatórias. Este trabalho avaliou os efeitos da administração de diazepam sobre parâmetros imunológicos de ratos e desenvolveu um método para dosagem plasmática desse benzodiazepínico utilizando a técnica de microextração em fase líquida. Foram realizados tratamentos agudo e prolongado (21 dias) com as doses de 1 e 10 mg/kg. Os resultados mostraram que a dose de 1 mg/kg não alterou qualquer um dos parâmetros imunes analisados; porém, diminuiu a quantidade de hemoglobina e de hemácias, assim como o valor de hematócrito, quando administrado prolongadamente. Entretanto, a dose de 10 mg/kg, após ambos os tratamentos, foi capaz de diminuir as células apoptóticas e, conseqüentemente, de aumentar a porcentagem de células viáveis, aumentar a porcentagem de células Thelper e Tcitotóxicas, diminuir a porcentagem de células B e aumentar os níveis séricos de corticosterona. Além destes, observou-se, também, um aumento do número de reticulócitos e um aumento do número das células segmentadas no sangue periférico, após administração prolongada do diazepam, assim como um aumento do número de células segmentadas no baço, após administração aguda. A menor dose de diazepam (1 mg/kg) também não foi capaz de induzir tolerância, diferente da maior dose (10 mg/kg), que levou ao desenvolvimento de tolerância funcional. Esses resultados sugerem que a administração de diazepam em baixas doses (< 1mg/kg) não interfira com os parâmetros imunes analisados. Entretanto, o uso de diazepam em doses mais elevadas (> 10 mg/kg) é capaz de alterar tais parâmetros. Muito provavelmente esses efeitos tenham a ver com o número de receptores PBR presentes nas células imunes avaliadas e/ou com a dose de diazepam administrada. Com relação ao método analítico, encontrou-se linearidade na faixa de interesse (intervalo dinâmico de 25 a 2000 ng/mL) para o diazepam e o desmetildiazepam. Os limites de detecção e quantificação foram de 20 e 25 ng/mL, respectivamente, e os parâmetros analisados mostraram-se satisfatórios. Desta forma, o método desenvolvido utilizando a técnica de microextração em fase líquida mostrou-se prático, de baixo custo e com grande potencial para extração prévia à injeção no CG. / Benzodiazepines (BZD) are widely used for the treatment of anxiety. They enhance GABA-ergic neurotransmission through binding on specific BDZ recognition sites, within the GABAA receptor-ion channel complex, where they allosterically modulate its activity. However, recents studies showed that BZD also act on peripheral benzodiazepine receptor sites (PBR). Evidence for a direct immunomodulatory action for BZD emerged from studies that demonstrated the presence of PBR on immune/inflammatory cells. The present experiment was designed to analyze the effects of diazepam on rat immune parameters and to develop a method to detect diazepam on rat plasma through a liquid-phase microextraction technique (LPME). The effects of both acute and long-term (21 days) diazepam (1 and 10 mg/kg/day) administrations were evaluated. Results showed that diazepam (1 mg/kg) treatment did not change the immune parameters analyzed; however, long-term diazepam treatment decreased erytrocytes, hemoglobin and hematocrit values. Both diazepam (10mg/kg) acute and long-term treatments decreased the number of apoptotic cells and, consequently, enhanced the percentage of viable cells; they also increased the percentage of Thelper and Tcitotoxic cells; decreased the percentage of B cells and increased the corticosterone serum levels. Long-term diazepam (10 mg/kg) treatment enhanced reticulocytes and segmented cells in the peripheric blood; however, only acute diazepam (10mg/kg) treatment increased the number of segmented cells on spleen. The low dose of diazepam used (1 mg/kg) was unable to induce tolerance, differently of that found after the high dose of diazepam (10 mg/kg). This latter treatment indicated the development of functional tolerance, at least for diazepam effects on corticosterone serum levels. These results suggested that low doses of diazepam (< 1 mg/kg) were not able to change the immune parameters analyzed; however, high doses of diazepam (> 10 mg/kg) changed many of these immune parameters. It is possible that the observed effects were related to the number of PBR receptor sites present on immune cells and/or to the levels of serum diazepam after the treatments used. The analytical method provided to be linear in the interest range (dynamic range from 25 to 2000 ng/mL) for diazepam and its main metabolite, desmethyldiazepam. The limits of detection and quantification were 20 and 25 ng/mL, respectively, and the parameters analyzed provided to be satisfactory. Finally, the method developed utilizing the liquid-phase microextraction technique showed to be practical, with low costs and thus presenting potential to be used previously to the extraction procedures, i.e., prior to the injection into the gas-chromatography apparatus.

A microextração em fase líquida com membranas cilíndricas ocas (HF-LPME) é uma técnica bastante interessante de preparação de amostras, uma vez que com pequenas quantidades de solventes orgânicos é possível a extração dos analitos presentes em matrizes complexas. Sendo assim, essa técnica foi empregada para extração da venlafaxina (VEN) e seus metabólitos em fração microssomal de fígado de ratos e plasma, visando o desenvolvimento de métodos para análise enantiosseletiva desses analitos. Esses métodos foram então empregados em um estudo in vitro de biotransformação da VEN e em um estudo piloto de disposição cinética em ratos e humanos. A VEN é um fármaco quiral empregado no tratamento da depressão, cujas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas são estereosseletivas. Após a otimização das condições de extração por HF-LPME, foram obtidas recuperações de 12-60%. O método empregado no estudo in vitro de biotransformação da VEN foi desenvolvido usando a coluna ChiralpaK AD®, fase móvel composta por hexano : 2-propanol (95:5, v/v) + 0,025% de dietilamina (DEA) e detecção por absorção no UV. A coluna ChiralpaK AD-H® e a fase móvel composta por metanol : etanol (70:30, v/v) + 0,025% de DEA foram empregadas para análise da VEN e seus metabólitos em plasma. Para esse método, empregou-se a detecção por espectrometria de massas visando à obtenção de menores limites de quantificação. O método empregado para a determinação da VEN e de seus metabólitos em fração microssomal de fígado de ratos foi linear no intervalo de 200 a 5000 ng mL-1 e o método empregado para a determinação da VEN e de seus metabólitos em amostras de plasma foi linear no intervalo de 5 a 500 ng mL-1. Os métodos analíticos desenvolvidos para determinação da VEN e seus metabólitos nas matrizes biológicas foram aplicados em estudos de biotransformação in vitro e em estudos de disposição cinética em duas espécies (ratos e humanos). O objetivo destes estudos foi avaliar a correlação da biotransformação entre as diferentes espécies avaliadas e comparar os resultados obtidos nos estudos in vitro com os verificados nos estudos in vivo. Os resultados dos estudos empregando fração microssomal de fígado de ratos são semelhantes aos obtidos no estudo de disposição cinética em ratos, com formação mais pronunciada da Ndesmetilvenlafaxina (N-VEN) e com produção prioritária do enantiômero (-)-(R). Comparando-se os estudos de disposição cinética em ratos e humanos, observa-se enantiosseletividade na biotransformação da VEN com a (-)-(R)-VEN sendo preferencialmente biotransformada. Entretanto, em humanos observa-se que a (-)- (R)-O-desmetilvenlafaxina ((-)-(R)-O-VEN) é formada em maior proporção enquanto que, em ratos, a (-)-(R)-N-VEN é preferencialmente formada. / Hollow Fiber-Liquid Phase Microextraction (HF-LPME) is a very interesting technique for sample preparation, since it uses small amounts of organic solvents to extract drugs present in complex matrices. Thus, this technique was employed for the extraction of venlafaxine (VEN) and its metabolites from rat liver microsomal fraction and plasma, aiming the development of methods for the enantioselective analysis of these analytes. These methods were then applied to study the in vitro biotransformation and the kinetic disposition of VEN in rats and humans. VEN is a chiral drug used in the treatment of depression, whose pharmacokinetic and pharmacodynamic properties are stereoselective. After the optimization of the HFLPME conditions, recoveries of 12-60% were obtained. The method employed in the in vitro biotransformation study of VEN was developed using a ChiralpaK AD® column, mobile phase consisting of hexane : 2-propanol (95:5, v/v) + 0.025% of diethylamine (DEA) and UV detection. The ChiralpaK AD-H® column and the mobile phase consisting of methanol : ethanol (70:30, v/v) + 0.025% of DEA were employed for the analysis of VEN and its metabolites in plasma. In order to obtain lower quantification limits, mass spectrometry detection was used in this method. The method used for the determination of VEN and its metabolites in rat liver microsomal fraction was linear over the concentration range of 200 to 5000 ng mL-1 whereas the method used for the determination of VEN and its metabolites in plasma was linear in the range of 5 to 500 ng mL-1. The developed methods for the determination of VEN in biological matrices were applied to an in vitro biotransformation study and to kinetic disposition studies in two species (rats and humans). The objective of these studies was to evaluate the correlation of the biotransformation between different species and to compare the results of the in vitro and in vivo studies. The results obtained using rat liver microsomal fraction were similar to those obtained in the rat kinetic disposition study, with more pronounced formation of N-desmethylvenlafaxine (NVEN) and major production of the (-)-(R) enantiomer. Comparing the kinetic disposition studies in rats and humans, the enantioselectivity in the biotransformation of VEN with (-)-(R)-VEN being preferentially biotransformed was observed for both species. However, (-)-(R)-O-desmethylvenlafaxine ((-)-(R)-O-VEN) is preferentially formed in humans whereas the major metabolite in rat plasma is (-)-(R)-N-VEN.

Pasiūlyta nauja kietafazės mikroekstrakcijos sistema, kurioje nerūdijančio plieno strypelis dengtas anglies nanovamzdeliais, ištirtas jos terminis stabilumas ir atrankumas, nustatyta, kad sistema tinka lakių aromatinių angliavandenilių ekstrakcijai iš tirpalo ir iš viršerdvės. Ištirtos keturių skysčių-skysčių mikroekstrakcijos metodų - skysčių-skysčių mikroekstrakcijos kapiliare, mikroekstrakcijos užšaldomu tirpiklio lašu, dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos ir dispersinės skysčių-skysčių mikroekstrakcijos užšaldant ekstraktą - galimybės ekstrahuoti lakius aromatinius angliavandenilius. Optimizuotos tirtų metodų ekstrakcijos sąlygos, nustatytos pagrindinės analizinės charakteristikos. Visų metodų rezultatų pasikartojamumas ir aptikimo ribos artimi. Išimtis – dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija, kuria gautos kiek didesnės aptikimo ribos. Greičiausi ekstrakcijos metodai - dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija ir dispersinė skysčių-skysčių mikroekstrakcija užšaldant ekstraktą, ilgiausiai trunka mikroekstrakcija užšaldomu tirpiklio lašu. Švarių mėginių ekstrakcijai tinka visi tirti metodai, užterštiems mėginiams geriau tinka kietafazė mikroekstrakcija iš viršerdvės arba skysčių-skysčių mikroekstrakcija kapiliare. Paruoštos lakių aromatinių angliavandenilių mikroekstrakcijos metodikos pritaikytos vandens ir sniego mėginių analizei. / A new solid phase microextraction system composed of nanotubes coating fixed on a stainless steel support is suggested. Thermal stability and selectivity of the system was examined. It was determined that the system can be used for direct and headspace extraction of volatile aromatic hydrocarbons. Possibilities of four liquid phase microextraction techniques – hollow fibre liquid phase microextraction, liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop, dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction – for the extraction of volatile aromatic hydrocarbons were investigated. Extraction conditions of the investigated methods were optimized and the main analytical characteristics were determined. For all the methods detection limits and repeatability of the results are close. An exception is dispersive liquid-liquid microextraction with slightly higher detection limits. An extraction is especially fast using dispersive liquid-liquid microextraction and dispersion-solidification liquid-liquid microextraction. The most time-consuming method is liquid phase microextraction based on the solidification of a floating drop. All the methods are suitable for clean sample extraction. For the extraction from complex matrices the most suitable methods are headspace solid phase microextraction and hollow fibre liquid phase microextraction. The prepared microextraction techniques were applied for water and snow... [to full text]

A microextração em fase líquida com membranas cilíndricas ocas (HF-LPME) é uma técnica bastante interessante de preparação de amostras, uma vez que com pequenas quantidades de solventes orgânicos é possível a extração dos analitos presentes em matrizes complexas. Sendo assim, essa técnica foi empregada para extração da venlafaxina (VEN) e seus metabólitos em fração microssomal de fígado de ratos e plasma, visando o desenvolvimento de métodos para análise enantiosseletiva desses analitos. Esses métodos foram então empregados em um estudo in vitro de biotransformação da VEN e em um estudo piloto de disposição cinética em ratos e humanos. A VEN é um fármaco quiral empregado no tratamento da depressão, cujas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas são estereosseletivas. Após a otimização das condições de extração por HF-LPME, foram obtidas recuperações de 12-60%. O método empregado no estudo in vitro de biotransformação da VEN foi desenvolvido usando a coluna ChiralpaK AD®, fase móvel composta por hexano : 2-propanol (95:5, v/v) + 0,025% de dietilamina (DEA) e detecção por absorção no UV. A coluna ChiralpaK AD-H® e a fase móvel composta por metanol : etanol (70:30, v/v) + 0,025% de DEA foram empregadas para análise da VEN e seus metabólitos em plasma. Para esse método, empregou-se a detecção por espectrometria de massas visando à obtenção de menores limites de quantificação. O método empregado para a determinação da VEN e de seus metabólitos em fração microssomal de fígado de ratos foi linear no intervalo de 200 a 5000 ng mL-1 e o método empregado para a determinação da VEN e de seus metabólitos em amostras de plasma foi linear no intervalo de 5 a 500 ng mL-1. Os métodos analíticos desenvolvidos para determinação da VEN e seus metabólitos nas matrizes biológicas foram aplicados em estudos de biotransformação in vitro e em estudos de disposição cinética em duas espécies (ratos e humanos). O objetivo destes estudos foi avaliar a correlação da biotransformação entre as diferentes espécies avaliadas e comparar os resultados obtidos nos estudos in vitro com os verificados nos estudos in vivo. Os resultados dos estudos empregando fração microssomal de fígado de ratos são semelhantes aos obtidos no estudo de disposição cinética em ratos, com formação mais pronunciada da Ndesmetilvenlafaxina (N-VEN) e com produção prioritária do enantiômero (-)-(R). Comparando-se os estudos de disposição cinética em ratos e humanos, observa-se enantiosseletividade na biotransformação da VEN com a (-)-(R)-VEN sendo preferencialmente biotransformada. Entretanto, em humanos observa-se que a (-)- (R)-O-desmetilvenlafaxina ((-)-(R)-O-VEN) é formada em maior proporção enquanto que, em ratos, a (-)-(R)-N-VEN é preferencialmente formada. / Hollow Fiber-Liquid Phase Microextraction (HF-LPME) is a very interesting technique for sample preparation, since it uses small amounts of organic solvents to extract drugs present in complex matrices. Thus, this technique was employed for the extraction of venlafaxine (VEN) and its metabolites from rat liver microsomal fraction and plasma, aiming the development of methods for the enantioselective analysis of these analytes. These methods were then applied to study the in vitro biotransformation and the kinetic disposition of VEN in rats and humans. VEN is a chiral drug used in the treatment of depression, whose pharmacokinetic and pharmacodynamic properties are stereoselective. After the optimization of the HFLPME conditions, recoveries of 12-60% were obtained. The method employed in the in vitro biotransformation study of VEN was developed using a ChiralpaK AD® column, mobile phase consisting of hexane : 2-propanol (95:5, v/v) + 0.025% of diethylamine (DEA) and UV detection. The ChiralpaK AD-H® column and the mobile phase consisting of methanol : ethanol (70:30, v/v) + 0.025% of DEA were employed for the analysis of VEN and its metabolites in plasma. In order to obtain lower quantification limits, mass spectrometry detection was used in this method. The method used for the determination of VEN and its metabolites in rat liver microsomal fraction was linear over the concentration range of 200 to 5000 ng mL-1 whereas the method used for the determination of VEN and its metabolites in plasma was linear in the range of 5 to 500 ng mL-1. The developed methods for the determination of VEN in biological matrices were applied to an in vitro biotransformation study and to kinetic disposition studies in two species (rats and humans). The objective of these studies was to evaluate the correlation of the biotransformation between different species and to compare the results of the in vitro and in vivo studies. The results obtained using rat liver microsomal fraction were similar to those obtained in the rat kinetic disposition study, with more pronounced formation of N-desmethylvenlafaxine (NVEN) and major production of the (-)-(R) enantiomer. Comparing the kinetic disposition studies in rats and humans, the enantioselectivity in the biotransformation of VEN with (-)-(R)-VEN being preferentially biotransformed was observed for both species. However, (-)-(R)-O-desmethylvenlafaxine ((-)-(R)-O-VEN) is preferentially formed in humans whereas the major metabolite in rat plasma is (-)-(R)-N-VEN.

Estudos de metabolismo in vitro possuem o intuito de caracterizar e quantificar possíveis metabólitos, elucidar as vias metabólicas e sugerir modelos a serem seguidos para a realização de estudos in vivo. Com o intuito de estudar o metabolismo in vitro não estereosseletivo da rosiglitazona (RSG) empregando fração microssomal de fígado de ratos,foi desenvolvida uma metodologia por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção UV em 245 nm, para analisar a RSG e seus principais metabólitos, p-hidroxi rosiglitazona (?-OH-R) e N-desmetil rosiglitazona (N-Dm-R). Os analitos foram separados em fase reversa, utilizando uma coluna X-Terra MS C-18 (partículas de 3,5 ?m) e fase móvel composta por água:acetonitrila:ácido acético (85:15:0,5, v/v/v), na vazão de 1 mL min-1. Matrizes biológicas contém um grande excesso de proteínas, lipídeos e outros materiais endógenos que interferem na análise de fármacos e metabólitos, tornando necessário um procedimento adequado de preparação das amostras antes da análise cromatográfica. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca (HF-LPME) é uma técnica promissora para a preparação de amostras em estudos de metabolismo in vitro, pois, além de promover o clean-up, promove também o enriquecimento dos analitos na amostra. A HF-LPME foi aplicada pela primeira vez para a extração simultânea desse fármaco e seus metabólitos. O sistema de três fases foi escolhido como o mais apropriado, empregando uma solução de ácido clorídrico como fase aceptora e 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método foi validado e foi linear no intervalo de 50-6000 ng mL-1, apresentando limites de quantificação de 50 ng mL-1 e recuperações acima de 47 % para a RSG e seus metabólitos (?-OH-R e N-Dm-R). O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro com fração microssomal de fígado de ratos. Nesse estudo, foi possível estimar as constantes de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade inicial máxima (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R apresentaram valores de Vmax de 87,30 ± 8,04 e 51,64 ± 12,25 ?mol min-1 mg proteína-1, respectivamente, enquanto que os valores de Km foram de 58,14 ± 11,85 e 77,84 ± 36,77 mmol L-1, respectivamente. Outros metabólitos foram observados nos cromatogramas e a identificação foi feita por espectrometria de massas: ?rto-hidroxi-rosiglitazona e N-desmetil-hidroxi-rosiglitazona. A RSG é comercializada como uma mistura racêmica, apesar de possuir sua atividade antidiabética relacionada essencialmente com o enantiômero (S). O centro quiral desse fármaco possui um grupo carbonila, por isso, o enantiômero (R) pode se converter no enantiômero (S) ou vice-versa, via tautomerismo cetoenólico. Dados da literatura indicavam que essa racemização poderia ser lenta o suficiente para possibilitar o estudo dos enantiômeros isoladamente. Entretanto, até o momento não há dados sobre a disposição cinética ii e metabolismo enantiosseletivos desse fármaco. Sendo assim, propôs-se o desenvolvimento de metodologias analíticas para estudar a racemização da RSG e seus metabólitos e avaliar a possibilidade de estudar seu metabolismo in vitro de forma estereosseletiva. O método foi desenvolvido empregando HPLC com detecção em 245 nm. A separação dos enantiômeros do fármaco e metabólitos, também quirais, foi obtida empregando uma coluna Chiralcel OJ-H e fase móvel constituída por metanol:etanol (90:10; v/v), na vazão de 0,3 mL min-1. O estudo de racemização mostrou que o fármaco e seus metabólitos são racemizados nas condições em que o estudo de metabolismo é conduzido. Finalmente, para estudar o metabolismo in vitro da pioglitazona (PGZ), foi desenvolvido um método para análise desse fármaco e de seus principais metabólitos, a hidroxi-pioglitazona (M-IV) e a ceto-pioglitazona (M-III) empregando a eletroforese capilar (CE). As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando tampão fosfato de sódio 50 mmol L-1, pH 2,5, detecção em 190 nm, tensão de 30 kV e temperatura do capilar de 35 °C. A HF-LPME também foi empregada para a preparação das amostras. O sistema de três fases foi escolhido, empregando solução de ácido clorídrico como fase aceptora e o 1-octanol como solvente orgânico. A otimização dos demais parâmetros foi realizada através de planejamento fatorial fracionário. O método validado foi linear no intervalo de 200 - 25000 ng mL-1 para PGZ e 200 - 2000 ng mL-1 para os metabólitos, apresentando limites de quantificação de 200 ng mL-1 e recuperações acima de 19 % para a RSG e seus metabólitos M-IV e M-III. O método validado foi empregado em um estudo de metabolismo in vitro contendo fração microssomal de fígado de ratos, mas nesse estudo, não foi possível observar a formação dos metabólitos. Entretanto, esse método pode ser usado em outros modelos de metabolismo in vitro (microssomas humanos), nos quais se observa a formação desses metabólitos em concentrações maiores. / In vitro metabolism studies have been used to characterize and to quantify possible metabolites, to elucidate metabolic pathways and to suggest models to perform in vivo studies. So the purpose of this study was to evaluate the in vitro rosiglitazone (RSG) metabolism employing microsomal fraction obtained from rat livers. A high- performance liquid chromatography (HPLC) method with UV detection at 245 nm was developed to analyze RSG and the main metabolites, p-hydroxy rosiglitazone (?-OH-R) e N-desmethyl rosiglitazone (N-Dm-R). The analytes were separated under reversed phase conditions, using a X-Terra MS C-18 column (3.5 ?m particle size) and a mobile phase consisting of water:acetonitrile:acetic acid (85:15:0.5, v/v/v), at a flow rate of 1 mL min-1. Biological matrices contain a large excess of proteins, lipids and other endogenous compounds that interfere in the analysis of drugs and metabolites. So, a suitable sample preparation technique is required. Hollow-fiber liquid phase microextraction (HF-LPME) is a promising technique for the preparation of biological samples. Besides the clean-up, analytes enrichment is also achieved. HF-LPME for the simultaneous analysis of RSG and its main metabolites is described for the first time. The three-phase extraction was performed using hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated and it was linear over the concentration range of 50-6000 ng mL-1, with quantification limits of 50 ng mL-1 and recoveries above 47 %. The validated method was used to estimate Michaelis-Menten (Km) constant and maximum initial velocity (Vmax). N-Dm-R e ?-OH-R showed Vmax values of 87.30 ± 8.04 and 51.64 ± 12.25 ?mol min-1 mg protein-1, respectively, while the Kmvalues were 58.14 ± 11.85 e 77.84 ± 36.77 mmol L-1, respectively. Other possible metabolites were observed in the chromatograms and they were identified by mass spectrometry: ?rtho-hydroxy-rosiglitazone e N-desmethyl-hydroxy-rosiglitazone. RSG is marketed as a racemic mixture although the antidiabetic activity is related essentially to the (S)-enantiomer. The chiral center has a carbonyl group, therefore the (R)-enantiomer could be transformed to the (S)-enantiomer or vice-versa by keto-enolic tautomerism. The literature indicates that this racemization is slow enough to allow the evaluation of the properties of the isolated enantiomers. However, there is no information in the literature about enantioselective RSG kinetic disposition and metabolism. Considering this facts, an analytical procedure was developed to study the racemization of RSG and its metabolites under different conditions and to determine if the enantioselective metabolism would be performed. The method was developed by HPLC with detection at 245 nm. The chiral separation of RSG and metabolites was achieved on a Chiralcel OJ-H column, with the mobile phase consisting of methanol:ethanol (90:10,v/v). The results obtained showed that the racemization occurs under the conditions used in in vitro iv metabolism studies. Finally, to study the in vitro metabolism of pioglitazone (PGZ), another method was developed by capillary electrophoresis (CE) to determine this drug and its main metabolites, hydroxy-pioglitazone (M-IV) and keto-pioglitazone (M-III). The analyses were conducted using a fused silica capillary (50 ?m inner diameter and 40 cm effective length), sodium phosphate buffer 50 mmol L-1, pH 2.5, detection at 190 nm, voltage of 30 kV and capillary temperature of 35°C. HF-LPME was also used for sample preparation with hydrochloride acid solution as acceptor phase and 1-octanol as organic solvent. The other parameters were optimized by fractional factorial design. The method was validated showing to be linear in the concentration range of 200 - 25000 ng mL-1 for PGZ and 200 - 2000 ng mL-1 for the metabolites. Quantification limits were 200 ng mL-1 for all analytes and the recoveries were higher than 19%. The validated method was used to study the in vitro metabolism of PGZ by rat liver microsomal fraction, but it was not possible to observe the formation of the metabolites in this study. However this method could be used in other in vitro metabolism models (human microssomes), in which higher concentrations of these metabolites are observed. Keywords:

As drogas facilitadoras de crime (DFC) são uma série de substâncias químicas que permitem o ato sexual e/ou roubo com pouca ou nenhuma resistência da vítima. Benzodiazepínicos, gama-hidroxibutirato (GHB), cetamina e etanol são clássicas DFC, porém outras substâncias também têm sido utilizadas. Devido às diferentes classes de DFC e a necessidade de métodos sensíveis, a determinação dessas substâncias é um desafio aos toxicologistas forenses. A proposta do estudo foi desenvolver métodos analíticos para determinação principais analitos alvos de DFC para benzodiazepínicos, cetamina e GHB em amostras de urina. Esta matriz biológica é considerada uma amostra não-invasiva e apresenta um período de detecção maior que o sangue. A preparação das amostras foi avaliada através de microextração em fase líquida (LPME) e extração líquido-líquido (LLE). A LPME é uma técnica de extração de drogas que utiliza menor quantidade de solventes orgânicos, maior praticidade e possibilidade de obtenção de altos valores de recuperação. Os analitos foram determinados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). A LPME validada para benzodiazepínicos e seus produtos de biotransformação exigiu uma combinação de solventes e dupla derivatização para atingir a sensibilidade exigida, enquanto o método para determinação de cetamina, norcetamina e deidronorcetamina utilizou óleo essencial de eucalipto como meio extrator, caracterizando-se um procedimento ecologicamente correto com alta sensibilidade. A extração de GHB foi efetiva por LLE com redução da quantidade de solvente e tempo de análise sem o prejuízo na sensibilidade. Em geral, os métodos desenvolvidos neste trabalho são sensíveis e confiáveis para todos os analitos relatados e conclui-se que a LPME é uma técnica de preparo de amostra eficiente, versátil de baixo custo. Estas condições permitem que sua implementação em qualquer laboratório de análises toxicológicas, podendo ser aplicada em situações de DFC ou de qualquer outra natureza. / Drug-facilitated crime (DFC) are a series of chemicals that allow the sexual act and/or theft with little or no resistance from the victim. Benzodiazepines, gamma-hydroxybutyrate (GHB) and ketamine and ethanol are considered classic DFC, however other substances were also used as the DFC. Due to the different classes of DFC and the need for sensitive methods, the determination of these substances is a challenge to forensic toxicologists. The purpose of this study was to develop analytical methods for determination of the main target analytes of DFC for benzodiazepines, ketamine and GHB in urine samples. This biological matrix is considered a non-invasive sample and shows a larger window of detection than blood. Sample preparation was assessed using liquid phase microextraction (LPME) and liquid-liquid extraction (LLE). The LPME is a drug extraction technique that uses less organic solvents, greater practicality and possibility of obtaining high recovery values. The analytes were determined by gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS). The validated LPME technique for benzodiazepines and their metabolites required a combination of solvents and double derivatization to achieve the required sensitivity, while the ketamine, norketamine and dehydronorketamine method used essential oil of eucalyptus as solvent, characterizing a green chemistry approach with high sensitivity. The extraction of GHB was effective by LLE with a reduced amount of solvent and the analysis time without loss in sensitivity. In general, the methods developed in this work using GC-MS are sensitive and reliable for all analytes reported and LPME technique showed to be an efficient sample preparation, versatile and low cost. These conditions allow LPME implementation in any laboratory of toxicological analysis and it can be applied in situations of DFC or any other kind of analysis.