Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos. / Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity.

Os benzodiazepínicos são amplamente utilizados devido às suas propriedades ansiolíticas e sedativas mediadas pelo complexo GABAA no Sistema Nervoso Central. Porém, posteriormente foi demonstrado que os mesmos também atuam no Receptor Periférico para Benzodiazepínico (PBR), conhecido atualmente como Proteína Translocadora (TSPO), expresso tanto em células normais como também em células tumorais. O presente trabalho avaliou os efeitos in vivo da administração de diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich em camundongos e o envolvimento da TSPO mediando este efeito. Mais especificamente, estudamos o crescimento tumoral, fases do ciclo e morte celular, assim como a produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) e a expressão de TSPO nas células tumorais, após o tratamento com diazepam, Ro5-4864 ou clonazepam (3,0 mg/kg, via oral, por 7 dias). Quantificou-se também os níveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico dos camundongos portadores do tumor. Finalmente, o sequenciamento parcial de Tspo das células do tumor de Ehrlich e a presença de receptores de estrógeno foram avaliadas. Os resultados mostraram que o tratamento in vivo com diazepam aumentou: (1) o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase G2-M, (2) a porcentagem de células positivas para anexina e PI, (3) a produção de EROs. No mesmo sentido, o tratamento in vivo com Ro5-4864: (4) Aumentou o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase S, (5) Não modificou a porcentagem de morte celular, (6) Aumentou a produção de EROs. Por outro lado, o tratamento in vivo com clonazepam não modificou: (7) quer o crescimento do tumor quer o ciclo celular, (8) a porcentagem de morte celular, (9) a produção de EROs. Além disso, o tratamento in vivo com diazepam não interferiu com a expressão de TSPO (western blot e citometria de fluxo) ou com os valores de Kd e Bmax de PK11195 (binding) presentes nas células do tumor de Ehrlich; entretanto, detectou-se a presença de polímeros, de alta porcentagem de células positivas para TSPO e uma alta afinidade de PK11195 por TSPO. Este mesmo tratamento resultou em níveis quantificáveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico de animais portadores do tumor de Ehrlich. Finalmente, o sequenciamento parcial da Tspo presente nas células tumorais revelou 3 mutações nos nucleotídeos, sendo 1 delas silenciosa. Desta forma, estes resultados sugerem que as ações in vivo do diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich ocorram de maneira dependente e direta na TSPO existente em células do tumor de Ehrlich. Essas ações parecem envolver um aumento da produção de EROs e não modificam a expressão de TSPO. Finalmente o padrão farmacológico e bioquímico de expressão de TSPO nas células do tumor de Ehrlich pode indicar um papel dos mesmos na patogênese do câncer. / Benzodiazepines are widely used due to their anxiolitic and sedative properties, acting on specific site coupled to GABAA complex in the Central Nervous System. However, benzodiazepines have been shown to have high affinity for Peripheral Benzodiazepine Receptor site (PBR), now renamed as Translocator Protein (TSPO), expressed in normal cells, and being up-regulated on cancer cells. The present study evaluated the diazepam in vivo effects on Ehrlich ascitic tumor growth in mice and also the TSPO role in mediating this effect. Specifically we evaluated the tumor growth, cell cycle and cell death, and also the Reactive Oxygen Species (ROS) production and TSPO expression on tumor cells after diazepam, Ro5-4864 or clonazepam treatments (3.0 mg/kg, per oral, during 7 days). Furthermore, diazepam levels on plasma and on ascitic fluid taken from Ehrlich ascitic tumor bearing mice were quantified. Finally, the parcial Tspo sequencing on Ehrlich cells and Estrogen Receptor detection was evaluated. Results showed that diazepam in vivo treatment increased: (1) Ehrlich tumor growth and percentage of cells on G2-M phase, (2) percentage of positive cells for both annexin and PI, (3) ROS production. In the same way, Ro5-4864 in vivo treatment: (4) increased Ehrlich tumor growth and percentage of cells on S phase, (5) did not change the percentage of cell death, (6) increased ROS production. On the other hand, clonazepam in vivo treatment did not modify: (7) both Ehrlich tumor growth and cell cycle, (8) the percentage of cell death, and, (9) ROS production. Moreover, the in vivo diazepam treatment did not interfere with TSPO expression (western blot and flow cytometry) or Kd and Bmax values for PK11195 (binding) detected on Ehrlich tumor cells; however, the presence of TSPO polymers, a high percentage of TSPO positive cells and a high PK11195 afinity were found on these cells. This same treatment resulted on diazepam levels that were quantified on plasma and ascitic fluid from Ehrlich tumor bearing mice. Finally, Tspo partial nucleotide sequencing reaveled three point mutations, one of them is silent. Taken together, these data suggest that diazepam in vivo effects on Ehrlich tumor growth are TSPO-dependent. These actions may involve an increase on ROS production and seems not to be related to modifications on TSPO expression on tumor cells. Finally, TSPO pharmacological and biochemical properties on Ehrlich tumor cells are similar to those described in other tumor cells and may indicate a possible role for this protein on cancer pathogenesis.

Os benzodiazepínicos são amplamente utilizados devido às suas propriedades ansiolíticas e sedativas mediadas pelo complexo GABAA no Sistema Nervoso Central. Porém, posteriormente foi demonstrado que os mesmos também atuam no Receptor Periférico para Benzodiazepínico (PBR), conhecido atualmente como Proteína Translocadora (TSPO), expresso tanto em células normais como também em células tumorais. O presente trabalho avaliou os efeitos in vivo da administração de diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich em camundongos e o envolvimento da TSPO mediando este efeito. Mais especificamente, estudamos o crescimento tumoral, fases do ciclo e morte celular, assim como a produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) e a expressão de TSPO nas células tumorais, após o tratamento com diazepam, Ro5-4864 ou clonazepam (3,0 mg/kg, via oral, por 7 dias). Quantificou-se também os níveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico dos camundongos portadores do tumor. Finalmente, o sequenciamento parcial de Tspo das células do tumor de Ehrlich e a presença de receptores de estrógeno foram avaliadas. Os resultados mostraram que o tratamento in vivo com diazepam aumentou: (1) o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase G2-M, (2) a porcentagem de células positivas para anexina e PI, (3) a produção de EROs. No mesmo sentido, o tratamento in vivo com Ro5-4864: (4) Aumentou o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich e a porcentagem de células em fase S, (5) Não modificou a porcentagem de morte celular, (6) Aumentou a produção de EROs. Por outro lado, o tratamento in vivo com clonazepam não modificou: (7) quer o crescimento do tumor quer o ciclo celular, (8) a porcentagem de morte celular, (9) a produção de EROs. Além disso, o tratamento in vivo com diazepam não interferiu com a expressão de TSPO (western blot e citometria de fluxo) ou com os valores de Kd e Bmax de PK11195 (binding) presentes nas células do tumor de Ehrlich; entretanto, detectou-se a presença de polímeros, de alta porcentagem de células positivas para TSPO e uma alta afinidade de PK11195 por TSPO. Este mesmo tratamento resultou em níveis quantificáveis de diazepam no plasma e no fluido ascítico de animais portadores do tumor de Ehrlich. Finalmente, o sequenciamento parcial da Tspo presente nas células tumorais revelou 3 mutações nos nucleotídeos, sendo 1 delas silenciosa. Desta forma, estes resultados sugerem que as ações in vivo do diazepam sobre o crescimento do tumor ascítico de Ehrlich ocorram de maneira dependente e direta na TSPO existente em células do tumor de Ehrlich. Essas ações parecem envolver um aumento da produção de EROs e não modificam a expressão de TSPO. Finalmente o padrão farmacológico e bioquímico de expressão de TSPO nas células do tumor de Ehrlich pode indicar um papel dos mesmos na patogênese do câncer. / Benzodiazepines are widely used due to their anxiolitic and sedative properties, acting on specific site coupled to GABAA complex in the Central Nervous System. However, benzodiazepines have been shown to have high affinity for Peripheral Benzodiazepine Receptor site (PBR), now renamed as Translocator Protein (TSPO), expressed in normal cells, and being up-regulated on cancer cells. The present study evaluated the diazepam in vivo effects on Ehrlich ascitic tumor growth in mice and also the TSPO role in mediating this effect. Specifically we evaluated the tumor growth, cell cycle and cell death, and also the Reactive Oxygen Species (ROS) production and TSPO expression on tumor cells after diazepam, Ro5-4864 or clonazepam treatments (3.0 mg/kg, per oral, during 7 days). Furthermore, diazepam levels on plasma and on ascitic fluid taken from Ehrlich ascitic tumor bearing mice were quantified. Finally, the parcial Tspo sequencing on Ehrlich cells and Estrogen Receptor detection was evaluated. Results showed that diazepam in vivo treatment increased: (1) Ehrlich tumor growth and percentage of cells on G2-M phase, (2) percentage of positive cells for both annexin and PI, (3) ROS production. In the same way, Ro5-4864 in vivo treatment: (4) increased Ehrlich tumor growth and percentage of cells on S phase, (5) did not change the percentage of cell death, (6) increased ROS production. On the other hand, clonazepam in vivo treatment did not modify: (7) both Ehrlich tumor growth and cell cycle, (8) the percentage of cell death, and, (9) ROS production. Moreover, the in vivo diazepam treatment did not interfere with TSPO expression (western blot and flow cytometry) or Kd and Bmax values for PK11195 (binding) detected on Ehrlich tumor cells; however, the presence of TSPO polymers, a high percentage of TSPO positive cells and a high PK11195 afinity were found on these cells. This same treatment resulted on diazepam levels that were quantified on plasma and ascitic fluid from Ehrlich tumor bearing mice. Finally, Tspo partial nucleotide sequencing reaveled three point mutations, one of them is silent. Taken together, these data suggest that diazepam in vivo effects on Ehrlich tumor growth are TSPO-dependent. These actions may involve an increase on ROS production and seems not to be related to modifications on TSPO expression on tumor cells. Finally, TSPO pharmacological and biochemical properties on Ehrlich tumor cells are similar to those described in other tumor cells and may indicate a possible role for this protein on cancer pathogenesis.

Benzodiazepínicos (BDZ) são fármacos ansiolíticos que se caracterizam por atuar em receptores GABAa presentes no sistema nervoso central. Além dos receptores centrais os BDZ também possuem afinidade por sítios ligantes periféricos presentes em vários tecidos, dentre eles nas glândulas adrenais e em células polimorfonucleares. O presente experimento analisou os efeitos de BDZ sobre a atividade de neutrófilos e sobre os níveis séricos de corticosterona de ratos. Especificamente, o burst e a fagocitose de neutrófilos foram estudados após o tratamento ex vivo e in vitro com diazepam, RO 5-4864, clonazepam e/ou PK 11195. Os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos também foram avaliados após o uso prolongado deste fármaco. Finalmente, os efeitos in vitro dos BDZ foram estudados após a incubação com um bloqueador do canal de cálcio (Ca2+) o L-verapamil. Os resultados mostraram que (1) o tratamento agudo ex vivo com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo e da fagocitose induzida por PMA, LPS e Staphylococcus aureus; (2) o tratamento prolongado (21 dias) com diazepam (10 mg/kg) produziu um aumento do burst oxidativo induzido pelos mesmos estímulos e reduziu a fagocitose dos neutrófilos (porcentagem e intensidade); (3) o tratamento agudo ex vivo com diazepam, mas não o prolongado, aumentou os níveis séricos de corticosterona; (4) os efeitos da adição in vitro de diazepam (100 nM) foram na mesma direção daqueles observados após o tratamento agudo; (5) o RO 5-4864 (100 nM) induziu in vitro efeitos similares aos obtidos ex vivo (10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com diazepam; (6) o tratamento ex vivo com clonazepam (10 mg/kg) diminuiu o burst oxidativo de neutrófilos induzido por PMA, LPS e Staphylococcus aureus enquanto que o tratamento com este fármaco na dose de 1 mg/kg aumentou o burst oxidativo destas células frente a todos os estímulos; (7) o tratamento ex vivo (1 e 10 mg/kg) e in vitro (100 nM) com clonazepam não alterou a fagocitose de neutrófilos; (8) os efeitos da adição in vitro de clonazepam sobre a atividade de neutrófilos vão na mesma direção daqueles observados após o tratamento ex vivo na dose de 1 mg/kg; (9) o clonazepam (1 e 10 mg/kg) aumentou os níveis séricos de corticosterona; (10) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) per se ou associado com diazepam (100 nM) ou RO 5-4864 (100 nM) aumentou o burst oxidativo e diminuiu a fagocitose realizada pelos neutrófilos; (11) a adição in vitro do PK 11195 (100 nM) associado com o clonazepam (100 nM) diminuiu o burst oxidativo induzido por PMA e diminuiu a fagocitose realizada por estas células; finalmente, (12) a pré incubação por 2 minutos com L-verapamil (100 nM) bloqueou todos os efeitos do diazepam sobre a atividade de neutrófilos estimulada por PMA, LPS e Staphylococcus aureus e reverteu os efeitos do RO 5-4864 no burst oxidativo induzido por PMA. Esses resultados sugeriram que os efeitos dos BDZ não estão relacionados com a ativação de PBR nas células da glândula adrenal e também que eles não estão relacionados a um aumento dos níveis séricos de corticosterona. Indicaram que os BDZ tenham produzido mudanças na concentração do Ca2+ intracelular dos neutrófilos através da ativação de PBR seguida de um aumento da permeabilidade da membrana plasmática ao Ca2+ através da abertura de canais sensíveis ao L-verapamil, permitindo a entrada do Ca2+. Os diferentes efeitos dos BDZ sobre o burst oxidativo e a fagocitose de neutrófilos foram atribuídos a ações específicas deste fármaco em subtipos de PBR presentes nos neutrófilos e nas membranas mitocondriais. Finalmente, os resultados sugeriram o desenvolvimento de tolerância aos efeitos do diazepam sobre os níveis séricos de corticosterona mas não sobre a atividade de neutrófilos. / Benzodiazepines (BDZ) exert their anxiolytic effects via specific binding sites coupled to neuronal GABAa receptors. They also affect a second, pharmacologically different type of receptor, which has been found in many sites such as blood polimorphonuclear cells and adrenals. The present experiment was designed to analyze the effects of BDZ on neutrophil activity and corticosterone serum levels in rats. Specifically, neutrophil oxidative burst and phagocytosis were studied after ex vivo and in vitro treatments with diazepam, Ro 5-4864, clonazepam and/or PK 11195. Diazepam effects on neutrophil activity were also taken after long-term treatment. Finally, in vitro effects of BDZ were studied after incubation with L-verapamil, a Ca2+ channel blocking agent. Results showed that (1) acute and ex vivo diazepam (10.0 mg/kg) treatment induced an increment on PMA, LPS and Staphylococcus aureus induced oxidative burst and phagocytosis (2) long-term (21 days, 10 mg/kg/day) diazepam treatment increased the oxidative burst induced by the same stimuli and reduced both intensity of phagocytosis and the percentage of neutrophil performing phagocytosis; (3) acute and ex vivo diazepam treatment, but not long-term diazepam treatment increased corticosterone serum levels; (4) the effects induced by in vitro addition of diazepam (100 nM) were in the same direction of those observed after acute treatment; (5) Ro 5-4864 (100 nM) induced similar effects to those of diazepam after ex vivo (10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) treatments; (6) ex vivo (10.0 mg/kg) clonazepam treatment decreased the neutrophil oxidative burst induced by PMA and S. aureus after a 1.0 mg/kg dose and decreased these parameters after a higher (10 mg/kg) dose; (7) ex vivo (1.0 and 10.0 mg/kg) and in vitro (100 nM) clonazepam treatments did not change neutrophil phagocytosis; (8) in vitro clonazepam (100 nM) induced effects on neutrophil activity that were in the same direction of those observed after the 1.0 mg/kg dose (9) clonazepam (1.0 and 10.0 mg/kg) increased corticosterone serum levels; (10) in vitro PK 11195 (100 nM) per se or associated with diazepam (100 nM) or Ro 5-4864 (100 nM) increased PMA, LPS and S. aureus induced neutrophil oxidative burst and decreased cell phagocytosis; (11) in vitro PK 11195 (100 nM) together with clonazepam (100 nM) decreased PMA-induced oxidative burst and decreased S. aureus phagocytosis; finally, (12) in vitro L-verapamil (100 nM) incubation for 2 minutes prevented all effects induced by diazepam on PMA, LPS and S. aureus -induced neutrophil activity and reverted the effects induced by Ro 5-4864 (100 nM) on PMA-induced oxidative burst. These results suggest that BDZ effects on neutrophil activity were not related to PBR activation within the adrenal gland cells, leading to increments on corticosterone serum levels. They suggest instead that BDZ induced [Ca2+]i changes in neutrophils through PBR activation followed by an increase in plasma membrane permeability due to L-verapamil sensitive Ca2+ channels and subsequent extracelular Ca2+ entry. The differences of BDZ effects on neutrophil oxidative burst and phagocytosis were attributed to specific actions on different PBR subtypes present on neutrophil and mitochondrial membranes. Finally, results suggest the development of tolerance to diazepam effects on corticosterone serum levels but not on neutrophil activity.

This thesis deals with photorealistic rendering and real-time global illumination. Thesis contains overview of algorithms used for real-time global illumination of which the Dynamic Diffuse Global Illumination with Ray-Traced Irradiance Fields was implemented. This algorithm uses hardware accelerated ray tracing to compute global illumination in a scene. Hardware ray tracing requires use of new generation of graphics API from which Vulkan was choosen for this thesis.

The effectiveness of algae to treat NO2and NO in simulated flue gas was tested using Chlorella vulgaris in photobioreactors (PBRs) using NOxconcentrations between 30 ppm to 780 ppm. NOxdissolved and reacted in water to form NO3-and NO2-in the PBR growth medium, providing a nitrogen source that the algae readily assimilated for cell synthesis. Three 20-L photobioreactors were inoculated with a pure culture of C. vulgaris prepared in Bristol growth medium and algae were grown in the PBRs at 25°C and pH of 7.0 in a modified Bristol medium that did not contain nitrogen compounds. The C. vulgaris grew substantially using NO3-/NO2-as its nitrogen source for cell synthesis. The NO3-and NO2-were formed through the dissolution and oxidation/reduction of NOxfrom the simulated flue gas. Algal growth by assimilation of NO3-and/or NO2-allowed for continual dissolution of NOx, resulting in NOxremoval rates from the gas phase of up to 97%, with residual nitrogen of up to 7 mg-N/L in solution. Algae grew from an initial cell density of 3.1 x 105cells/L to cell densities of up to 1.85 x 107cells/mL and dry weights of up to 243 mg/L. Cell nitrogen content varied from 4-8%. PBR to treatment of gaseous NOxwas analyzed in terms of mass transfer rates, chemical kinetics, and biological growth.

Os benzodiazepínicos (BDZ) são amplamente utilizados no tratamento da ansiedade. Aumentam a neurotransmissão GABAérgica por ação em sítios receptores específicos para BDZ presentes no complexo ionóforo no canal do receptor GABAA, onde modulam alostericamente suas atividades. Porém, além de atuar nesses receptores, têm sido relatado, também, a existência de receptores periféricos para benzodiazepínicos (PBR). Evidências sugestivas de uma ação imunomodulatória direta para os BZD emergem de estudos que demonstraram a presença de PBR em células imunes/inflamatórias. Este trabalho avaliou os efeitos da administração de diazepam sobre parâmetros imunológicos de ratos e desenvolveu um método para dosagem plasmática desse benzodiazepínico utilizando a técnica de microextração em fase líquida. Foram realizados tratamentos agudo e prolongado (21 dias) com as doses de 1 e 10 mg/kg. Os resultados mostraram que a dose de 1 mg/kg não alterou qualquer um dos parâmetros imunes analisados; porém, diminuiu a quantidade de hemoglobina e de hemácias, assim como o valor de hematócrito, quando administrado prolongadamente. Entretanto, a dose de 10 mg/kg, após ambos os tratamentos, foi capaz de diminuir as células apoptóticas e, conseqüentemente, de aumentar a porcentagem de células viáveis, aumentar a porcentagem de células Thelper e Tcitotóxicas, diminuir a porcentagem de células B e aumentar os níveis séricos de corticosterona. Além destes, observou-se, também, um aumento do número de reticulócitos e um aumento do número das células segmentadas no sangue periférico, após administração prolongada do diazepam, assim como um aumento do número de células segmentadas no baço, após administração aguda. A menor dose de diazepam (1 mg/kg) também não foi capaz de induzir tolerância, diferente da maior dose (10 mg/kg), que levou ao desenvolvimento de tolerância funcional. Esses resultados sugerem que a administração de diazepam em baixas doses (< 1mg/kg) não interfira com os parâmetros imunes analisados. Entretanto, o uso de diazepam em doses mais elevadas (> 10 mg/kg) é capaz de alterar tais parâmetros. Muito provavelmente esses efeitos tenham a ver com o número de receptores PBR presentes nas células imunes avaliadas e/ou com a dose de diazepam administrada. Com relação ao método analítico, encontrou-se linearidade na faixa de interesse (intervalo dinâmico de 25 a 2000 ng/mL) para o diazepam e o desmetildiazepam. Os limites de detecção e quantificação foram de 20 e 25 ng/mL, respectivamente, e os parâmetros analisados mostraram-se satisfatórios. Desta forma, o método desenvolvido utilizando a técnica de microextração em fase líquida mostrou-se prático, de baixo custo e com grande potencial para extração prévia à injeção no CG. / Benzodiazepines (BZD) are widely used for the treatment of anxiety. They enhance GABA-ergic neurotransmission through binding on specific BDZ recognition sites, within the GABAA receptor-ion channel complex, where they allosterically modulate its activity. However, recents studies showed that BZD also act on peripheral benzodiazepine receptor sites (PBR). Evidence for a direct immunomodulatory action for BZD emerged from studies that demonstrated the presence of PBR on immune/inflammatory cells. The present experiment was designed to analyze the effects of diazepam on rat immune parameters and to develop a method to detect diazepam on rat plasma through a liquid-phase microextraction technique (LPME). The effects of both acute and long-term (21 days) diazepam (1 and 10 mg/kg/day) administrations were evaluated. Results showed that diazepam (1 mg/kg) treatment did not change the immune parameters analyzed; however, long-term diazepam treatment decreased erytrocytes, hemoglobin and hematocrit values. Both diazepam (10mg/kg) acute and long-term treatments decreased the number of apoptotic cells and, consequently, enhanced the percentage of viable cells; they also increased the percentage of Thelper and Tcitotoxic cells; decreased the percentage of B cells and increased the corticosterone serum levels. Long-term diazepam (10 mg/kg) treatment enhanced reticulocytes and segmented cells in the peripheric blood; however, only acute diazepam (10mg/kg) treatment increased the number of segmented cells on spleen. The low dose of diazepam used (1 mg/kg) was unable to induce tolerance, differently of that found after the high dose of diazepam (10 mg/kg). This latter treatment indicated the development of functional tolerance, at least for diazepam effects on corticosterone serum levels. These results suggested that low doses of diazepam (< 1 mg/kg) were not able to change the immune parameters analyzed; however, high doses of diazepam (> 10 mg/kg) changed many of these immune parameters. It is possible that the observed effects were related to the number of PBR receptor sites present on immune cells and/or to the levels of serum diazepam after the treatments used. The analytical method provided to be linear in the interest range (dynamic range from 25 to 2000 ng/mL) for diazepam and its main metabolite, desmethyldiazepam. The limits of detection and quantification were 20 and 25 ng/mL, respectively, and the parameters analyzed provided to be satisfactory. Finally, the method developed utilizing the liquid-phase microextraction technique showed to be practical, with low costs and thus presenting potential to be used previously to the extraction procedures, i.e., prior to the injection into the gas-chromatography apparatus.

É rara a preocupação com a qualidade de implementação de software. Pode-se observar que as estruturas internas dos softwares são freqüentemente complexas e desorganizadas, especialmente no caso dos softwares que são ditos orientados a objetos. Essa complexidade afeta diretamente a manutenibilidade e a susceptibilidade a erros, dificultando a alteração e a adição de novas funcionalidades aos softwares. As próprias alterações, inerentes aos softwares, os tornam mais complexos, o que agrava o problema. Neste contexto, acredita-se que o controle da complexidade pode levar a produtos de software de melhor qualidade. Assim, trata-se neste trabalho da manutenção preventiva, implementada por meio de inspeções, refatorações e análise de métricas. São estudadas falhas de manutenibilidade em uma amostra de programas orientados a objetos e, a partir dos resultados, são propostos artefatos de apoio para um processo de inspeção de software e modelos para os produtos de trabalho gerados nesse processo. Propõe-se o uso da técnica de leitura PBR (Leitura Baseada em Perspectivas) como uma maneira de se melhorar a detecção de falhas de manutenibilidade. Finalmente, a proposta deste trabalho foi validada por meio de um estudo de caso / The commitment with the quality of software implemetation is rare. It\'s possible to observe that the software internal structures are frequently complex and disorganized, especially when talking about software that is said to be object-oriented. This complexity directly affects maintainability and error proneness, making it difficult to change and to add new functionalities to software. Changes themselves, that are inherent in software, make it more complex, and that makes the problem more serious. In this context, it\'s believed that the control of complexity can lead to better quality software products. Thus, the subject of this work is the preventive maintenance, implemented by means of inspections, refactoring and metric analysis. Maintenance flaws were studied in a sample of object-oriented programs and, based on the results, support artifacts for an inspection process were proposed, along with models of work products for this process. The use of PBR (Perspective-Based Reading) technique is proposed as a means of improving the detection of maintenance flaws. Finally, the proposal of this work is validated through a case study

Os benzodiazepínicos (BDZ) são amplamente utilizados no tratamento da ansiedade. Aumentam a neurotransmissão GABAérgica por ação em sítios receptores específicos para BDZ presentes no complexo ionóforo no canal do receptor GABAA, onde modulam alostericamente suas atividades. Porém, além de atuar nesses receptores, têm sido relatado, também, a existência de receptores periféricos para benzodiazepínicos (PBR). Evidências sugestivas de uma ação imunomodulatória direta para os BZD emergem de estudos que demonstraram a presença de PBR em células imunes/inflamatórias. Este trabalho avaliou os efeitos da administração de diazepam sobre parâmetros imunológicos de ratos e desenvolveu um método para dosagem plasmática desse benzodiazepínico utilizando a técnica de microextração em fase líquida. Foram realizados tratamentos agudo e prolongado (21 dias) com as doses de 1 e 10 mg/kg. Os resultados mostraram que a dose de 1 mg/kg não alterou qualquer um dos parâmetros imunes analisados; porém, diminuiu a quantidade de hemoglobina e de hemácias, assim como o valor de hematócrito, quando administrado prolongadamente. Entretanto, a dose de 10 mg/kg, após ambos os tratamentos, foi capaz de diminuir as células apoptóticas e, conseqüentemente, de aumentar a porcentagem de células viáveis, aumentar a porcentagem de células Thelper e Tcitotóxicas, diminuir a porcentagem de células B e aumentar os níveis séricos de corticosterona. Além destes, observou-se, também, um aumento do número de reticulócitos e um aumento do número das células segmentadas no sangue periférico, após administração prolongada do diazepam, assim como um aumento do número de células segmentadas no baço, após administração aguda. A menor dose de diazepam (1 mg/kg) também não foi capaz de induzir tolerância, diferente da maior dose (10 mg/kg), que levou ao desenvolvimento de tolerância funcional. Esses resultados sugerem que a administração de diazepam em baixas doses (< 1mg/kg) não interfira com os parâmetros imunes analisados. Entretanto, o uso de diazepam em doses mais elevadas (> 10 mg/kg) é capaz de alterar tais parâmetros. Muito provavelmente esses efeitos tenham a ver com o número de receptores PBR presentes nas células imunes avaliadas e/ou com a dose de diazepam administrada. Com relação ao método analítico, encontrou-se linearidade na faixa de interesse (intervalo dinâmico de 25 a 2000 ng/mL) para o diazepam e o desmetildiazepam. Os limites de detecção e quantificação foram de 20 e 25 ng/mL, respectivamente, e os parâmetros analisados mostraram-se satisfatórios. Desta forma, o método desenvolvido utilizando a técnica de microextração em fase líquida mostrou-se prático, de baixo custo e com grande potencial para extração prévia à injeção no CG. / Benzodiazepines (BZD) are widely used for the treatment of anxiety. They enhance GABA-ergic neurotransmission through binding on specific BDZ recognition sites, within the GABAA receptor-ion channel complex, where they allosterically modulate its activity. However, recents studies showed that BZD also act on peripheral benzodiazepine receptor sites (PBR). Evidence for a direct immunomodulatory action for BZD emerged from studies that demonstrated the presence of PBR on immune/inflammatory cells. The present experiment was designed to analyze the effects of diazepam on rat immune parameters and to develop a method to detect diazepam on rat plasma through a liquid-phase microextraction technique (LPME). The effects of both acute and long-term (21 days) diazepam (1 and 10 mg/kg/day) administrations were evaluated. Results showed that diazepam (1 mg/kg) treatment did not change the immune parameters analyzed; however, long-term diazepam treatment decreased erytrocytes, hemoglobin and hematocrit values. Both diazepam (10mg/kg) acute and long-term treatments decreased the number of apoptotic cells and, consequently, enhanced the percentage of viable cells; they also increased the percentage of Thelper and Tcitotoxic cells; decreased the percentage of B cells and increased the corticosterone serum levels. Long-term diazepam (10 mg/kg) treatment enhanced reticulocytes and segmented cells in the peripheric blood; however, only acute diazepam (10mg/kg) treatment increased the number of segmented cells on spleen. The low dose of diazepam used (1 mg/kg) was unable to induce tolerance, differently of that found after the high dose of diazepam (10 mg/kg). This latter treatment indicated the development of functional tolerance, at least for diazepam effects on corticosterone serum levels. These results suggested that low doses of diazepam (< 1 mg/kg) were not able to change the immune parameters analyzed; however, high doses of diazepam (> 10 mg/kg) changed many of these immune parameters. It is possible that the observed effects were related to the number of PBR receptor sites present on immune cells and/or to the levels of serum diazepam after the treatments used. The analytical method provided to be linear in the interest range (dynamic range from 25 to 2000 ng/mL) for diazepam and its main metabolite, desmethyldiazepam. The limits of detection and quantification were 20 and 25 ng/mL, respectively, and the parameters analyzed provided to be satisfactory. Finally, the method developed utilizing the liquid-phase microextraction technique showed to be practical, with low costs and thus presenting potential to be used previously to the extraction procedures, i.e., prior to the injection into the gas-chromatography apparatus.

É rara a preocupação com a qualidade de implementação de software. Pode-se observar que as estruturas internas dos softwares são freqüentemente complexas e desorganizadas, especialmente no caso dos softwares que são ditos orientados a objetos. Essa complexidade afeta diretamente a manutenibilidade e a susceptibilidade a erros, dificultando a alteração e a adição de novas funcionalidades aos softwares. As próprias alterações, inerentes aos softwares, os tornam mais complexos, o que agrava o problema. Neste contexto, acredita-se que o controle da complexidade pode levar a produtos de software de melhor qualidade. Assim, trata-se neste trabalho da manutenção preventiva, implementada por meio de inspeções, refatorações e análise de métricas. São estudadas falhas de manutenibilidade em uma amostra de programas orientados a objetos e, a partir dos resultados, são propostos artefatos de apoio para um processo de inspeção de software e modelos para os produtos de trabalho gerados nesse processo. Propõe-se o uso da técnica de leitura PBR (Leitura Baseada em Perspectivas) como uma maneira de se melhorar a detecção de falhas de manutenibilidade. Finalmente, a proposta deste trabalho foi validada por meio de um estudo de caso / The commitment with the quality of software implemetation is rare. It\'s possible to observe that the software internal structures are frequently complex and disorganized, especially when talking about software that is said to be object-oriented. This complexity directly affects maintainability and error proneness, making it difficult to change and to add new functionalities to software. Changes themselves, that are inherent in software, make it more complex, and that makes the problem more serious. In this context, it\'s believed that the control of complexity can lead to better quality software products. Thus, the subject of this work is the preventive maintenance, implemented by means of inspections, refactoring and metric analysis. Maintenance flaws were studied in a sample of object-oriented programs and, based on the results, support artifacts for an inspection process were proposed, along with models of work products for this process. The use of PBR (Perspective-Based Reading) technique is proposed as a means of improving the detection of maintenance flaws. Finally, the proposal of this work is validated through a case study