Orientador: Nelson Arno Wulff / Banca: Priscila Alves da Silva / Banca: Andrea Soares da Costa Fuentes / Resumo: O Huanglongbing (HLB) é a doença mais devastadora dos citros. No Brasil, o HLB está associado a presença de "Candidatus" Liberibacter asiaticus (Las) e Ca. L. americanus (Lam), ambas transmitidas pelo psilídeo Diaphorina citri. O sequenciamento e anotação dos profagos SC1 e SC2 no genoma de Las, identificou uma possível bacteriocina do tipo colicina Ia em SC1, e uma possível proteína de imunidade a colicina em SC2. Lam apresenta profagos similares no seu genoma, porém SP2 é degenerado, sem proteína de imunidade. Como houve uma inversão notável na ocorrência de Las em relação à Lam no Brasil, com o predomínio atual de Las, a presença de ambos os profagos pode conferir uma vantagem adaptativa a Las pela atividade da bacteriocina. Adicionalmente, Las tem lisozimas cromossômicas e de profago, que também podem estar envolvidas em competição bacteriana. A incapacidade de cultivo axênico de Las e Lam requer o uso de sistemas heterólogos para estudos funcionais. Genes com potencial envolvimento na biologia do profago e na competição bacteriana, como as colicinas e lisozimas foram avaliados. As lisozimas CLIBASIA_04790 e ED07_RS0204515, obtidas dos isolados de Las 3PA e Las 4PA, e as colicinas SC1_gp060 e lam_678 obtidas de isolados de Las 2PA, Las Poona e Lam São Paulo foram clonadas em vetor de expressão pET28a e superexpressas em E. coli BL21 (DE3). O crescimento destas bactérias, mensurado pelas médias dos valores de absorbância (OD600), mostraram efeito tóxico das construções com... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Huanglongbing (HLB) is the most devastating disease of citrus. In Brazil, HLB is associated with the presence of "Candidatus" Liberibacter asiaticus (Las) and Ca. L. americanus (Lam), both transmitted by psyllid Diaphorina citri. Sequencing and annotation of prophages SC1 and SC2 in the genome of Las, reveals the presence of a putative bacteriocin, colicin Ia in SC1, while in SC2 a possible colicin immunity-protein was found. Lam has similar prophages in the genome, though SP2 is degenerated, without immunity gene. As there was a striking inversion in the prevalence of Las in detriment of Lam, the presence of both prophages may confer an adaptative advantage to Las, due to the activity of the bacteriocin. Additionally, Las encodes both a chromosomal and phage lysozyme that may also be involved in bacterial competition. The inability of axenic cultivation of Las and Lam requires the use of heterologous systems for functional studies. Genes with potential involvement in prophage biology and bacterial competition, such as colicins and lysozymes, were evaluated. The lysozymes ORFs CLIBASIA_04790 and ED07_RS0204515, from Las isolates 3PA and Las 4PA, and the colicins SC1_gp060 and lam_678 obtained from isolates Las 2PA, Las Poona and Lam São Paulo were cloned into expression vector pET28a and superexpressed in E. coli BL21 (DE3) cells. The growth rate of these bacteria, measured by means of absorbance values (OD600), showed toxic effect of transformants expressing lysozymes, where... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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O sequenciamento e anotação dos profagos SC1 e SC2 no genoma de Las, identificou uma possível bacteriocina do tipo colicina Ia em SC1, e uma possível proteína de imunidade a colicina em SC2. Lam apresenta profagos similares no seu genoma, porém SP2 é degenerado, sem proteína de imunidade. Como houve uma inversão notável na ocorrência de Las em relação à Lam no Brasil, com o predomínio atual de Las, a presença de ambos os profagos pode conferir uma vantagem adaptativa a Las pela atividade da bacteriocina. Adicionalmente, Las tem lisozimas cromossômicas e de profago, que também podem estar envolvidas em competição bacteriana. A incapacidade de cultivo axênico de Las e Lam requer o uso de sistemas heterólogos para estudos funcionais. Genes com potencial envolvimento na biologia do profago e na competição bacteriana, como as colicinas e lisozimas foram avaliados. As lisozimas CLIBASIA_04790 e ED07_RS0204515, obtidas dos isolados de Las 3PA e Las 4PA, e as colicinas SC1_gp060 e lam_678 obtidas de isolados de Las 2PA, Las Poona e Lam São Paulo foram clonadas em vetor de expressão pET28a e superexpressas em E. coli BL21 (DE3). O crescimento destas bactérias, mensurado pelas médias dos valores de absorbância (OD600), mostraram efeito tóxico das construções com lisozimas, sendo que clones de E. coli BL21 (DE3) expressando CLIBASIA_04790 (pMD15) e ED07_RS0204515 (pMD17) cresceram cerca de 60 e 70% menos, respectivamente, quando comparados aos controles. Ensaios de SDS-PAGE e Western Blot com anticorpo anti-His6X, evidenciaram a presença de ambas as proteínas na fração insolúvel, de 20 kDa (pMD15) e 12 kDa (pMD17), confirmando a expressão das lisozimas. Para as colicinas, somente o clone expressando SC1_gp060 proveniente do isolado Poona (pMD16) mostrou efeito em E. coli BL21 (DE3), com redução de 70% no crescimento quando comparado aos controles. Estes resultados auxiliam a desvendar a relação entre genes com potencial vantagem adaptativa e seu envolvimento na biologia das Liberibactérias e podem justificar seu uso biotecnológico em plantas geneticamente modificadas contra o HLB. / Huanglongbing (HLB) is the most devastating disease of citrus. In Brazil, HLB is associated with the presence of "Candidatus" Liberibacter asiaticus (Las) and Ca. L. americanus (Lam), both transmitted by psyllid Diaphorina citri. Sequencing and annotation of prophages SC1 and SC2 in the genome of Las, reveals the presence of a putative bacteriocin, colicin Ia in SC1, while in SC2 a possible colicin immunity-protein was found. Lam has similar prophages in the genome, though SP2 is degenerated, without immunity gene. As there was a striking inversion in the prevalence of Las in detriment of Lam, the presence of both prophages may confer an adaptative advantage to Las, due to the activity of the bacteriocin. Additionally, Las encodes both a chromosomal and phage lysozyme that may also be involved in bacterial competition. The inability of axenic cultivation of Las and Lam requires the use of heterologous systems for functional studies. Genes with potential involvement in prophage biology and bacterial competition, such as colicins and lysozymes, were evaluated. The lysozymes ORFs CLIBASIA_04790 and ED07_RS0204515, from Las isolates 3PA and Las 4PA, and the colicins SC1_gp060 and lam_678 obtained from isolates Las 2PA, Las Poona and Lam São Paulo were cloned into expression vector pET28a and superexpressed in E. coli BL21 (DE3) cells. The growth rate of these bacteria, measured by means of absorbance values (OD600), showed toxic effect of transformants expressing lysozymes, whereas E. coli BL21 (DE3) clones expressing CLIBASIA_04790 (pMD15) and ED07_RS0204515 (pMD17) grew about 60 and 70% when compared to controls. SDS-PAGE and Western Blot assays were performed with anti-His6X antibody, showing the presence of both proteins in the insoluble fraction, with 20 kDa (pMD15) and 12 kDa (pMD17), confirming lysozyme expression. In the case of the colicin, only the clone expressing SC1_gp060 from Las Poona strain (pMD16) showed toxic effect, showing reduction of 70% in growth rates when compared to the controls. These results help to unravel the relationship between genes with potential adaptive advantage and their involvement in the biology of Liberibacteria and may justify their biotechnological use in genetically modified plants against HLB. / CNPq: 830857/1999-0 -

Lisozima mostrou-se capaz, quando dispersa em certos meios orgânico-aquosos, de gerar sistemas pseudoplásticos que evoluem espontaneamente para redes de caráter viscoelástico. Esse fenômeno foi investigado neste estudo, para lisozima dispersa em uma série de misturas binárias contendo derivados de uréia como componente orgânico. Devido aos notáveis efeitos observados para um de tais derivados, a saber, tetrametiluréia (TMU), especial atenção foi dedicada aos sistemas contendo esse composto. O enfoque experimental incluiu espectroscopia Raman, microcalorimetria, reologia e espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS). O trabalho envolveu o estudo dos sistemas orgânico-aquosos isolados e na presença de proteína. No primeiro caso, foi feita uma investigação espectroscópica e microcalorimétrica dos sistemas quanto a aspectos relativos à segregação de microdomínios na fase liquida e sua conseqüente relação com a deflagração da transição viscoelástica na proteína. Foram observadas descontinuidades nos valores de entalpias de excesso de mistura para o sistema TMU/água em torno de wTMU = 0,6, assim como padrões peculiares de comportamento espectral em torno dessa concentração da mistura binária. No segundo caso, os sistemas complexos de proteínas gerados foram investigados sob o ponto de vista morfológico e dinâmico, através das técnicas reológicas e de SAXS. Energias de ativação de fluxo determinadas na região sub-crítica, de comportamento Newtoniano, mostraram uma dependência exponencial direta com wTMU, indicando que mudanças estruturais nos fluidos complexos já ocorrem em regiões de composição do solvente bem abaixo da região de transição em wTMU = 0,6. Na região viscoelástica, 0,6<wTMU<0,9, ensaios de relaxação indicaram a presença de duas populações distintas. A tangente de perda (tg &#948; = G\"/G\') apresentou valores menores que a unidade para todos os casos, indicando o caráter \"solid-like\" das redes nas condições de ensaio. Apesar de seu caráter sólido, as redes mostram-se bastante flexíveis, suportando grandes deformações antes da ruptura, como inferido a partir da larga região viscoelástica linear. A variação nos módulos elástico (G\') e de perda (G\") com a composição do solvente indica a dependência do caráter viscoelástico com a fração de massa de TMU na mistura binária. Na região de baixo conteúdo de água (wTMU = 0,9), um aumento em G\" após a região viscoelástica linear é observado, indicando aumento da estruturação antes da ruptura da rede. As curvas de SAXS foram modeladas em seus fatores de forma e de interferência com uma equação unificada para objetos aleatoriamente distribuídos em um continuum. Os resultados permitiram a construção de um modelo, compatível com as demais evidências experimentais, segundo o qual as moléculas de lisozima encontram-se em duas conformações distintas nas matrizes: uma de conformação estendida e caráter fractal, predominante em wTMU > 0,6, com dimensão máxima de ca. de 160 &#197;, responsável pela interdigitação com espécies fractais vizinhas e uma espécie compacta, minoritária em wTMU > 0,6 (porém predominante em wTMU <0,6), com raio de giro de ca. 48 &#197;, presente nos microdomínios intersticiais aquosos da matriz. Verificou-se ainda a viabilidade de incorporação homogênea de uma metaloproteína, o citocromo-c, às matrizes de lisozima, sem perturbação significativa de sua morfologia, o que constitue um evento de potencial interesse biotecnológico. Os resultados deste trabalho trazem novos suportes experimentais à hipótese de correlação entre inversão na microconfiguração do meio solvente binário e deflagração do processo de transição sol-gel da proteína. / Lysozyme was found to be able, when dispersed in certain organic/aqueous media, to generate pseudoplastic systems that spontaneously evolve to three-dimensional networks with viscoelastic character. This phenomenon was investigated in this study, for lysozyme dispersed in a series of binary mixtures containing urea derivatives as the organic component. Due to the remarkable effects obtained in one of such derivatives, namely, tetramethylurea (TMU), special attention was given to systems containing that compound. The experimental approach included Raman spectroscopy, microcalorimetry, rheology and small angle X ray scattering (SAXS). The work involved the study of the organic/aqueous systems on their own and in the presence of protein. The former consisted of binary liquid mixtures that were spectroscopically and microcalorimetrically investigated as to aspects concerning microdomain segregation in the liquid phase and its consequent relationship with the threshold of the protein viscoelastic transition. Discontinuities in the excess enthalpy of mixture were observed for TMU/water system around wTMU=0.6, as well as peculiar spectral patterns around that same binary mixture concentration. The latter comprised complex protein systems that were investigated both under a morphological and dynamical point of view. Flow activation energies determined in the sub-critical (Newtonian) region showed an exponential increase with wTMU, indicating that structural changes in the comp]ex fluids are under way at solvent concentration regions well below that of the transition, at wTMU = 0.6. In the viscoelastic region, 0.6<wTMU<0.9, relaxation studies indicated the presence of two distinct populations. The loss tangent (tan &#948; = G\"/G\') presented values lower than the unity for all cases, indicating the solid-like character of the matrices, in the assay conditions. Despite their solid character the networks are quite flexible, standing large strains before rupture, as inferred from the large linear viscoelastic region. The variation in elastic (G\') and loss (G\") moduli with solvent composition indicates a dependence of the viscoelastic character on TMU mass fraction in the binary mixture. In the region of low water content (wTMU = 0.9), an increase in G\" after the LVR is observed, indicating increase in network structuring before rupture. SAXS curves were modeled with a unified equation for randomly distributed objects in a continuum. Results allowed the proposal of a model, which is compatible with the experimental evidence obtained through the other techniques in this work, according to which lysozyme molecules occur in two distinct conformations: one expanded and with fractal character, prevailing at wTMU > 0.6, with maximum dimension ca. 160 &#197; and interdigitated with neighbouring fractal species; and a compact conformation, of minor prevalence at wTMU>0.6 (but prevailing at wTMU < 0.6), with radius of gyration ca. 48 &#197;, present in the matrix microdomain interstices. It has also been verified the feasibility of homogeneous incorporation of cytochrome-c into the lysozyme matrices, an event of potential biotechnological interest. Results from this work bring further experimental support to our hypothesis on the correlation between microconfigurational inversion in the binary solvent medium and the sol-gel transition in the protein.