Têm sido estudadas novas modalidades para o diagnóstico e tratamento de câncer de próstata avançado baseado em peptídeos. Receptores para o peptídeo liberador de gastrina (GRPr) são superexpressos em vários tipos de células cancerígenas, incluindo câncer de mama e próstata. A bombesina é um análogo do peptídeo GRP de mamíferos que se liga com alta especificidade e afinidade a GRPr. Várias pesquisas têm sido realizadas para desenvolver e radiomarcar um análogo da bombesina com lutécio-177 com interesse para terapia de tumores pequenos ou metástases, devido às características físicas e viabilidade comercial do radionuclídeo. O objetivo deste trabalho foi estudar o processo de marcação e controle de qualidade de derivados da bombesina, usando como agente quelante DTPA e DOTA e espaçador aminoacídico Gly5, e realizar estudos de estabilidade e de biodistribuição de modo a avaliar o potencial de aplicação em estudos clínicos. Os estudos demonstraram que os análogos da bombesina estudados podem ser marcados com 177Lu com alto rendimento de marcação e alta atividade específica. Os estudos de estabilidade in vitro sugerem que os derivados DOTA-conjugados apresentam maior estabilidade que o DTPA-conjugados quando armazenados sob refrigeração e em soro humano. O coeficiente de partição do PG5N-DOTA-177Lu indicou maior lipofilicidade quando comparado com o derivado PG5M-DOTA-177Lu , porém sem influência sobre o clareamento sanguíneo ou captação hepática do composto. Os compostos DOTA-conjugados apresentam menor ligação às proteínas plasmáticas, corroborado pelo rápido clareamento sanguíneo observado nos estudos in vivo. Os estudos de biodistribuição com os compostos PG5M-DOTA-177Lu e PG5N-DOTA-177Lu mostraram o rápido clareamento sanguíneo dos compostos e excreção renal, e baixa captação óssea, indicando estabilidade in vivo dos derivados 177Lu-DOTA. O composto PG5M-DOTA-177Lu apresentou maior captação no pâncreas e intestinos, órgãos com maior porcentagem de receptores para bombesina. Entretanto, a ligação dos compostos às células tumorais (PC-3) in vitro foi similar para ambos os compostos. / New therapy modalities for the treatment of advanced prostate cancer based on peptide analogues are reviewed. It has been shown that gastrin releasing peptide receptors (GRPr) are overexpressed in various types of cancer cells including prostate and breast cancer. Bombesin is an analogue of the mammalian GRP that binds with high specificity and affinity to GRPr. Significant research efforts have been devoted to the design bombesin analogues labeled with 177Lu considering the excellent radiophysical properties and commercial availability of the radionuclide. The aim of this work was to study the labeling and the quality control of a bombesin analogues with Lu-177 using DOTA and DTPA as chelate group and an aminoacidic spacers Gly5 and study the stability and biodistribution properties in order to evaluate the potencial for clinical application. The studies showed that the bombesin analogs were labeled with 177Lu with high radiochemical yield and high specific activity. In vitro stability studies showed that DOTA-conjugated peptides were more stable than DTPA-conjugated, when stored under refrigeration or in human serum. The partition coefficient values showed that 177LuDOTA-PG5N was more lipophilic when compared with 177LuDOTA-PG5M but without influence on blood clearance and liver uptake. The DOTA-conjugated peptides presented low binding to plasma proteins, that contributes for fast blood clearance in vivo. Biodistribution studies of 177LuDOTA-PG5M and 177LuDOTA-PG5N, showed significant renal uptake, as a result of the urinary excretion and low bone uptake, that indicated the in vivo stability of the 177Lu-DOTA-complexes. The compound 177LuDOTA-PG5M showed higher uptake on pancreas and intestinses and these organs presents high density of BBN receptors. But the in vitro binding assays (PC-3 tumors cells) showed similar results for both compounds.

Os receptores para a bombesina (BBN), especialmente o receptor para o peptídeo liberador de gastrina (GRPr), são massivamente expressos em vários tipos de câncer, dentre eles o câncer de próstata, e podem ser uma alternativa para seu diagnóstico e tratamento por terapia radioisotópica. Modificações moleculares na estrutura da BBN vêm sendo promovidas e os derivados produzidos têm apresentado bons resultados em estudos préclínicos. No entanto, todos os derivados estudados apresentaram alta captação abdominal e esta é a principal limitação do uso clínico da BBN, devido aos efeitos adversos aos pacientes. O objetivo deste trabalho foi radiomarcar uma nova série de derivados da bombesina com lutécio-177 e avaliar a relação entre sua estrutura e o potencial diagnóstico-terapêutico do câncer de próstata. Os peptídeos estudados apresentam estrutura genérica DOTA-Phe-(Gly)n-BBN(6-14), em que DOTA é o grupamento quelante, n é o número de aminoácidos glicina do espaçador Phe-(Gly)n e BBN(6-14) é a sequência original de aminoácidos da BBN do aminoácido 6 ao aminoácido 14. Estudos preliminares foram realizados a fim de avaliar a condição que conferia maior pureza radioquímica aos derivados radiomarcados, determinada por cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A estabilidade dos derivados radiomarcados foi avaliada após incubação à 2-8° C ou em soro humano à 37° C e o coeficiente de partição foi determinado em n-octanol:água. Estudos in vivo foram realizados em camundongos Balb-c sadios e Nude com tumor de células PC-3, a fim de caracterizar biologicamente os derivados da bombesina. Estudos in vitro envolveram a avaliação do efeito dos derivados não radiomarcados sobre a proliferação das células PC-3. A análise em ITLC-SG e CLAE revelou que todos os derivados da bombesina foram radiomarcados com alta pureza radioquímica. Os derivados radiomarcados apresentaram alta estabilidade à 2-8° C. A análise em soro humano indicou metabolismo tempodependente dos derivados pelas enzimas do soro e aumento da estabilidade com o acréscimo de aminoácidos glicina no espaçador após 4 horas de incubação, mas não após 24 horas. Os estudos em CLAE e de coeficiente de partição indicaram que os derivados da bombesina apresentam baixa lipossolubilidade, a qual decresce com o aumento do espaçador. Os derivados apresentaram rápido clareamento sanguíneo, rápida excreção, realizada primariamente por via renal, baixa retenção no organismo e baixo acúmulo abdominal nos estudos in vivo em camundongos Balb-c. Os estudos em camundongos Nude com tumor PC-3 mostraram a capacidade dos derivados de se ligar às células tumorais. Os dois peptídeos com maior espaçador apresentaram maior captação tumoral 1 hora após a administração endovenosa, mas o derivado com menor espaçador apresentou maior captação tumoral quatro e 24 horas após a administração. A ligação às células PC-3 in vivo mostrou ser específica e suficiente para a detecção do tumor por imagens cintilográficas, principalmente 30 minutos após a administração. Nos estudos in vitro, os derivados da bombesina estudados não apresentaram efeito proliferativo ou citotóxico sobre as células PC-3, o que os caracteriza como agonistas fracos ou antagonistas dos receptores para GRP. Os resultados deste trabalho mostraram, portanto, que todos os derivados estudados são promissores para aplicação in vivo. A maior captação tumoral dos derivados com maior espaçador na primeira hora após a administração indica que essas moléculas são os mais adequados para o diagnóstico por imagem de tumor de próstata. Já para aplicação em terapia radioisotópica, o derivado com menor espaçador é o mais adequado, devido à maior retenção tumoral. / Bombesin (BBN) receptors in particular, the gastrin-releasing peptide (GRP) receptor peptide have been shown to be massively overexpressed in several human tumors types, including prostate cancer, and could be an alternative as target for its treatment by radionuclide therapy (RNT). A large number of BBN analogs had already been synthesized for this purpose and have shown to reduce tumor growth in mice. Nevertheless, most of the studied analogs exhibit high abdominal accumulation, especially in pancreas. This abdominal accumulation may represent a problem in clinical use of radiolabeled bombesin analogs probably due to serious side effects to patients. The goal of the present work was to radiolabel a novel series of bombesin derivatives with lutetium-177 and to evaluate the relationship between their structure and diagnostic-therapeutic activity for prostate tumor. The generic structure of studied peptides is DOTA-Phe-(Gly)n-BBN(6-14), where DOTA is the chelator, n is the number of glycine amino acids of Phe-(Gly)n spacer and BBN(6-14) is the bombesin sequence from the amino acid 6 to the amino acid 14. Preliminary studies were done to establish the ideal labeling conditions for obtaining the highest yield of labeled bombesin derivatives, determined by instant thin layer chromatography (ITLC-SG) and high performance liquid chromatography (HPLC). The stability of the preparations was evaluated either after storing at 2-8º C or incubation in human serum at 37º C and the partition coefficient was determined in n:octanol:water. In vivo studies were performed in both healthy Balb-c and Nude mice bearing PC-3 xenografts, in order to characterize the biological properties of labeled peptides. In vitro studies involved the evaluation of cold bombesin derivatives effect in PC-3 cells proliferation. Bombesin derivatives were successfully labeled with high yield at optimized conditions and exhibited high stability at 4ºC. The analysis of the stability in human serum suggested a time-course metabolic degradation of labeled peptides by serum enzymes. The addition of four glycine amino acids in the spacer of bombesin derivatives resulted in slower degradation by human serum enzymes after 4 hours of incubation. HPLC and partition coefficient studies showed that bombesin derivatives present low lipophilicity and the increase of glycine amino acids number in peptides spacers slightly reduced their lipophilicity. The radiolabeled bombesin derivatives presented fast blood clearance, rapid excretion, performed mainly by renal pathway, and low abdominal accumulation in in vivo studies in Balb-c mice. Investigations in Nude mice bearing PC-3 tumor showed that the radiopeptides can target tumor cells. Higher tumor uptake was observed with the derivatives of larger spacers at 1 hour post injection, but higher tumor retention after 4 and 24 hours was observed with the derivative of smaller spacer. In addition, tumor uptake showed to be specific and allowed tumor detection by scintigraphy imaging, especially 30 minutes post injection. In addition, the studied bombesin derivatives did not present proliferative or cytotoxic effect to PC-3 cells in vitro and can be characterized as weak agonists or antagonists of bombesin receptors. The results of this work showed that phenyl-glycine extended bombesin derivatives are promising for in vivo applications. The higher tumor uptake of derivatives with larger spacer suggests that these molecules are more applicable in diagnostic procedures. The derivative with smaller spacer is more useful to be applied in radionuclide therapy, because of its higher tumor retention.

Atualmente os gliomas representam cerca de 81% dos tumores cerebrais malignos, com aumento na incidência tanto em crianças, como em adultos acima dos 45 anos. Um número elevado de receptores neuroquinina tipo 1 (NK-1) estão expressos em células de glioma, estando a ligação da Substância P (SP) a esses receptores, envolvida no desenvolvimento e progressão desse tipo de tumor. A SP quelada ao DOTA (SP-DOTA), radiomarcada, vem sendo testada para utilização na terapia de gliomas, sendo o lutécio-177 (177Lu), devido a seu menor alcance tecidual, o radioisótopo mais indicado para tumores localizados em áreas críticas do cérebro. No entanto, estudos indicam a necessidade da adição de um excesso de metionina para prevenção da oxidação peptídica da SP-DOTA-177Lu, visando aumentar a estabilidade e a capacidade de ligação às células tumorais. Para superar esse desafio, surge a perspectiva da utilização de um novo análogo da SP, com estrutura modificada, para prevenir a oxidação peptídica. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a marcação de um novo análogo da SP com 177Lu e caracterizar suas propriedades in vitro e in vivo, visando a obtenção de um radiofármaco inédito e com potencial aplicação na terapia de tumores cerebrais e realizar estudos preliminares de marcação deste novo análogo com Ítrio-90 (90Y). O novo análogo foi obtido pela troca do aminoácido metionina (Met) pelo aminoácido norleucina (Nle) na posição 11 da cadeia peptídica da SP, sendo esses peptídeos denominados respectivamente SP(Met11)-DOTA e SP(Nle11)-DOTA. Após análise da oxidação peptídica dos dois peptídeos, os parâmetros da radiomarcação da SP(Nle11)-DOTA, com 177LuCl3, foram estudados para determinar a melhor condição de marcação. As estabilidades in vitro da SP(Nle11)-DOTA-177Lu sob refrigeração (2-8°C), no freezer (-20°C) e em soro humano (37°C) foram determinadas após radiomarcação com alta atividade, quanto ao uso de agentes estabilizantes e após diluição. A SP(Nle11)-DOTA também foi radiomarcada com 90Y, utilizando-se a condição padrão determinada, sendo a estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-90Y sob refrigeração (2-8°C) e em freezer (-20°C), avaliada após radiomarcação com alta atividade e quanto a utilização de agente estabilizante. A capacidade de ligação in vitro às células tumorais (U-87 MG e M059J) e a biodistribuição in vivo em camundongos BALB/c sadios foram determinadas para a SP(Nle11)-DOTA-177Lu e comparadas à SP(Met11)-DOTA-177Lu. A ligação às proteínas plasmáticas e a biodistribuição em camundongos Nude com modelo tumoral também foram avaliadas. Os resultados obtidos na análise da oxidação peptídica comprovaram a importância da adição de excesso de metionina para prevenção da oxidação peptídica e indicaram uma alta estabilidade da SP(Nle11)-DOTA, durante e após o processo de radiomarcação. A adição de 148 MBq (4 mCi) da solução de 177LuCl3 em HCl 0,05N à 10 μg de SP(Nle11)-DOTA diluída em tampão acetato de sódio 0,4 M pH 4,5 seguida pela incubação a uma temperatura de 90ºC por 30 minutos, sob agitação de 350 rpm foi definida com condição padrão de marcação. O congelamento (-20°C), o uso de agentes estabilizantes e a diluição apresentaram-se como métodos efetivos para garantir uma alta estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-177Lu, após a marcação com alta atividade. Bons resultados também foram observados para a marcação da SP(Nle11)-DOTA com 90YCl3 e para a estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-90Y, após congelamento (-20°C) e quando utilizado ácido gentísico como estabilizante. A SP(Nle11)-DOTA-177Lu apresentou uma boa especificidade pelas células tumorais, principalmente pelas células de glioma humano M059J, sugerindo que a substituição do aminoácido metionina por norleucina na posição 11 não compromete a capacidade de ligação da SP(Nle11) às células tumorais. Uma baixa porcentagem de ligação às proteínas plasmáticas e um rápido clareamento sanguíneo foram observados para a SP(Nle11)-DOTA-177Lu, sendo esse radiofármaco eliminado preferencialmente por via renal. A SP(Nle11)-DOTA-177Lu apresentou uma boa estabilidade in vivo e se mostrou incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sendo seu uso indicado por injeção intratumoral ou intracavitária. O estudo de biodistribuição em animais com modelo tumoral, mostrou que esse radiofármaco se liga às células tumorais por ligações receptor específicas. Com base nesse dados conclui-se que a SP(Nle11)-DOTA-177Lu, apresenta-se como um radiofármaco inédito que devido às suas propriedades in vitro e in vivo favoráveis, apresenta potencial aplicação na terapia de tumores cerebrais, representando uma nova possibilidade dentro do limitado arsenal terapêutico para esse tipo de tumor. / Currently gliomas represent about 81% of malignant brain tumors with increased incidence in children and in adults over 45 years. A large number of type 1 neurokinin receptor (NK-1) are expressed in glioma cells, being the binding of substance P (SP) to these receptors, involved in the development and progression of this tumor type. The SP conjugated at DOTA chelator (SP-DOTA), radiolabeled, have been tested for use in the treatment of gliomas, and the lutetium-177 (177 Lu), due to its lower tissue range, has been the most suitable radioisotope for tumors located in critical areas brain. However, studies indicate the necessity of adding an excess of methionine to prevent the peptide SP-DOTA-177Lu oxidation in order to increase the stability and capacity to bind to tumor cells. To overcome this challenge, there is the prospect of using a new analog of SP with a modified structure, to prevent peptide oxidation. In this context, the aim of this work was study the labeling of a new analog of SP with 177Lu and characterize their properties in vitro and in vivo, in order to obtain a novel radiopharmaceutical with potential application in brain tumor therapy, and perform preliminary studies labeling of this new analog with yttrium-90 (90Y). The new analog was obtained by replacement of the amino acid methionine (Met) by the amino acid norleucine (Nle) at position 11 of the peptide chain of SP, and these peptides were called SP(Met11)-DOTA and SP(Nle11)-DOTA respectively. After analysis of the oxidation for the two peptides, the radiolabeling parameters of the SP(Nle11)-DOTA with 177LuCl3 were studied to determine the best labeling condition. The SP(Nle11)-DOTA was also radiolabeled with 90Y, using standard condition, and the stability in vitro of the SP(Nle11)-DOTA-90Y assessed under refrigeration (2-8 °C) and under freezing (-20° C), after radiolabeling with high activity and use of stabilizing agent. The stabilities in vitro of the SP (Nle11)-DOTA-177Lu under refrigeration (2-8 °C), under freezing (-20 °C) and in human serum (37 °C) were determined after radiolabeling with high activity, with use of stabilizing agents and after dilution. The ability of in vitro binding to tumor cells (U-87 MG and M059J) and the biodistribution in vivo in healthy BALB/c mice were determined for the 177Lu-DOTA-SP(Nle11) and compared to 177Lu-DOTA-SP(Met11). The plasma protein binding and biodistribution in Nude mice with tumor model were also evaluated. The results obtained from analysis of oxidation for the two peptides confirmed the importance of adding excess methionine to prevent peptide oxidation and indicated a high stability of the DOTA- SP(Nle11), during and after the radiolabeling process. The addition of 148 MBq (4 mCi) of 177LuCl3 solution in 0.05N HCl at 10 μg DOTA-SP(Nle11) diluted in 0.4 M sodium acetate buffer pH 4.5 followed by incubation at a temperature of 90 °C for 30 minutes under constant agitation to 350 rpm was defined as standard labeling condition. The freezing (-20 °C), the use of stabilizing agents and the dilution were presented as effective methods to ensure high stability in vitro 177Lu-DOTA-SP(Nle11), after labeling with high activity. Good results were also observed for labeling DOTA-SP(Nle11) with 90YCl3 and for stability in vitro of the 90Y-DOTA-SP(Nle11) after freezing (-20 °C) and when gentisic acid was used as a stabilizer. The 177Lu-DOTA-SP(Nle11) showed good specificity to tumor cells, particularly human glioma cells (M059J), suggesting that substitution of the amino acid norleucine for methionine at position 11 does not compromise the capacity of SP(Nle11) binding to tumor cells. A low percentage of plasma protein binding and rapid blood clearance were observed for the 177Lu-DOTA-SP(Nle11), being this radiopharmaceutical preferably eliminated by the kidney. The 177Lu-DOTA-SP(Nle11) showed good stability in vivo and inability to cross the blood brain barrier, being its use indicated through intratumoral or intracavitary injection. The biodistribution studies in animals with tumor model showed that the radiopharmaceutical binds to the tumor cells by specific receptor binding. Based on this data was concluded that the 177Lu-DOTA-SP(Nle11), can be presented as a novel radiopharmaceutical that due to its favorable properties in vitro and in vivo, presents a potential application in the therapy of brain tumors, representing a new possibility within the limited therapeutic options for this type of tumor.

Este trabalho apresenta dois modelos baseados em análise compartimental: modelo Animal e modelo Humano, usando imagens obtidas com mini gama câmera e dados de pacientes (obtidos da literatura) para a determinação das constantes cinéticas na biodistribuição do 177Lu-DOTATATO para três espécies animais (rato Wistar, hamster armênio e hamster sírio) e para o Humano. Os estudos de biodistribuição consideraram duas fases: a Fase 1, governada pela transferência do sangue para os órgãos e a Fase 2 governada pela excreção renal. As constantes cinéticas calculadas a partir dos dados obtidos com os animais foram usadas para a construção de escalas alométricas para prever a biodistribuição do radiofármaco 177Lu-DOTATATO empregando relações de massa, metabolismo, longevidade e parâmetros fisiológicos. Os resultados de extrapolação foram comparados com resultados calculados diretamente para os pacientes de PRRT (Peptide Receptor Radiotherapy) usando o modelo Humano. As constantes cinéticas calculadas a partir dos dados obtidos com humanos foram usadas para estimativa de dose em pacientes de PRRT considerando 26 órgãos e tecidos considerados pelo método MIRD. Os resultados de dosimetria foram concordantes com aqueles disponíveis na literatura. Para a Fase 1, as relações alométricas para as constantes cinéticas dos principais órgãos envolvidos no metabolismo e excreção do 177Lu-DOTATATO - fígado, rins e bexiga - mostraram boa correlação na projeção por massa, por metabolismo e por parâmetros fisiológicos. Para a Fase 2, apenas as constantes do sangue para os rins e do sangue para o fígado apresentaram boa correlação. Considerando o efeito de bloqueio da excreção renal pelo uso de anestésico, não se justificam tempos de medição maiores que 40 minutos para estudos in vivo, em pequenos animais. Dessa maneira, os resultados obtidos com as medições da Fase 1 da biodistribuição do 177Lu-DOTATATO em animais se apresentam como suficientes para estabelecer relações alométricas para estimativa de dose em pacientes submetidos à PRRT. / This work proposes two models based in compartimental analyses: Animal model and Human model, using images from gamma camera measurements to determinate the kinetic constants of the 177Lu-DOTATATE to three animal species (rat Wistar, Armenian hamster and Syrian hamster) and to the human in biodistridution studies split in two phases: Phase 1 governed by uptake from the blood and Phase 2 governed by the real excretion. The kinetic constants obtained from the animals data were used to build allometric scaling to predict radiopharmaceutical biodistribution in the human employing relations by mass, metabolism, by life span and by physiological parameters. These extrapolation results were compared with the PRRT (Peptide receptor radiotherapy) patients kinetic data calculated using the Human model. The kinetic constants obtained from humans were used in dose assessment to PRRT patients considering MIRD 26 organs and tissues. Dosimetry results were in agreement with available results from literature. For the Phase 1 allometric scaling from kinetic data from the blood to the organs straight responsible for the 177Lu-DOTATATO metabolism and excretion - liver, kidneys and urinary bladder -show good correlation in the scaling by mass, metabolism and physiological and parameters. For the Phase 2, only the kinetic data from blood to the liver and to the kidneys show good correlation. Based in the anaesthetics inhibitory action over the renal excretion, there is not empirical basis to allow measurement times over 40 minutes in in vivo studies with small animals. Consequently, the Phase 1 results seem enough to make allometric scaling to assessment dose in PRRT.

Têm sido estudadas novas modalidades para o diagnóstico e tratamento de câncer de próstata avançado baseado em peptídeos. Receptores para o peptídeo liberador de gastrina (GRPr) são superexpressos em vários tipos de células cancerígenas, incluindo câncer de mama e próstata. A bombesina é um análogo do peptídeo GRP de mamíferos que se liga com alta especificidade e afinidade a GRPr. Várias pesquisas têm sido realizadas para desenvolver e radiomarcar um análogo da bombesina com lutécio-177 com interesse para terapia de tumores pequenos ou metástases, devido às características físicas e viabilidade comercial do radionuclídeo. O objetivo deste trabalho foi estudar o processo de marcação e controle de qualidade de derivados da bombesina, usando como agente quelante DTPA e DOTA e espaçador aminoacídico Gly5, e realizar estudos de estabilidade e de biodistribuição de modo a avaliar o potencial de aplicação em estudos clínicos. Os estudos demonstraram que os análogos da bombesina estudados podem ser marcados com 177Lu com alto rendimento de marcação e alta atividade específica. Os estudos de estabilidade in vitro sugerem que os derivados DOTA-conjugados apresentam maior estabilidade que o DTPA-conjugados quando armazenados sob refrigeração e em soro humano. O coeficiente de partição do PG5N-DOTA-177Lu indicou maior lipofilicidade quando comparado com o derivado PG5M-DOTA-177Lu , porém sem influência sobre o clareamento sanguíneo ou captação hepática do composto. Os compostos DOTA-conjugados apresentam menor ligação às proteínas plasmáticas, corroborado pelo rápido clareamento sanguíneo observado nos estudos in vivo. Os estudos de biodistribuição com os compostos PG5M-DOTA-177Lu e PG5N-DOTA-177Lu mostraram o rápido clareamento sanguíneo dos compostos e excreção renal, e baixa captação óssea, indicando estabilidade in vivo dos derivados 177Lu-DOTA. O composto PG5M-DOTA-177Lu apresentou maior captação no pâncreas e intestinos, órgãos com maior porcentagem de receptores para bombesina. Entretanto, a ligação dos compostos às células tumorais (PC-3) in vitro foi similar para ambos os compostos. / New therapy modalities for the treatment of advanced prostate cancer based on peptide analogues are reviewed. It has been shown that gastrin releasing peptide receptors (GRPr) are overexpressed in various types of cancer cells including prostate and breast cancer. Bombesin is an analogue of the mammalian GRP that binds with high specificity and affinity to GRPr. Significant research efforts have been devoted to the design bombesin analogues labeled with 177Lu considering the excellent radiophysical properties and commercial availability of the radionuclide. The aim of this work was to study the labeling and the quality control of a bombesin analogues with Lu-177 using DOTA and DTPA as chelate group and an aminoacidic spacers Gly5 and study the stability and biodistribution properties in order to evaluate the potencial for clinical application. The studies showed that the bombesin analogs were labeled with 177Lu with high radiochemical yield and high specific activity. In vitro stability studies showed that DOTA-conjugated peptides were more stable than DTPA-conjugated, when stored under refrigeration or in human serum. The partition coefficient values showed that 177LuDOTA-PG5N was more lipophilic when compared with 177LuDOTA-PG5M but without influence on blood clearance and liver uptake. The DOTA-conjugated peptides presented low binding to plasma proteins, that contributes for fast blood clearance in vivo. Biodistribution studies of 177LuDOTA-PG5M and 177LuDOTA-PG5N, showed significant renal uptake, as a result of the urinary excretion and low bone uptake, that indicated the in vivo stability of the 177Lu-DOTA-complexes. The compound 177LuDOTA-PG5M showed higher uptake on pancreas and intestinses and these organs presents high density of BBN receptors. But the in vitro binding assays (PC-3 tumors cells) showed similar results for both compounds.

Os receptores para a bombesina (BBN), especialmente o receptor para o peptídeo liberador de gastrina (GRPr), são massivamente expressos em vários tipos de câncer, dentre eles o câncer de próstata, e podem ser uma alternativa para seu diagnóstico e tratamento por terapia radioisotópica. Modificações moleculares na estrutura da BBN vêm sendo promovidas e os derivados produzidos têm apresentado bons resultados em estudos préclínicos. No entanto, todos os derivados estudados apresentaram alta captação abdominal e esta é a principal limitação do uso clínico da BBN, devido aos efeitos adversos aos pacientes. O objetivo deste trabalho foi radiomarcar uma nova série de derivados da bombesina com lutécio-177 e avaliar a relação entre sua estrutura e o potencial diagnóstico-terapêutico do câncer de próstata. Os peptídeos estudados apresentam estrutura genérica DOTA-Phe-(Gly)n-BBN(6-14), em que DOTA é o grupamento quelante, n é o número de aminoácidos glicina do espaçador Phe-(Gly)n e BBN(6-14) é a sequência original de aminoácidos da BBN do aminoácido 6 ao aminoácido 14. Estudos preliminares foram realizados a fim de avaliar a condição que conferia maior pureza radioquímica aos derivados radiomarcados, determinada por cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A estabilidade dos derivados radiomarcados foi avaliada após incubação à 2-8° C ou em soro humano à 37° C e o coeficiente de partição foi determinado em n-octanol:água. Estudos in vivo foram realizados em camundongos Balb-c sadios e Nude com tumor de células PC-3, a fim de caracterizar biologicamente os derivados da bombesina. Estudos in vitro envolveram a avaliação do efeito dos derivados não radiomarcados sobre a proliferação das células PC-3. A análise em ITLC-SG e CLAE revelou que todos os derivados da bombesina foram radiomarcados com alta pureza radioquímica. Os derivados radiomarcados apresentaram alta estabilidade à 2-8° C. A análise em soro humano indicou metabolismo tempodependente dos derivados pelas enzimas do soro e aumento da estabilidade com o acréscimo de aminoácidos glicina no espaçador após 4 horas de incubação, mas não após 24 horas. Os estudos em CLAE e de coeficiente de partição indicaram que os derivados da bombesina apresentam baixa lipossolubilidade, a qual decresce com o aumento do espaçador. Os derivados apresentaram rápido clareamento sanguíneo, rápida excreção, realizada primariamente por via renal, baixa retenção no organismo e baixo acúmulo abdominal nos estudos in vivo em camundongos Balb-c. Os estudos em camundongos Nude com tumor PC-3 mostraram a capacidade dos derivados de se ligar às células tumorais. Os dois peptídeos com maior espaçador apresentaram maior captação tumoral 1 hora após a administração endovenosa, mas o derivado com menor espaçador apresentou maior captação tumoral quatro e 24 horas após a administração. A ligação às células PC-3 in vivo mostrou ser específica e suficiente para a detecção do tumor por imagens cintilográficas, principalmente 30 minutos após a administração. Nos estudos in vitro, os derivados da bombesina estudados não apresentaram efeito proliferativo ou citotóxico sobre as células PC-3, o que os caracteriza como agonistas fracos ou antagonistas dos receptores para GRP. Os resultados deste trabalho mostraram, portanto, que todos os derivados estudados são promissores para aplicação in vivo. A maior captação tumoral dos derivados com maior espaçador na primeira hora após a administração indica que essas moléculas são os mais adequados para o diagnóstico por imagem de tumor de próstata. Já para aplicação em terapia radioisotópica, o derivado com menor espaçador é o mais adequado, devido à maior retenção tumoral. / Bombesin (BBN) receptors in particular, the gastrin-releasing peptide (GRP) receptor peptide have been shown to be massively overexpressed in several human tumors types, including prostate cancer, and could be an alternative as target for its treatment by radionuclide therapy (RNT). A large number of BBN analogs had already been synthesized for this purpose and have shown to reduce tumor growth in mice. Nevertheless, most of the studied analogs exhibit high abdominal accumulation, especially in pancreas. This abdominal accumulation may represent a problem in clinical use of radiolabeled bombesin analogs probably due to serious side effects to patients. The goal of the present work was to radiolabel a novel series of bombesin derivatives with lutetium-177 and to evaluate the relationship between their structure and diagnostic-therapeutic activity for prostate tumor. The generic structure of studied peptides is DOTA-Phe-(Gly)n-BBN(6-14), where DOTA is the chelator, n is the number of glycine amino acids of Phe-(Gly)n spacer and BBN(6-14) is the bombesin sequence from the amino acid 6 to the amino acid 14. Preliminary studies were done to establish the ideal labeling conditions for obtaining the highest yield of labeled bombesin derivatives, determined by instant thin layer chromatography (ITLC-SG) and high performance liquid chromatography (HPLC). The stability of the preparations was evaluated either after storing at 2-8º C or incubation in human serum at 37º C and the partition coefficient was determined in n:octanol:water. In vivo studies were performed in both healthy Balb-c and Nude mice bearing PC-3 xenografts, in order to characterize the biological properties of labeled peptides. In vitro studies involved the evaluation of cold bombesin derivatives effect in PC-3 cells proliferation. Bombesin derivatives were successfully labeled with high yield at optimized conditions and exhibited high stability at 4ºC. The analysis of the stability in human serum suggested a time-course metabolic degradation of labeled peptides by serum enzymes. The addition of four glycine amino acids in the spacer of bombesin derivatives resulted in slower degradation by human serum enzymes after 4 hours of incubation. HPLC and partition coefficient studies showed that bombesin derivatives present low lipophilicity and the increase of glycine amino acids number in peptides spacers slightly reduced their lipophilicity. The radiolabeled bombesin derivatives presented fast blood clearance, rapid excretion, performed mainly by renal pathway, and low abdominal accumulation in in vivo studies in Balb-c mice. Investigations in Nude mice bearing PC-3 tumor showed that the radiopeptides can target tumor cells. Higher tumor uptake was observed with the derivatives of larger spacers at 1 hour post injection, but higher tumor retention after 4 and 24 hours was observed with the derivative of smaller spacer. In addition, tumor uptake showed to be specific and allowed tumor detection by scintigraphy imaging, especially 30 minutes post injection. In addition, the studied bombesin derivatives did not present proliferative or cytotoxic effect to PC-3 cells in vitro and can be characterized as weak agonists or antagonists of bombesin receptors. The results of this work showed that phenyl-glycine extended bombesin derivatives are promising for in vivo applications. The higher tumor uptake of derivatives with larger spacer suggests that these molecules are more applicable in diagnostic procedures. The derivative with smaller spacer is more useful to be applied in radionuclide therapy, because of its higher tumor retention.

A radioimunoterapia tem se mostrado uma modalidade terapêutica promissora, especialmente para terapia de tumores hematológicos o que tem impulsionado o desenvolvimento deste tipo de radiofármaco. Existe hoje apenas um radioimunoconjugado aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA), ibritumomabe-tiuxetan-90Y (Zevalin®), e ele apresenta maior taxa de resposta global e de remissão completa quando comparados aos tratamentos convencionais. Entretanto, nenhum deles é comercialmente disponível no Brasil. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar as etapas envolvidas no processo de conjugação e radiomarcação com Lu-177 do anticorpo monoclonal anti-CD20, de forma que fosse possível consolidar nacionalmente a metodologia para desenvolvimento de outros radioimunoconjugados. Nos estudos realizados para determinar a melhor razão molar anticorpo:quelante (DOTA), a razão molar 1:50, apresentou pureza radioquímica elevada (superior a 95%, após a purificação) e imunorreatividade superior a muitos estudos publicados. Além disto, o imunoconjugado apresentou estabilidade de, no mínimo 3 meses, sob refrigeração quando conjugado por dois métodos diferentes. O estudo dos parâmetros de radiomarcação permitiu a obtenção de um radioimunoconjugado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade suficientemente longa que permitirá seu transporte às clínicas médicas. Os perfis de biodistribuição e farmacocinético foram compatíveis com outros radioimunoconjugados encontrados na literatura. O radioimunoconjugado apresentou captação tumoral e estabilidade in vivo apreciáveis, esta última evidenciada pela baixa captação óssea. Realizaram-se estudos de liofilização da formulação aperfeiçoada do imunoconjugado que promoveram a liofilização sem dano estrutural evidenciado por eletroforese em gel de poliacrilamida com manutenção da imunorreatividade. A pureza radioquímica foi acima de 95% (após purificação) quando radiomarcado com atividade específica de 740 MBq/mg, com estabilidade relevante quando armazenado à -20 °C por até 48 horas. Foi possível não somente padronizar as metodologias de conjugação e radiomarcação de anticorpos monoclonais, mas também aprimorá-las de forma que o radioimunoconjugado produzido foi superior em muitos aspectos quando comparado com a literatura publicada. Conclui-se, portanto, que o radioimunoconjugado anti-CD20-DOTA-177Lu é uma ferramenta promissora para o tratamento de tumores linfáticos que expressam o receptor CD20. / The radioimmunotherapy (RIT) has proven to be a promising therapeutic modality, especially for therapy of hematological malignancies, which has stimulated the development of this type of radiopharmaceutical. Currently, there is one radioimmunoconjugated approved by Food and Drug Administration (FDA) for refractory or relapsed non-Hodgkin lymphoma (NHL) therapy, 90Y-ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), and it has higher overall response and complete remission rates compared to conventional treatments. However, Zevalin® is not commercially available in Brazil. In this context, the goal of this work was to study the steps involved in the process of conjugation and radiolabeling with Lu-177 of anti-CD20 monoclonal antibody, in order to consolidate the in house methodology for development of this radioimmunoconjugate, contributing for the treatment of patients with NHL and also contributing for the future development of other radioimmunoconjugates. In the studies performed to determine the best antibody: chelator (DOTA) molar ratio, the molar ratio 1:50, showed high radiochemical purity (greater than 95% after purification) and the immunoreactivity was higher than many published studies. Additionally, the immunoconjugate was stable for, at least, 3 months under refrigeration when conjugated by two different methods. The study of radiolabeling parameters, produced a radioimmunoconjugate with specific activity of 740 MBq/mg, with adequate stability that allowed the transportation of the radiopharmaceutical to nuclear medicine centers. The biodistribution and pharmacokinetic profiles were consistent with other radioimmunoconjugates in the literature. The radioimmunoconjugate showed tumor uptake and in vivo stability appreciable, the latter evidenced by low bone uptake. The lyophilization studies were performed for the optimized formulation of immunoconjugate that allowed the lyophilization without structural damage, evidenced by polyacrylamide gel electrophoresis, and with maintenance of immunoreactivity. The radiochemical purity was above 95% (after purification) when radiolabeled with a specific activity of 740 MBq/mg, with significant stability when stored at -20 ° C for 48 hours. It was possible, not only to standardize the conjugation of the monoclonal antibody and radiolabelling methodologies, but also improve them so that the radioimmunoconjugate produced was superior in many aspects when compared with the published literature. In conclusion, the radioimmunoconjugate 177Lu-DOTA-anti-CD20 is a promising tool for the therapy of tumors that express CD20.

Este trabalho apresenta dois modelos baseados em análise compartimental: modelo Animal e modelo Humano, usando imagens obtidas com mini gama câmera e dados de pacientes (obtidos da literatura) para a determinação das constantes cinéticas na biodistribuição do 177Lu-DOTATATO para três espécies animais (rato Wistar, hamster armênio e hamster sírio) e para o Humano. Os estudos de biodistribuição consideraram duas fases: a Fase 1, governada pela transferência do sangue para os órgãos e a Fase 2 governada pela excreção renal. As constantes cinéticas calculadas a partir dos dados obtidos com os animais foram usadas para a construção de escalas alométricas para prever a biodistribuição do radiofármaco 177Lu-DOTATATO empregando relações de massa, metabolismo, longevidade e parâmetros fisiológicos. Os resultados de extrapolação foram comparados com resultados calculados diretamente para os pacientes de PRRT (Peptide Receptor Radiotherapy) usando o modelo Humano. As constantes cinéticas calculadas a partir dos dados obtidos com humanos foram usadas para estimativa de dose em pacientes de PRRT considerando 26 órgãos e tecidos considerados pelo método MIRD. Os resultados de dosimetria foram concordantes com aqueles disponíveis na literatura. Para a Fase 1, as relações alométricas para as constantes cinéticas dos principais órgãos envolvidos no metabolismo e excreção do 177Lu-DOTATATO - fígado, rins e bexiga - mostraram boa correlação na projeção por massa, por metabolismo e por parâmetros fisiológicos. Para a Fase 2, apenas as constantes do sangue para os rins e do sangue para o fígado apresentaram boa correlação. Considerando o efeito de bloqueio da excreção renal pelo uso de anestésico, não se justificam tempos de medição maiores que 40 minutos para estudos in vivo, em pequenos animais. Dessa maneira, os resultados obtidos com as medições da Fase 1 da biodistribuição do 177Lu-DOTATATO em animais se apresentam como suficientes para estabelecer relações alométricas para estimativa de dose em pacientes submetidos à PRRT. / This work proposes two models based in compartimental analyses: Animal model and Human model, using images from gamma camera measurements to determinate the kinetic constants of the 177Lu-DOTATATE to three animal species (rat Wistar, Armenian hamster and Syrian hamster) and to the human in biodistridution studies split in two phases: Phase 1 governed by uptake from the blood and Phase 2 governed by the real excretion. The kinetic constants obtained from the animals data were used to build allometric scaling to predict radiopharmaceutical biodistribution in the human employing relations by mass, metabolism, by life span and by physiological parameters. These extrapolation results were compared with the PRRT (Peptide receptor radiotherapy) patients kinetic data calculated using the Human model. The kinetic constants obtained from humans were used in dose assessment to PRRT patients considering MIRD 26 organs and tissues. Dosimetry results were in agreement with available results from literature. For the Phase 1 allometric scaling from kinetic data from the blood to the organs straight responsible for the 177Lu-DOTATATO metabolism and excretion - liver, kidneys and urinary bladder -show good correlation in the scaling by mass, metabolism and physiological and parameters. For the Phase 2, only the kinetic data from blood to the liver and to the kidneys show good correlation. Based in the anaesthetics inhibitory action over the renal excretion, there is not empirical basis to allow measurement times over 40 minutes in in vivo studies with small animals. Consequently, the Phase 1 results seem enough to make allometric scaling to assessment dose in PRRT.

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