In this work we expanded upon a study from our group where a ligand-based TNF-α mutein was developed to engage specifically TNFR2 and not TNFR1 activating Tregs and expanding them, which in an allo-HCT context conferred protection from GvHD. Fusing TNF trimers to the heavy chain of an Fc-dead and mouse irrelevant antibody, a new generation of this agonist was developed called NewSTAR2. It is believed that other members of the TNFSF can also target Tregs, therefore additional agonists against DR3 and GITR were developed under the same principles as for NewSTAR2. Phenotyping analysis of the expression of these three receptors were done to confirm their specificity for Tregs before in vitro and in vivo testings with mice or murine splenic cells. A potent expansion of Tregs was seen with NewSTAR2 and the other agonists as well as upregulation of activation markers on Tregs. Thorough analyses with NewSTAR2-treated mice showed how Tregs in several immune and non-immune organs were expanded and upregulated immunomodulatory receptors. A miniature suppressive assay and other cocultures with responder cells confirmed their enhanced suppression over unstimulated Tregs through contact dependent and independent mechanisms. Despite other myeloid cells also being increased after treatment, no undesired effects were observed under steady-state and prophylactic administration of a single dose of NewSTAR2 improved survival frequencies and lessened development of clinical symptoms. Prophylactic treatment with the other TNFRSF agonists showed similar protection yet Fc(DANA)-muTL1A was superior in in terms of less death events and lower clinical score. It was found that not all the three TNFSF members have redundant functions as development of skin lesions was observed with GITRL-based agonist Fc(DANA)-muGITRL, although its expansion of Tregs in steady-state was remarkable with no apparent adverse effects. Neither agonist had an impact on donor cell engraftment or allorective T cell response, however NewSTAR2-treatmend proved to reduce inflammation in small intestine and liver. This work is proof of concept of the effectivity of selectively engaging TNFSF to activate Tregs and expand them systemically allowing them to control strong and complex immune interactions like those governing GvHD. / In dieser Arbeit erweiterten wir eine Studie unserer Gruppe, in der ein ligandenbasiertes TNF-α-Mutein entwickelt wurde, um spezifisch TNFR2 und nicht TNFR1 zu aktivieren und Tregs zu erweitern, was in einem allo-HCT-Kontext Schutz vor GvHD verlieh. Durch die Fusion von TNF-Trimeren mit der schweren Kette eines Fc-toten und Maus-irrelevanten Antikörpers wurde eine neue Generation dieses Agonisten namens NewSTAR2 entwickelt. Es wird angenommen, dass andere Mitglieder des TNFSF ebenfalls auf Tregs abzielen können. Daher wurden zusätzliche Agonisten gegen DR3 und GITR nach denselben Prinzipien wie für NewSTAR2 entwickelt. Eine phänotypische Analyse der Expression dieser drei Rezeptoren wurde durchgeführt, um ihre Spezifität für Tregs vor In-vitro- und In-vivo-Tests mit Mäusen oder murinen Milzzellen zu bestätigen. Bei NewSTAR2 und den anderen Agonisten wurde eine starke Expansion der Tregs sowie eine Hochregulierung der Aktivierungsmarker auf Tregs beobachtet. Gründliche Analysen mit NewSTAR2-behandelten Mäusen zeigten, wie Tregs in mehreren Immun- und Nichtimmunorganen erweitert und immunmodulatorische Rezeptoren hochreguliert wurden. Ein Miniatur-Suppressionstest und andere Kokulturen mit Responderzellen bestätigten deren verstärkte Unterdrückung nicht stimulierter Tregs durch kontaktabhängige und unabhängige Mechanismen. Obwohl auch andere myeloische Zellen nach der Behandlung zunahmen, wurden unter der Steady-State- und prophylaktischen Verabreichung einer Einzeldosis NewSTAR2 keine unerwünschten Wirkungen beobachtet, was die Überlebenshäufigkeit verbesserte und die Entwicklung klinischer Symptome verringerte. Die prophylaktische Behandlung mit den anderen TNFRSF-Agonisten zeigte einen ähnlichen Schutz, Fc(DANA)-muTL1A war jedoch in Bezug auf weniger Todesereignisse und einen niedrigeren klinischen Score überlegen. Es wurde festgestellt, dass nicht alle drei TNFSF-Mitglieder über redundante Funktionen verfügen, da die Entwicklung von Hautläsionen mit dem GITRL-basierten Agonisten Fc(DANA)-muGITRL beobachtet wurde, obwohl die Expansion der Tregs im Steady-State bemerkenswert war und keine offensichtlichen nachteiligen Auswirkungen auftrat. Keiner der beiden Agonisten hatte einen Einfluss auf die Transplantation von Spenderzellen oder die allorektive T-Zell-Reaktion, allerdings reduzierte die NewSTAR2-Behandlung nachweislich Entzündungen im Dünndarm und in der Leber. Diese Arbeit ist ein Beweis für die Wirksamkeit der selektiven Aktivierung von TNFSF, um Tregs zu aktivieren und sie systemisch zu erweitern, sodass sie starke und komplexe Immuninteraktionen steuern können, wie sie GvHD steuern.

Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar. Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann. Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden. Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen. Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit. Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt. Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α. / Infections caused by C. albicans on mucosal surfaces are a common disease in patients suffering from suppression of the T cell immune defense. Blood stream infections by the yeast C. albicans (candedemia) represent still a severe complication in patients in intensive care units with high rates of lethality. The pH-regulated antigen 1 (Pra1) is a protein produced by C. albicans which is present on the surface of the fungi and is secreted into the supernatant of fungal cultures as well. Pra1 can bind to human T cells via the surface protein CD46. It is known, that this protein can also bind to certain immune cells of mice (monocytes and phagocytes). Binding to T cells of mice is not yet known. A characterization of the interaction of Pra1 with immune cells of mice would be valuable, because mice act as a biological model system for the investigation of infections with C. albicans. In this paper, it could be shown that recombinant Pra1 (rPra1) can bind to mouse CD4+ T cells as well. After the finding that rPra1 can bind to CD4+ T cells, different parameters determining this binding have been studied. Zinc was found to be one influencing factor on the binding. Pra1 can bind free zinc ions and by the addition of ZnCl2 while incubating T cells with Pra1 the signal of bound Pra1 to CD4+ T cells could be increased. Aspf2, a protein from Aspergillus fumigatus with high homology to Pra1, was not able to bind to these cells. In in-vivo-experiments with animals infected with C. albicans, no wild-typic secreted Pra1 was found bound to T cells. Supernatant from C. albicans cultures produced, after incubation in vitro, a signal for cell-bound Pra1 on CD4+ T cells. Kinetics of the binding of rPra1 to T cells showed a constant increase of signal over the time of incubation. The off-kinetics revealed a decrease of cell-bound rPra1 over time to the edge of detectability. The receptor of Pra1 on T cells has not been identified yet. The structurally and functionally comparable surface proteins Crry, CD59a and CD55 were tested in knockout mice for each of these proteins and could be excluded as possible receptors. After binding of secreted Pra1 to neutrophilic granulocytes these cells experience a decreased capacity to phagocytose pathogens. The binding of Pra1 to CD4+ T cells leads to a costimulation of T cells, which results in increased cell activation and proliferation. This costimulatory capacity of Pra1 can be augmented by adding 10 μM zinc chloride. During activation of naïve CD4+ T cells Pra1 reduces the secretion of IFN-γ. The reduction of IFN-γ-producing cells is not due to an influence of Pra1 during cell activation of naive CD4+ T cells to Th1 cells and is also not due to induction of apoptosis in IFN-γ-producing Th1 cells. The binding of Pra1 to ex-vivo isolated CD4+ T cells reduces the in vitro secretion of IFN-γ after stimulating these cells via their T cell receptor. Additionally, the secretion of IL-2 and TNF-α was reduced.

Neuere Untersuchungen legen eine kardioprotektive Rolle für den Angiotensin AT2-Rezeptor nahe, welcher die Postinfarkt-Entzündungsreaktion vermindert, wobei der zelluläre Mechanismus noch wenig verstanden ist. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die potentielle Rolle des AT2-Rezeptors in der zellulären Immunantwort auf ischemische Herzverletzungen zu ergründen. Sieben Tage nach myokardialem Infarkt in Ratten wurde der AT2-Rezeptor mittels Immunfluoreszenzfärbung von Gewebeschnitten in einer CD8 T-Zellfraktion detektiert, die das Peri-Infarkt-Myokard infiltiert hatte. Wir haben eine Methode entwickelt, die es mittels kombinierter MACS und FACS Technilogie ermöglicht, CD8+AT2R+ T-Zellen aus dem Myokard zu isolieren und zu analysieren. Im Gegensatz zu den CD8+AT2R- T-Zellen, die in Kultur sowohl auf adulte als auch auf fötale Kardiomyozyten stark zytotoxisch wirkten, zeigten die CD8+AT2R+ T-Zellen keinerlei Zytotoxizität. Die CD8+AT2R+ T-Zellen zeigten eine erhöhte Expression von IL-10 und eine geringere mRNA Expression von IL-2 und IFN-gamma im Vergleich zu CD8+AT2R-T-Zellen. Weiterhin konnten wir zeigen, dass in vitro Stimulation des AT2-Rezeptors zur Hochregulation der IL-10-Expression von CD8+ T-Zellen führt. Entsprechend führt die in vivo Aktivierung des AT2-Rezeptors zur Vergrößerung der CD8+AT2R+ T-Zellpopulation und erhöhter IL-10-Produktion im ischemischen Myokard. Diese CD8+AT2R+ T-Zellen konnten auch in humanem periphärem Blut detektiert werden. Wir haben eine CD8+AT2+T-Zellpopulation definiert, welche sich während ischemischer Herzverletzung vergrößert und das Kardiomyocytenüberleben mittels kardioprotektivem IL-10 aufrechterhält. Somit konnten wir einen neuartigen AT2-Rezeptorvermittelten zellulären Mechanismus aufdecken, welcher die adaptive Immunantwort im Herzen moduliert. / One important aspect of cardiac remodeling after myocardial infarction is the activation of an immune response, which removes death cardiomyocytes and initiates scar formation. On the other hand, activation and infiltration of immunocompetent cells are responsible for augmenting damage in non-infarcted areas. Emerging evidence suggests a cardioprotective role of the angiotensin AT2R by attenuating this post-infarct inflammatory reaction, albeit the underlying cellular mechanisms are not well understood. We aimed here at elucidating a potential role of the cardiac angiotensin AT2R in regulating the cellular immune response to ischemic heart injury. Seven days after myocardial infarction in rats, immunofluorescence staining of tissue sections showed that AT2R was detected in a fraction of CD8+ T cells infiltrating the peri-infarct myocardium. We developed a method that allowed the isolation and characterization of CD8+AT2R+ T cells infiltrating the myocardium via combined MACS and FACS technology. While the CD8+AT2R- T cells exhibited potent cytotoxicity to both adult and fetal cardiomyocytes in vitro, the CD8+AT2R+ T cells were non-cytotoxic to these cardiomyocytes. The CD8+AT2R+ T cells were characterized by upregulated IL-10 and downregulated IL-2 and INF-gamma gene expression when compared to CD8+AT2R- T cells. We further showed that IL-10 gene expression was enhanced in CD8+ T cells upon in vitro AT2R stimulation. In addition, in vivo AT2R activation leads to an increment of the CD8+AT2R+ T cells and IL-10 production in the ischemic myocardium. Moreover, the CD8+AT2R+ T cell population was also detected in human peripheral blood. We have defined a CD8+ T cell population that expresses AT2R and increases during ischemic heart injury. This population sustains cardiomyocyte viability by providing cardioprotective IL-1 via a novel AT2R-mediated cellular mechanism for modulating adaptive immune response in the heart.

In this work, the influence of the second messenger cAMP on the functional plasticity of M-DC8+ dendritic cells (DC) was examined. The marker M-DC8 defines a population of native DC first described in blood. After their isolation, M-DC8+ DC acquire a mature CD83+ phenotype during a short culture ex vivo. After a challenge with LPS and IFN-g, M-DC8+ DC secrete large amounts of the proinflammatory cytokines IL-12(p70) and TNF-a surpassing by far other DC populations and monocytes. Due to their preferential induction of TH1-dominated T cell responses, M-DC8+ DC might play a role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Different cAMP-elevating agents suppressed the proinflammatory cytokine production and enhanced the secretion of anti-inflammatory IL-10. Activity of phosphodiesterase (PDE) 4, the most important cAMP-hydrolysing enzyme in immune cells, was detected and RT-PCR revealed the expression of PDE4 subtypes 4A, 4B and 4D in M-DC8+ DC, whereas 4C was not detectable. The PDE4-specific inhibitors AWD12-281 and Roflumilast were then used to elevate cAMP concentrations. These substances have been proven to be efficient in anti-inflammatory therapies. In the presence of PDE4 inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12 and TNF-a was decreased by 90 % and 60 %, respectively, whereas the IL-10-release was doubled. These effects were only observed, if the PDE4 inhibitors where present from the beginning of the culture. The inhibition of the IL-12 secretion was reverted using an a-IL-10-receptor antibody. PDE4 inhibitor-treated M-DC8+ DC showed a reduced capacity to polarize TH1-cells, which was demonstrated analysing culture supernatants by ELISA and by single-cell analysis detecting intracellular IFN-g und IL-4. These results suggest that PDE4 inhibitors may not only be useful in the therapy of TH2-mediated diseases but also in TH1-dominated indications such as multiple sclerosis and Crohn´s disease. Despite the shift of the cytokine profile, the in vitro maturation of M-DC8+ DC was not affected by PDE4 inhibitors. The expression of CD83, CD80, CD86, MHC-molecules as well as CD54 and CD58, was assessed by FACS analysis. Correspondingly, in the presence of AWD12-281, M-DC8+ DC efficiently stimulated the proliferation of allogeneic CD4+CD45RA+ T-cells. In the second part of this study, the effects of an inhibition of cAMP-synthesis in M-DC8+ DC were analyzed. Two adenylyl cyclase (AC) inhibitors, 2,5-Dideoxyadenosine and SQ22536, clearly hampered the in vitro maturation of M-DC8+ DC. The expression of the DC maturation marker CD83 could be reconstituted using the stable cAMP-analogon 8-Br-cAMP. Measuring the intracellular cAMP concentration in M-DC8+ DC, initially low cAMP-levels were observed, but within 30 min the concentration raised and returned to original levels within 2 hrs. Blocking the cAMP synthesis by AC inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12, TNF-a and IL-10 was strongly reduced. Furthermore, it was demonstrated that M-DC8+ DC can only release IL-12 after a transient elevation of cAMP, i.e. they acquire a "license". Such a regulation of the IL-12 production has not been described before. Protein kinase A is an important effector molecule of cAMP. Inhibiting its activity resulted in a reduced expression of the DC maturation marker CD83 and a lower cytokine production underlining the importance of cAMP-signalling for the activation of M-DC8+ DC. In conclusion, this study provides evidence for a new concept of the immune-regulatory function of cAMP. Here, cAMP is essentially involved in the initial activation and maturation of DC and enables them to secrete large amounts of IL-12 and TNF-a upon stimulation with a TLR ligand. Conversely, a long-term elevation of cAMP-concentrations inhibits the proinflammatory effector functions of M-DC8+ DC and can induce anti-inflammatory responses by enhancing the secretion of IL-10. / In dieser Arbeit wurde der Einfluss des second messengers cAMP auf die funktionelle Plastizität von M-DC8+ dendritischen Zellen (DC) untersucht. Der Oberflächenmarker M-DC8 definiert eine zunächst im Blut beschriebene Population nativer DC. Nach ihrer Isolation erlangen M-DC8+ DC während einer kurzen Kultur einen maturen CD83+ Phänotyp. Nach Stimulation mit LPS und IFN-g produzieren native M-DC8+ DC deutlich höhere Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12(p70) und TNF-a als andere DC-Populationen oder Monozyten. Dies resultiert in einer Programmierung TH1-dominierter T-Zellantworten. M-DC8+ DC könnten daher an der Pathogenese entzündlicher Krankheiten beteiligt sein. Unterschiedliche cAMP-erhöhende Substanzen supprimierten die proinflammatorische Zytokinproduktion und verstärkten gleichzeitig die Sekretion des anti-inflammatorischen IL-10. In M-DC8+ DC konnte die Aktivität von Phosphodiesterase (PDE) 4, dem wichtigsten cAMP-hydrolysierenden Enzym in Immunzellen, nachgewiesen werden. Durch RT-PCR wurde die Expression der PDE4-Subtypen 4A, 4B und 4D gezeigt, nicht aber 4C. Zur Erhöhung der cAMP-Konzentration wurden dann die PDE4-spezifischen Inhibitoren AWD12-281 und Roflumilast eingesetzt, deren klinische Effizienz bei anti-inflammatorischen Therapien belegt ist. Auch diese Substanzen verringerten die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12 und TNF-a durch M-DC8+ DC um 90 % bzw. 60 %, während die IL-10-Freisetzung etwa verdoppelt wurde. Diese starken Effekte konnten nur erzielt werden, wenn die PDE4-Inhibitoren von Beginn der Kultur an eingesetzt wurden. Die Hemmung der IL-12-Sekretion wurde in Gegenwart eines a-IL-10-Rezeptor-Antikörpers aufgehoben. Unter dem Einfluss von PDE4-Inhibitoren war die TH1-Programmierung durch M-DC8+ DC deutlich reduziert, was sowohl durch die Analyse der Zellüberstände mittels ELISA als auch auf Einzelzell-Ebene durch intrazelluläre Detektion von IFN-g und IL-4 nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PDE4-Inhibitoren nicht nur für TH2-vermittelte Erkrankungen sondern auch für TH1-dominierte Indikationen wie Multiple Sklerose oder Morbus Crohn von Nutzen sein könnten. Trotz der starken Modulation des Zytokinprofils blieb die in vitro-Ausreifung M-DC8+ DC unbeeinflusst von PDE4-Inhibitoren. Untersucht wurde die Expression von CD83, CD80, CD86, MHC-Molekülen, CD54 und CD58 mittels FACS-Analyse. Entsprechend induzierten M-DC8+ DC auch in Anwesenheit von AWD12-281 die Proliferation allogener CD4+CD45RA+ T-Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Blockade der cAMP-Synthese auf M-DC8+ DC auswirkt. Zwei Adenylatcyclase-Inhibitoren, 2,5-Dideoxyadenosine und SQ22536, hemmten die in vitro-Maturation von M-DC8+ DC deutlich. Die CD83-Expression wurde mit 8-Br-cAMP rekonstituiert. Messungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in unbehandelten M-DC8+ DC zeigten initial niedrige cAMP-Spiegel, die innerhalb von 30 min anstiegen und nach 2 h wieder auf das Ausgangsniveau abfielen. Die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12, TNF-a und IL-10 wurde durch AC-Inhibitoren deutlich vermindert. M-DC8+ DC erhalten nur nach einer transienten cAMP-Erhöhung die "Lizenz" IL-12 freizusetzen. Eine derartige Regulation der IL-12-Sekretion ist bisher nicht beschrieben. Eine Hemmung des cAMP-Effektormoleküls Proteinkinase A resultierte in der reduzierten Expression des DC-Maturationsmarkers CD83 und einer verringerten Zytokinproduktion. Dies unterstreicht die Bedeutung von cAMP für die Aktivierung M-DC8+ DC. Zusammenfassend gibt diese Arbeit am Beispiel nativer humaner DC Anhalt für ein neues Konzept der immunregulatorischen Funktion von cAMP. Hierbei ist cAMP wesentlich an der Ausreifung von M-DC8+ DC beteiligt, woraufhin diese große Mengen IL-12 und TNF-a sekretieren können. Dagegen wirkt eine langfristige cAMP-Erhöhung durch die Induktion von IL-10 anti-inflammatorisch.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet umfangreiche histologische Untersuchungen an verschiedenen Tumoren bezüglich ihrer Infiltration durch Makrophagen-Subpopulationen, Granulozyten und Lymphozyten. Hierfür wurden 18 Gewebe-Mikroarrays mit jeweils 200 - 300 Tumorstanzen aus insgesamt 27 Organen des Gastrointestinaltraktes, des Urogenitaltraktes, des Respirationssystems und des endokrinen Systems angefertigt. Da alle Proben mit derselben Technik (Gewebe-Mikroarrays, Immunhiostochemie) ausgewertet wurden, bestand nun erstmalig die Möglichkeit eines direkten Vergleiches zwischen den verschiedenen Tumoren unterschiedlicher Organe. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden fünf verschiedene Antikörper (anti-KP1, anti-PG-M1, anti-MRP8, anti-MRP14, anti-MRP8/14) eingesetzt. Die Antikörper gegen die Epitope PG-M1 und KP1 gelten als Pan-Makrophagen-Marker. Die Antikörper anti-MRP8, anti-MRP14 und anti-MRP8/14 gelten als Marker für entzündlich aktivierte Makrophagen. Diese Makrophagen wurden in einen aktiven inflammatorischen Typ (MRP14+, MRP8/14+), der proinflammatorische Zytokine wie TNF-a und Sauerstoffradikale bildet, und in einen chronisch inflammatorischen Typ (MRP8+) eingeteilt. Die Formation des MRP8/14-Heterodimers korreliert mit der zellulären Aktivierung wie z. B. mit der Aktivierung der NADPH-Oxidase. Es wurde beschrieben, dass diese Makrophagen auf Grund ihrer Eigenschaften eventuell die Tumorzellproliferation inhibieren und zytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen ausüben können. Für die verschiedenen Tumorgewebe wurden höhere Makrophagendichten im Vergleich zum Normalgewebe und eine vergleichsweise geringe Dichte an MRP+ Makrophagen sowie signifikante Korrelationen zwischen den verschiedenen Makrophagen-Subpopulationen festgestellt. Die Dichte der Lymphozyten korrelierte negativ mit steigendem Tumorzellanteil und mit fortgeschrittenem Tumorstadium. Die Abnahme der Lymphozyten (Gastrointestinal- und Respirationstrakt) im Tumorgewebe im Vergleich zum tumorfreien Gewebe sowie die geringe Anzahl der potenziell tumoriziden MRP8/14+ Makrophagen lässt vermuten, dass die Immunantwort gegen den Tumor unterdrückt wird. Die positive Assoziation zwischen Makrophagen und Lymphozyten weist jedoch darauf hin, dass Makrophagen nicht am Rückgang der Lymphozyten beteiligt sind . Eine Korrelation der Makrophagen mit klinisch relevanten Parametern (pT-Stadium, UICC-Stadium, Lymphknotenmetastasen) zeigten ein voneinander abweichendes Infiltrationsmuster der CD68+ und MRP+ Makrophagen, was auf unterschiedliche Funktionen hinweist. Ferner liegen zahlreichen funktionelle Untersuchungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen vor, welche darauf hinweisen, dass Makrophagen durch Hypoxie angezogen werden und im hypoxischen Tumorgewebe schließlich an der Neubildung von Blut- und Lymphgefäßen beteiligt sind. Um einen möglichen Zusammenhang zu zeigen, wurde mit den Antikörpern anti-CD31 und anti-CD34 die Gefäßdichte in Tumoren untersucht. Es zeigten sich zahlreiche positive Korrelationen zwischen Gefäßen und Makrophagen, jedoch konnte in den tumorfreien Geweben kein Zusammenhang zwischen beiden Größen gefunden werden. Das Vorkommen größerer Makrophagendichten in Tumoren mit wenig Nekrose als in Tumoren ohne Nekrose, die positive Korrelation zwischen der Anzahl der Gefäße und der Zahl der Makrophagen in Tumoren und die Unabhängigkeit von Makrophagen und Gefäßen im tumorfreien Gewebe legt die Vermutung nahe, dass TAM die Angiogenese begünstigen. Trotz vieler ähnlicher Charakteristika zwischen den Tumoren unterschiedlichen Ursprungsgewebes wurden auch Unterschiede festgestellt, die besonders die Anzahl der Makrophagen-Subpopulationen betreffen. Weitere Studien zur Aufklärung der Funktion unterschiedlicher Makrophagen-Subpopulationen (z. B. Immunsuppression, Neoangiogenese) sind notwendig, um deren Relevanz für das Tumorwachstum und die Tumorprogression aufzuklären.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet umfangreiche histologische Untersuchungen an verschiedenen Tumoren bezüglich ihrer Infiltration durch Makrophagen-Subpopulationen, Granulozyten und Lymphozyten. Hierfür wurden 18 Gewebe-Mikroarrays mit jeweils 200 - 300 Tumorstanzen aus insgesamt 27 Organen des Gastrointestinaltraktes, des Urogenitaltraktes, des Respirationssystems und des endokrinen Systems angefertigt. Da alle Proben mit derselben Technik (Gewebe-Mikroarrays, Immunhiostochemie) ausgewertet wurden, bestand nun erstmalig die Möglichkeit eines direkten Vergleiches zwischen den verschiedenen Tumoren unterschiedlicher Organe. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden fünf verschiedene Antikörper (anti-KP1, anti-PG-M1, anti-MRP8, anti-MRP14, anti-MRP8/14) eingesetzt. Die Antikörper gegen die Epitope PG-M1 und KP1 gelten als Pan-Makrophagen-Marker. Die Antikörper anti-MRP8, anti-MRP14 und anti-MRP8/14 gelten als Marker für entzündlich aktivierte Makrophagen. Diese Makrophagen wurden in einen aktiven inflammatorischen Typ (MRP14+, MRP8/14+), der proinflammatorische Zytokine wie TNF-a und Sauerstoffradikale bildet, und in einen chronisch inflammatorischen Typ (MRP8+) eingeteilt. Die Formation des MRP8/14-Heterodimers korreliert mit der zellulären Aktivierung wie z. B. mit der Aktivierung der NADPH-Oxidase. Es wurde beschrieben, dass diese Makrophagen auf Grund ihrer Eigenschaften eventuell die Tumorzellproliferation inhibieren und zytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen ausüben können. Für die verschiedenen Tumorgewebe wurden höhere Makrophagendichten im Vergleich zum Normalgewebe und eine vergleichsweise geringe Dichte an MRP+ Makrophagen sowie signifikante Korrelationen zwischen den verschiedenen Makrophagen-Subpopulationen festgestellt. Die Dichte der Lymphozyten korrelierte negativ mit steigendem Tumorzellanteil und mit fortgeschrittenem Tumorstadium. Die Abnahme der Lymphozyten (Gastrointestinal- und Respirationstrakt) im Tumorgewebe im Vergleich zum tumorfreien Gewebe sowie die geringe Anzahl der potenziell tumoriziden MRP8/14+ Makrophagen lässt vermuten, dass die Immunantwort gegen den Tumor unterdrückt wird. Die positive Assoziation zwischen Makrophagen und Lymphozyten weist jedoch darauf hin, dass Makrophagen nicht am Rückgang der Lymphozyten beteiligt sind . Eine Korrelation der Makrophagen mit klinisch relevanten Parametern (pT-Stadium, UICC-Stadium, Lymphknotenmetastasen) zeigten ein voneinander abweichendes Infiltrationsmuster der CD68+ und MRP+ Makrophagen, was auf unterschiedliche Funktionen hinweist. Ferner liegen zahlreichen funktionelle Untersuchungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen vor, welche darauf hinweisen, dass Makrophagen durch Hypoxie angezogen werden und im hypoxischen Tumorgewebe schließlich an der Neubildung von Blut- und Lymphgefäßen beteiligt sind. Um einen möglichen Zusammenhang zu zeigen, wurde mit den Antikörpern anti-CD31 und anti-CD34 die Gefäßdichte in Tumoren untersucht. Es zeigten sich zahlreiche positive Korrelationen zwischen Gefäßen und Makrophagen, jedoch konnte in den tumorfreien Geweben kein Zusammenhang zwischen beiden Größen gefunden werden. Das Vorkommen größerer Makrophagendichten in Tumoren mit wenig Nekrose als in Tumoren ohne Nekrose, die positive Korrelation zwischen der Anzahl der Gefäße und der Zahl der Makrophagen in Tumoren und die Unabhängigkeit von Makrophagen und Gefäßen im tumorfreien Gewebe legt die Vermutung nahe, dass TAM die Angiogenese begünstigen. Trotz vieler ähnlicher Charakteristika zwischen den Tumoren unterschiedlichen Ursprungsgewebes wurden auch Unterschiede festgestellt, die besonders die Anzahl der Makrophagen-Subpopulationen betreffen. Weitere Studien zur Aufklärung der Funktion unterschiedlicher Makrophagen-Subpopulationen (z. B. Immunsuppression, Neoangiogenese) sind notwendig, um deren Relevanz für das Tumorwachstum und die Tumorprogression aufzuklären.

In this work, the influence of the second messenger cAMP on the functional plasticity of M-DC8+ dendritic cells (DC) was examined. The marker M-DC8 defines a population of native DC first described in blood. After their isolation, M-DC8+ DC acquire a mature CD83+ phenotype during a short culture ex vivo. After a challenge with LPS and IFN-g, M-DC8+ DC secrete large amounts of the proinflammatory cytokines IL-12(p70) and TNF-a surpassing by far other DC populations and monocytes. Due to their preferential induction of TH1-dominated T cell responses, M-DC8+ DC might play a role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Different cAMP-elevating agents suppressed the proinflammatory cytokine production and enhanced the secretion of anti-inflammatory IL-10. Activity of phosphodiesterase (PDE) 4, the most important cAMP-hydrolysing enzyme in immune cells, was detected and RT-PCR revealed the expression of PDE4 subtypes 4A, 4B and 4D in M-DC8+ DC, whereas 4C was not detectable. The PDE4-specific inhibitors AWD12-281 and Roflumilast were then used to elevate cAMP concentrations. These substances have been proven to be efficient in anti-inflammatory therapies. In the presence of PDE4 inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12 and TNF-a was decreased by 90 % and 60 %, respectively, whereas the IL-10-release was doubled. These effects were only observed, if the PDE4 inhibitors where present from the beginning of the culture. The inhibition of the IL-12 secretion was reverted using an a-IL-10-receptor antibody. PDE4 inhibitor-treated M-DC8+ DC showed a reduced capacity to polarize TH1-cells, which was demonstrated analysing culture supernatants by ELISA and by single-cell analysis detecting intracellular IFN-g und IL-4. These results suggest that PDE4 inhibitors may not only be useful in the therapy of TH2-mediated diseases but also in TH1-dominated indications such as multiple sclerosis and Crohn´s disease. Despite the shift of the cytokine profile, the in vitro maturation of M-DC8+ DC was not affected by PDE4 inhibitors. The expression of CD83, CD80, CD86, MHC-molecules as well as CD54 and CD58, was assessed by FACS analysis. Correspondingly, in the presence of AWD12-281, M-DC8+ DC efficiently stimulated the proliferation of allogeneic CD4+CD45RA+ T-cells. In the second part of this study, the effects of an inhibition of cAMP-synthesis in M-DC8+ DC were analyzed. Two adenylyl cyclase (AC) inhibitors, 2,5-Dideoxyadenosine and SQ22536, clearly hampered the in vitro maturation of M-DC8+ DC. The expression of the DC maturation marker CD83 could be reconstituted using the stable cAMP-analogon 8-Br-cAMP. Measuring the intracellular cAMP concentration in M-DC8+ DC, initially low cAMP-levels were observed, but within 30 min the concentration raised and returned to original levels within 2 hrs. Blocking the cAMP synthesis by AC inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12, TNF-a and IL-10 was strongly reduced. Furthermore, it was demonstrated that M-DC8+ DC can only release IL-12 after a transient elevation of cAMP, i.e. they acquire a "license". Such a regulation of the IL-12 production has not been described before. Protein kinase A is an important effector molecule of cAMP. Inhibiting its activity resulted in a reduced expression of the DC maturation marker CD83 and a lower cytokine production underlining the importance of cAMP-signalling for the activation of M-DC8+ DC. In conclusion, this study provides evidence for a new concept of the immune-regulatory function of cAMP. Here, cAMP is essentially involved in the initial activation and maturation of DC and enables them to secrete large amounts of IL-12 and TNF-a upon stimulation with a TLR ligand. Conversely, a long-term elevation of cAMP-concentrations inhibits the proinflammatory effector functions of M-DC8+ DC and can induce anti-inflammatory responses by enhancing the secretion of IL-10. / In dieser Arbeit wurde der Einfluss des second messengers cAMP auf die funktionelle Plastizität von M-DC8+ dendritischen Zellen (DC) untersucht. Der Oberflächenmarker M-DC8 definiert eine zunächst im Blut beschriebene Population nativer DC. Nach ihrer Isolation erlangen M-DC8+ DC während einer kurzen Kultur einen maturen CD83+ Phänotyp. Nach Stimulation mit LPS und IFN-g produzieren native M-DC8+ DC deutlich höhere Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12(p70) und TNF-a als andere DC-Populationen oder Monozyten. Dies resultiert in einer Programmierung TH1-dominierter T-Zellantworten. M-DC8+ DC könnten daher an der Pathogenese entzündlicher Krankheiten beteiligt sein. Unterschiedliche cAMP-erhöhende Substanzen supprimierten die proinflammatorische Zytokinproduktion und verstärkten gleichzeitig die Sekretion des anti-inflammatorischen IL-10. In M-DC8+ DC konnte die Aktivität von Phosphodiesterase (PDE) 4, dem wichtigsten cAMP-hydrolysierenden Enzym in Immunzellen, nachgewiesen werden. Durch RT-PCR wurde die Expression der PDE4-Subtypen 4A, 4B und 4D gezeigt, nicht aber 4C. Zur Erhöhung der cAMP-Konzentration wurden dann die PDE4-spezifischen Inhibitoren AWD12-281 und Roflumilast eingesetzt, deren klinische Effizienz bei anti-inflammatorischen Therapien belegt ist. Auch diese Substanzen verringerten die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12 und TNF-a durch M-DC8+ DC um 90 % bzw. 60 %, während die IL-10-Freisetzung etwa verdoppelt wurde. Diese starken Effekte konnten nur erzielt werden, wenn die PDE4-Inhibitoren von Beginn der Kultur an eingesetzt wurden. Die Hemmung der IL-12-Sekretion wurde in Gegenwart eines a-IL-10-Rezeptor-Antikörpers aufgehoben. Unter dem Einfluss von PDE4-Inhibitoren war die TH1-Programmierung durch M-DC8+ DC deutlich reduziert, was sowohl durch die Analyse der Zellüberstände mittels ELISA als auch auf Einzelzell-Ebene durch intrazelluläre Detektion von IFN-g und IL-4 nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PDE4-Inhibitoren nicht nur für TH2-vermittelte Erkrankungen sondern auch für TH1-dominierte Indikationen wie Multiple Sklerose oder Morbus Crohn von Nutzen sein könnten. Trotz der starken Modulation des Zytokinprofils blieb die in vitro-Ausreifung M-DC8+ DC unbeeinflusst von PDE4-Inhibitoren. Untersucht wurde die Expression von CD83, CD80, CD86, MHC-Molekülen, CD54 und CD58 mittels FACS-Analyse. Entsprechend induzierten M-DC8+ DC auch in Anwesenheit von AWD12-281 die Proliferation allogener CD4+CD45RA+ T-Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Blockade der cAMP-Synthese auf M-DC8+ DC auswirkt. Zwei Adenylatcyclase-Inhibitoren, 2,5-Dideoxyadenosine und SQ22536, hemmten die in vitro-Maturation von M-DC8+ DC deutlich. Die CD83-Expression wurde mit 8-Br-cAMP rekonstituiert. Messungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in unbehandelten M-DC8+ DC zeigten initial niedrige cAMP-Spiegel, die innerhalb von 30 min anstiegen und nach 2 h wieder auf das Ausgangsniveau abfielen. Die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12, TNF-a und IL-10 wurde durch AC-Inhibitoren deutlich vermindert. M-DC8+ DC erhalten nur nach einer transienten cAMP-Erhöhung die "Lizenz" IL-12 freizusetzen. Eine derartige Regulation der IL-12-Sekretion ist bisher nicht beschrieben. Eine Hemmung des cAMP-Effektormoleküls Proteinkinase A resultierte in der reduzierten Expression des DC-Maturationsmarkers CD83 und einer verringerten Zytokinproduktion. Dies unterstreicht die Bedeutung von cAMP für die Aktivierung M-DC8+ DC. Zusammenfassend gibt diese Arbeit am Beispiel nativer humaner DC Anhalt für ein neues Konzept der immunregulatorischen Funktion von cAMP. Hierbei ist cAMP wesentlich an der Ausreifung von M-DC8+ DC beteiligt, woraufhin diese große Mengen IL-12 und TNF-a sekretieren können. Dagegen wirkt eine langfristige cAMP-Erhöhung durch die Induktion von IL-10 anti-inflammatorisch.