Brustkrebs ist die häufigste diagnostizierte Krebserkrankung weltweit. Trotz der vielfältigen Behandlungsmöglichkeiten endet die Diagnose Brustkrebs in vielen Fällen noch immer tödlich. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Therapieansätze wichtig. Ein Therapieansatz, der in den letzten zehn Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen hat, ist die Immuntherapie. Allerdings konnte sie bei Brustkrebs noch keine großen Erfolge erzielen. Ursache hierfür ist die geringe Immunzellinfiltration in Brusttumoren. Um Brustkrebs für Immuntherapie empfänglicher zu machen, müssten Immuntherapeutika in Kombination mit Medikamenten angewendet werden, die die Immunzellinfiltration steigern. Um die Wirksamkeit solcher Medikamente in präklinischen Studien zu testen, braucht es eine Methode, mit der man die T-Zellverteilung innerhalb des Tumors darstellen kann. Für umfassendes Verständnis ist dreidimensionale Darstellung der Zellen im Tumor notwendig, da es einen großen Unterschied macht, ob sich die T-Zellen im Tumorstroma oder in unmittelbarer Nähe zu den Tumorzellen befinden. Die starke Fibrotisierung der Extrazellulären Matrix, die typisch für Brusttumoren ist, erschwert nicht nur die Immunzellinfiltration, sondern auch die Diffusion der fluoreszierenden Antikörper ins Gewebe. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um im dreidimensionalen CD4 und CD8-positive T-Zellen in Brusttumoren darzustellen. Dies gelang mittels Immunfluoreszenzfärbung und anschließender dreidimensionaler Aufnahme mithilfe optischer Sektionierung am Lichtblattmikroskop. Erreicht wurde dies durch deutliche Erhöhung der Inkubationszeiten, aggressive Permeabilisierung des Gewebes, Testen unterschiedlicher Antikörper bzw. Antikörperkombinationen und Entfärbung sowie Klärung des Tumorgewebes. Darüber hinaus konnten erste Schritte in der nachträglichen Bearbeitung der Aufnahmen inklusive Rekonstruktion der Zellen gemacht werden. Für die Anwendung des Verfahrens in Studien zur Medikamentenwirksamkeit ist noch weitere Optimierung notwendig. / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer worldwide. Despite the wide range of treatment options available, the diagnosis of breast cancer is still fatal in many cases. For this reason, the development of new therapeutic approaches is important. One therapeutic approach that has become increasingly important in the last ten years is immunotherapy. However has not yet been very successful in breast cancer. The reason for this is the low level of immune cell infiltration in breast tumours. To make breast cancer more receptive to immunotherapy, immunotherapeutics could be used in combination with drugs that increase immune cell infiltration. In order to test the efficacy of such drugs in preclinical studies, a method is needed that can be used to visualise the T cell distribution within the tumour. For a comprehensive understanding, three-dimensional visualisation of the cells in the tumour is necessary, as it makes a big difference whether the T cells are located in the tumour stroma or in close proximity to the tumour cells. The strong fibrotisation of the extracellular matrix, which is typical of breast tumours, not only makes T cell infiltration, but also the diffusion of the fluorescent antibodies into the tissue difficult. In the course of this work, a method was developed to visualise CD4 and CD8-positive T cells in breast tumours in three dimensions. This was achieved by significantly increasing incubation times, aggressive permeabilisation of the tissue, testing different antibodies and antibody combinations and decolourisation as well as clarification of the tumour tissue. In addition, the first steps were taken in the subsequent processing of the images, including reconstruction of the cells. However further optimisation is still required before the method can be used in drug efficacy studies.

Das Masernvirus (MV) kann in Erkrankten eine schwere, langanhaltende Immunsuppression verursachen, wodurch Infektionen mit opportunistischen Pathogenen begünstigt werden. Diese basiert auf einer Paralyse der hämatopoetischen Zellen, welche das Virus durch Kontakt eines viralen Glykoproteinkomplexes zu einem unbekannten RezeptorX auf der Zell- Oberfläche induzieren kann. Kerncharakterisitika hiervon sind unter anderem die Herabregulation der Akt-Kinase-Phosphorylierung, die Inhibition der zellulären Proliferation und die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase 2 (NSM2). In einem kinetischen Phosphoproteom konnten zwei potentielle Interaktionsrezeptoren des MV identifiziert werden: CD43 und P2X3. Das hochglykosylierte Oberflächenmolekül CD43 ist auf hämatopoetischen Zellen ubiquitär exprimiert und reguliert in T-Zellen deren Überleben, Proliferation, Aktivierung, Migration und Adhäsion. P2X3 wird in hämatopoetischen Zellen nur in geringem Maße exprimiert. Seine funktionelle Bedeutung ist in diesem Kompartiment nicht bekannt. Beide Kandidaten wurden mittels CRISPR/Cas9 Verfahren einzeln oder kombiniert aus Jurkat-T-Zellen ablatiert, welche nachfolgend nach MV-Kontakt hinsichtlich der oben erwähnten MV-modulierten Parameter getestet wurden. Zusätzlich wurden iso- und allosterische P2X3-Inhibitoren an primären und Jurkat-T-Zellen verwendet, um dessen Rolle in Ca2+-Mobilisierung und Proliferation nach T-Zell-Rezeptor Co-Stimulation zu analysieren. Die genetische Depletion beider Rezeptor-Kandidaten verringerte die Effekte des MV auf alle getesteten Parameter signifikant, was darauf hindeutet, dass beide Proteine entscheidend an der T-Zell-Suppression beteiligt sind. Während die isosterische Inhibition von P2X3 keinen Effekt hatte, wurde die Proliferation primärer T-Zellen durch dessen allosterische Inhibition vor Co-Stimulation fast verdoppelt und die Effizienz der Ca2+-Mobilisierung in Jurkat- und primären T-Zellen signifikant erhöht. In P2X3-depletierten Jurkat-Zellen hingegen war die Ca2+-Mobilisierung nach Stimulation signifikant geringer als in WT-Zellen. In dieser Arbeit konnten zwei wichtige Mediatoren der MV induzierten T-Zell-Suppression identifiziert werden. Vor allem P2X3, dessen Expression, Regulation und funktionelle Bedeutung im hämatopoetischen Kompartiment noch nicht erforscht wurde, könnte ein vielversprechender Kandidat für eine antivirale Therapie darstellen, da ein klinisch getesteter P2X3-Inhibitor bereits verfügbar ist. / Measles virus (MV) infection induces a severe and long-lasting immunosuppression in patients resulting in infections through opportunistic pathogens. T cell paralysis is a major contributor to MV induced immunosuppression. This can be achieved through contact of a viral glycoprotein complex with an uncharacterized receptor X on the surface of hematopoietic cells. Contact-mediated downregulation of Akt-kinase phosphorylation, inhibition of proliferation and activation the neutral spingomyelinase 2 (NSM2) are key characteristics of T cell inhibition in vitro. Using a kinetic phosphoproteomic approach, two potential interaction receptor candidates were identified: CD43 and P2X3 receptor. The highly glycosylated surface protein CD43 is ubiquitously expressed on hematopoietic cells and is known to regulate T cell survival, proliferation, activation, migration and adhesion. The expression of P2X3 in this compartment is low and its functional importance unknown. It is widely expressed in neuronal cells where it is a major effector in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Using the CRISPR/Cas9 method both candidates were knocked down singly or combined in Jurkat T cells. Cells were then tested for the MV modulated parameters mentioned above upon MV challenge. In addition to that, iso- and allosteric functional inhibitors for P2X3 were employed on primary and Jurkat T cells to determine its role in calcium influx and proliferation after T cell receptor stimulation. The knockdown of both CD43 and P2X3 significantly decreased MV effects on all analyzed parameters (Akt-kinase phosphorylation, proliferation, NSM2 activation) indicating that both proteins play a major role in MV-induced T cell suppression. While isosteric inhibition of receptor P2X3 had no effect, its allosteric inhibition prior to stimulation increased proliferation of primary T cells almost twofold and significantly increased Ca2+ influx in Jurkat cells and primary T cells. In contrast, genetic depletion of P2X3 significantly reduced calcium influx after stimulation as compared to wildtype cells. In this study two important mediators of MV induced T cell suppression were identified. Amongst those, P2X3 whose expression, regulation and functional importance in the hematopoietic compartment has not been investigated yet, may represent a promising candidate for anti-viral therapy due to the existence of a clinically tested inhibitor.

Multiple Myeloma remains an incurable disease of clonally expanding malignant plasma cells. The bone marrow microenvironment harbors treatment resistant myeloma cells, which eventually lead to a disease relapse in patients. CD4+FoxP3+ regulatory T cells (Tregs) are highly abundant amongst CD4+ T cells in the bone marrow providing an immune protective niche for different long-living cell populations, e.g. hematopoietic stem cells. Previous studies in multiple myeloma patients have mostly focused on peripheral blood analyses without factoring in the specialized bone marrow environment or employed therapy regimens. Even though, functional Treg-myeloma cell analyses are lacking, recent literature suggests that in multiple myeloma Tregs enrich in the bone marrow. In this study, we addressed the functional role of Tregs in the engraftment and progression of multiple myeloma. We further elucidated the Treg-mediated immune-suppression that induces immune escape of multiple myeloma. To investigate the immune regulation of multiple myeloma, we utilized a syngeneic immunocompetent murine multiple myeloma model (MOPC-315.Luc-GFP.BMP2 in BALB/c mice), that allows non-invasive in vivo bioluminescence imaging of disease progression in combination with fluorescence microscopy techniques and multi-parameter flow cytometry. DEREG mice provided a system to selectively deplete Tregs upon diphtheria toxin administration at different time points of multiple myeloma progression. We further confirmed our major findings with a second syngeneic and immunocompetent murine model of multiple myeloma, the transplantable VK*MYC model (VK12653 in C57BL/6). Firstly, we found that Tregs accumulate in vicinity of multiple myeloma cells within the bone marrow and display a highly activated phenotype. Tregs upregulated activation marker such as CD44, CD69 and ICAM-1 as well as several checkpoint receptors such as PD-1 and LAG-3. Secondly, using DEREG mice to deplete Tregs in a time restricted manner before tumor cell injection, we found that Tregs create a suppressive environment that enables tumor engraftment and dissemination. Additional, in this myeloma model, we found that Tregs retain an immune response that has the potential to effectively eliminate multiple myeloma. Remarkably, even a short-term depletion of Tregs in mice with established tumor resulted in complete regression of multiple myeloma below the detection limit. Longitudinal follow-up monitoring with sensitive bioluminescence imaging revealed that 69% (9/13) of mice remained entirely tumor free for an observation period of 80 days. Thirdly, using depleting antibodies in vivo we identified CD8 T cells and NK cells as major effector cells against multiple myeloma when unleashed from Treg suppression. Conclusively, with this preclinical in vivo study we show that Tregs are an attractive therapeutic target for the treatment of patients suffering from multiple myeloma. / Das Multiple Myelom gilt bislang als eine unheilbare Krankheit klonal expandierender maligner Plasmazellen. Die Knochenmark-Umgebung beherbergt behandlungsresistente Myelom Zellen, die bei Patienten letztendlich zu einem Krankheitsrückfall führen. CD4+ FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) sind unter CD4+ T-Zellen im Knochenmark sehr häufig und bieten eine vom Immunsystem geschützte Nische für verschiedene langlebige Zellpopulationen, wie z.B. für hämatopoetische Stammzellen. Studien an Multiplen Myelom Patienten konzentrierten sich bisher hauptsächlich auf Analysen des peripheren Blutes, ohne die Besonderheit der Knochenmarkumgebung oder bereits angewandte Therapien zu berücksichtigen. Obwohl funktionelle Treg-Myelom-Analysen fehlen, deutet aktuelle Literatur darauf hin, dass sich Tregs bei Patienten mit Multiplem Myelom im Knochenmark anreichern. Für diese Arbeit haben wir uns mit der funktionellen Rolle von Tregs bei der Manifestation und dem Fortschreiten des Multiplen Myeloms befasst. Wir haben untersucht, wie die Unterdrückung des Immunsystems durch Tregs das Multiple Myelom vor einer Immunantwort bewahrt. Um die Immunregulation des Multiplen Myeloms zu untersuchen, wurde ein syngenes und immunkompetentes murines Modell (MOPC-315.Luc-GFP.BMP2 in BALB/c-Mäuse) verwendet, das eine nicht-invasive in vivo Biolumineszenz-Bildgebung des Krankheitsverlaufs ermöglicht. DEREG-Mäuse ermöglichten durch die Gabe von Diphterietoxin die selektive und effiziente Eliminierung von Tregs zu verschiedenen und genau definierten Zeitpunkten der Multiplen Myelom Erkrankung. In Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie und Multiparameter Durchflusszytometrie konnten wir so die Funktion von Tregs detailliert analysieren. Zusätzlich haben wir die wichtigsten Erkenntnisse mit einem zweiten immunkompetenten und syngenen Mausmodell des Multiplen Myeloms, dem transplantierbaren V� *MYC-Modell (VK12653 in B6a.FoxP3.Luci.DTR Mäuse), weiter bestätigt. Erstens fanden wir heraus, dass sich Tregs in der Nähe des Multiplen Myeloms im Knochenmark ansammeln und einen hochaktivierten Phänotyp aufweisen. Tregs regulierten Aktivierungsmarker wie CD44, CD69 und ICAM-1, sowie mehrere Checkpoint-Rezeptoren wie PD-1 und LAG-3 hoch. Dieser Wechsel des Treg-Phänotyps war besonders ausgeprägt an Stellen mit starkem Tumorwachstum und konnte im MOPC Model ausschließlich im Knochenmark beobachtet werden. Zweitens konnten wir durch die gezielte Depletion von Tregs in DEREG Mäusen vor der Tumorzellinjektion feststellen, dass Tregs eine immunsupprimierte Umgebung schaffen, die das Anwachsen von Multiplen Myelomzellen und die Metastasierung ermöglichen. Des Weiteren konnten wir durch die gezielte Depletion von Tregs in Mäusen mit einer etablierten Myelomerkrankung zeigen, dass Tregs eine effektive Immunantwort unterdrücken, die das Potenzial hat, das Multiple Myelom vollständig zu eliminieren. Bemerkenswerterweise führte sogar eine kurzfristige Depletion von Tregs bei Mäusen mit vorhandenem Tumor zu einer vollständigen Regression des Multiplen Myeloms unterhalb der Nachweisgrenze. Die Langzeituntersuchung mit sensitiver Biolumineszenz-Bildgebung ergab, dass 69% (9/13) der Mäuse über einen Beobachtungszeitraum von 80 Tagen vollständig tumorfrei blieben. Drittens konnten wir in vivo, mit zellspezifischen und depletierenden Antikörpern zeigen, dass CD8-T-Zellen und NK-Zellen effektiv Myelom Zellen vernichten, sobald diese nicht mehr von Tregs in ihrer Aktivität gehindert werden. Zusammenfassend zeigen wir mit dieser präklinischen in vivo Studie, dass Tregs ein attraktives therapeutisches Ziel für die Behandlung von Patienten mit Multiplem Myelom sind.

Kinder mit Down Syndrom weisen Zeichen der vorzeitigen Immunoseneszenz auf. Der genaue Mechanismus dahinter und das Stadium der T-Zell-Reifung, in welchem der Defekt vorliegt, sind jedoch noch nicht genau verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Vergleich hinsichtlich der Zusammensetzung der Thymozyten von Kindern mit DS und gesunden Kindern und wichtige Unterschiede vor allem hinsichtlich einer vorzeitigen T-zellulären Immunoseneszenz angestellt. Es wurde das Thymusgewebe von 23 Kindern mit/ohne DS mittels PCR und Immunhistochemie untersucht. Im Thymus war das Verhältnis von CD45RA/CD45RO bei DS zugunsten von CD45RO verschoben, was auf einen Defekt in der Thymopoese hinweist und die vielfach beschriebene geringere Freisetzung von naiven CD45RA+ T-Zellen aus dem Thymus erklären könnte. Das Immunsystem von Kindern mit DS weist mit der geringeren Expression von CD45RA bei gleichzeitig verstärkter Expression von CD45RO Zeichen der vorzeitigen Immunoseneszenz auf. Allerdings ist dieses Merkmal möglicherweise Folge des Defekts in der Thymopoese (im Umlagerungsprozess von CD45RO zu CD45RA), der hier gezeigt werden konnte. Klinische Forschung zu Immuntherapien für Personen mit DS, die aufgrund ihres Immunphänotyps an schweren Immundefiziten leiden, ist notwendig. Es könnte jedoch sein, dass die bisher verfügbaren Immuntherapien bei DS nicht effektiv wären, da wahrscheinlich ein Defekt in der Thymopoese vorliegt. Allerdings könnten neue Medikamente zukünftig die Versorgung von Kindern mit DS verbessern und die infektionsbedingte Mortalität vermindern. / The immune phenotype of children with Down Syndrome has been shown to have similarities to a senescent immune systeme. The exact cause and mechanisms leading to these alterations in DS are still not clear. To further investigate in this topic and extend the knowledge, we examined the thymic tissue of children with DS and healthy controls. The study included 23 children with or without DS, who had undergone heart surgery within the first months to years of life. We examined the transcription factors, cell surface markers and cytokine profile in the thymic tissue with PCR analysis and immunohistochemistry. We found a different CD45RA/CD45RO ratio within the thymic tissue in immunohistochemistry. Children with DS seemed to express less CD45RA, but more CD45RO in the thymic tissue. This leads us to the conclusion of a defect in thymopoesis in children with DS and may also explain the often described lower thymic output of naïve T-cells in DS. Our findings support the thesis of premature immunosenescence in DS as a low expression of CD45RA in T-cells together with a higher expression of CD45RO are signs of an aged immune system. We were able to show a defect in the thymopoesis in terms of an altered CD45RA/CD45RO ratio in the thymus of DS. Further research should investigate in novel strategies of immune therapy for individuals with DS who suffer from severe immunodeficiencies due to their immune phenotype. It is yet to be proven that the established immune therapies would actually be effective in DS as there probably is a defect in thymopoesis.

Neutral sphingomyelinase 2 (NSM2), encoded by the phosphodiesterase 3 (SMPD3) gene, is a key enzyme in the sphingolipid metabolism. It catalyzes the conversion of sphingomyelin into ceramide. NSM2 activation and ceramide production play pivotal roles in mammalian stress responses, with dysregulation implicated in numerous inflammation-related pathologies. However, the precise molecular composition of the NSM2 proximal protein network (the proximitome) and its modulation by inflammatory-induced cytokine signaling, such as TNFα, are still unclear. A proximity labeling strategy was used based on the engineered ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to explore the NSM2 proximitome specifically in Jurkat cells. For this purpose, cell lines stably expressing NSM2 fused to APEX2 at the C-terminus were generated. NSM2-APEX2 proximal proteins covalently labeled with biotin were purified using streptavidin-coated beads and identified by mass spectrometry (MS). Noteworthy, the removal of excess biotin phenol (BP) substantially improved streptavidin-based affinity purification of biotinylated proteins. The first analysis of NSM2-APEX2 labeling by MS accurately identified proteins under steady-state conditions corresponding to known NSM2-dependent processes such as multivesicular body (MVB) assembly and organization, thereby validating the approach. Moreover, previously unknown processes involving NSM2, such as triglyceride sequestration and lipid storage, were identified. Further, I applied the optimized proximity labeling protocol to elucidate TNFα-induced alterations in the NSM2 proximitome within the first five minutes of stimulation. In addition to identifying previously known interactors, the analysis unveiled massive dynamic changes within the NSM2 nanoenvironment. Hereby, the recruitment and sustained proximity of the majority of proteins depended on the enzymatic activity of NSM2. At two minutes during the early TNFα response, proteins associated with intracellular vesicle-mediated transport were significantly enriched in the NSM2 proximitome, suggesting a role for NSM2 in TNFα-induced transport of vesicles derived from various compartments such as the Golgi, trans-Golgi-network, and MVB/exocytic vesicles. / Die neutrale Sphingomyelinase 2 (NSM2), kodiert durch das Phosphodiesterase-3 (SMPD3) -Gen, ist ein Schlüsselenzym im Sphingolipid-Stoffwechsel. Sie katalysiert die Umwandlung bzw. den Abbau von Sphingomyelin in Ceramid. Die Aktivierung von NSM2 und die Produktion von Ceramid spielen eine zentrale Rolle bei Stressreaktionen von Säugetieren und sind insbesondere an der Regulation zahlreicher entzündungsbedingter Krankheiten beteiligt. Die genaue molekulare Zusammensetzung des proximalen NSM2-Protein-Netzwerks (des „Proximitoms“) und dessen Veränderung durch entzündungsinduzierte Zytokin-Signale wie TNFα sind jedoch noch weitgehend ungeklärt. Um dies speziell in Jurkat-Zellen zu erforschen, wurde eine Umgebungsmarkierungs-Strategie verwendet, die auf der manipulierten Ascorbatperoxidase 2 (APEX2) basiert. Zu diesem Zweck wurden Zelllinien hergestellt, die ein Fusionsprotein aus NSM2 und C-terminaler APEX2 stabil exprimieren. Die mit Biotin kovalent markierten proximalen NSM2-Proteine wurden mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen (Beads) gereinigt und durch Massenspektrometrie identifiziert. Durch das Entfernen von überschüssigem Biotin Phenol (BP) aus dem Lysat konnte die Streptavidin-basierte Affinitätsreinigung von biotinylierten Proteinen erheblich verbessert werden. Die massenspektrometrische Analyse identifizierte Proteine, die bei bekannten NSM2-abhängigen Prozessen, wie z.B. dem Aufbau und der Organisation multivesikulärer Körper (MVK) eine Rolle spielen. Dieser Befund bestätigt den hier gewählten methodischen Ansatz. Außerdem wurden Prozesse identifiziert, von denen bisher nicht bekannt war, dass sie mit NSM2 in Verbindung stehen, wie z. B. die Sequestrierung von Triglyceriden und die Speicherung von Lipiden. Darüber hinaus habe ich das optimierte Umgebungsmarkierungs-Protokoll angewandt, um TNFα-induzierte Veränderungen des NSM2-proximalen Proteinnetzwerks innerhalb der ersten fünf Minuten nach der Stimulation aufzuklären. Neben der Identifizierung zuvor bekannter Interaktoren konnten massive dynamische Veränderungen innerhalb der NSM2-Nanoumgebung beobachtet werden. Dabei hingen die Rekrutierung und die anhaltende Nähe der meisten Proteine stark von der enzymatischen Aktivität von NSM2 ab. Zwei Minuten nach Beginn der TNFα-Antwort waren Proteine, die mit intrazellulärem Vesikel-vermitteltem Transport assoziiert sind, im NSM2-Proximitom signifikant angereichert, was auf eine Rolle von NSM2 beim TNFα-induzierten Transport von Vesikeln aus verschiedenen Kompartimenten wie dem Golgi, dem trans-Golgi-Netzwerk und MVK/exozytären Vesikeln hindeutet.

The immune system plays a crucial role in maintaining intestinal homeostasis by tolerating environmental antigens and responding to harmful pathogens in the gut. A complex and tissue-specific network of immune cells is responsible for this equilibrium. Altered intestinal immunological homeostasis leads to chronic inflammation in Crohn’s disease (CD). In this study we conducted a multiparametric immunophenotyping of intestinal and peripheral CD3+ T cells from CD patients using a mass cytometry panel that detects 42 T-cell markers. Disease and tissue-specific alterations were identified by comparing inflamed and non-inflamed CD intestinal tissues and CD patients' blood with healthy blood. Chronic inflammation in the intestine was linked to a decrease in major unconventional or tissue-resident T cells, which are important for the first-line mucosal defense. Intestinal inflammation was associated with general hyperactivation and/or exhaustion of conventional T (Tcon) cells, as well as a relative increase in CD4+ regulatory T cells (Tregs) with reduced immunosuppressive effector phenotypes. The CD4+ T-cell compartment showed signs of cross-differentiation of Th17, Tregs or exhausted T cells towards a follicular helper T-cell phenotype, most likely responsible for inducing antibody production. On the other hand, the circulating antigen-experienced CD8+ T cells showed strong migration towards the intestine, where they overpopulated the niche in their most terminally differentiated effector stages. Intestinal inflammatory milieu tended to induce senescence of the late differentiated effector CD8+ T cells, accompanied by their acquisition of NK-like features, such as the expression of CD16. This plasticity of T cells towards innate characteristics within the inflammatory environment, was also demonstrated by the discovery of not well studied CD4+ or CD8+ effector memory CD16+CCR6+CD127+ T cells in the blood of CD patients. This phenotype could be induced in healthy T cells by soluble components of the IBD blood plasma. Furthermore, T cells derived from CD patients could exhibit NK-like effector functions when exposed to CD16-mediated antibody binding, in vitro. Finally, rare Treg subsets with enigmatic properties appeared upon inflammation, such as CD4+HLA-DR+TIGIT–Tregs and CD4+CD56+Tregs, which express pro-inflammatory IFN-γ upon in vitro stimulation. These findings suggest an unusual pro-inflammatory innate-like differentiation of Tregs and Tcon cells, with the acquisition of unspecific cytotoxicity. This differentiation could be both cause and consequence of intestinal inflammation during CD. / Das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase. Es toleriert Umweltantigene und reagiert auf schädliche Krankheitserreger im Darm. Ein komplexes und gewebespezifisches Netzwerk von Immunzellen ist für dieses Gleichgewicht verantwortlich. Eine gestörte immunologische Homöostase des Darms führt bei Morbus Crohn (CD) zu chronischen Entzündungen. In dieser Studie wurde eine multiparametrische Immunphänotypisierung von intestinalen und peripheren CD3+ T-Zellen von CD-Patienten durchgeführt. Hierbei wurde ein Massenzytometrie-Panel mit 42 T-Zell-Markern verwendet. Krankheits- und gewebespezifische Veränderungen wurden durch den Vergleich von entzündetem und nicht entzündetem Darmgewebe bei Patienten mit Morbus Crohn sowie von Blut aus Morbus Crohn-Patienten und gesundem Blut ermittelt. Die chronische Entzündung im Darm war mit einem Rückgang der wichtigsten unkonventionellen oder gewebsständigen T-Zellen verbunden, die für die erste Verteidigungslinie der Schleimhäute wichtig sind. Die Darmentzündung war mit einer allgemeinen Hyperaktivierung und/oder Erschöpfung der konventionellen T-Zellen (Tcon) sowie einer relativen Zunahme der CD4+ regulatorische T-Zellen (Tregs) mit reduziertem immunsuppressiven Effektor-Phänotyp verbunden. Das CD4+ T-Zell-Kompartiment zeigt Anzeichen einer Kreuzdifferenzierung von Th17, Tregs oder erschöpften T-Zellen in Richtung eines follikulären Helfer-T-Zell-Phänotyps. Dieser ist höchstwahrscheinlich für die Induktion der Antikörperproduktion verantwortlich. Die zirkulierenden antigenerfahrenen CD8+ T-Zellen zeigten andererseits eine starke Migration in Richtung Darm, wo sie die Nische in ihrem am weitesten ausdifferenzierten Effektorstadium überbevölkerten. Intestinale Entzündungsmilieus führen tendenziell zur Seneszenz der spät differenzierten Effektor-CD8+ T-Zellen, die mit dem Erwerb von NK-ähnlichen Merkmalen wie der Expression von CD16 einhergeht. Die Plastizität von T-Zellen in Richtung innaten Charakteristika innerhalb der entzündlichen Umgebung wurde durch die Entdeckung von bisher nicht gut untersuchten CD4+ oder CD8+ Effektor-Gedächtnis-CD16+CCR6+CD127+ T-Zellen im Blut von CD-Patienten nachgewiesen. Dieser Phänotyp konnte in gesunden T-Zellen durch lösliche Bestandteile des IBD-Blutplasmas induziert werden. Des Weiteren konnten bei CD-Patienten T-Zellen NK-ähnliche Effektor-Funktionen aufweisen, wenn sie in vitro einer CD16-vermittelten Antikörperbindung ausgesetzt waren. Zudem traten bei Entzündungen seltene Treg- 7 Untergruppen mit rätselhaften Eigenschaften auf, wie CD4+HLA-DR+TIGIT-Tregs und CD4+CD56+Tregs, die bei In-vitro-Stimulation proinflammatorisches IFN-γ exprimierten. Diese Befunde deuten auf eine ungewöhnliche Differenzierung von Tregs und Tcon-Zellen mit pro-inflammatorischen innaten Eigenschaften hin, die mit dem Erwerb unspezifischer Zytotoxizität einhergeht. Diese Differenzierung könnte sowohl Ursache als auch Folge der Darmentzündung bei CD sein.

Diffuse großzellige B-Zell Lymphome stellen weltweit die größte Gruppe maligner B-Zell Non-Hodgkin-Lymphome dar und umfassen eine biologisch, genetisch und klinisch heterogene Gruppe lymphoider Tumoren, die als Hauptmerkmal große transformierte B-Lymphozyten mit vesikulären Kernen und prominenten Nukleoli aufweisen. Nur ungefähr 40% der Patienten zeigen ein Ansprechen auf eine konventionelle Chemotherapie. Um von einer präziseren Prognose profitieren zu können, ist eine reproduzierbare Klassifizierung dieser „inhomogenen Entität“ nicht nur für die Betroffenen wünschenswert. Dadurch könnten Krankheitsverläufe genauer vorhergesagt und die Therapie optimiert werden. Während akute Leukämien häufig mit einer Translokation assoziiert sind, zeigt sich bei B-Zell-Lymphomen ein weitaus komplexeres Bild an zytogenetischen Aberrationen. Diese werden einerseits mit der Etablierung des malignen Phänotyps, andererseits mit der Tumorprogression und der klonalen Evolution eines Tumors in Verbindung gebracht. Obwohl die meisten Neoplasien rekurrente und Tumor-spezifische klonale chromosomale Aberrationen aufweisen, ist es noch nicht gelungen, durch Etablieren genetischer „Marker“ eine zuverlässige Aussage über Verlauf und Ansprechen und damit über die Prognose dieser Erkrankung zu machen. Solche Aussagen sind bis dato nur auf Basis allgemeiner klinischer Parameter wie dem Allgemeinzustand der Patienten und der Höhe der Lactat-Dehydrogenase (LDH) im Serum gesichert möglich, die neben anderen Parametern im „International Prognostic Index“ zusammengefasst sind. Zytogenetische, molekulargenetische und in den letzten Jahren auch Hochdurchsatz-Untersuchungen, wie z.B. die Mikroarray-Technologie, haben bereits zu einem besseren Verständnis dieser molekularen Unterschiede geführt. Die WHO-Klassifikation stellt im Hinblick auf die Definition ‚biologischer’ Tumorgruppen einen deutlichen Fortschritt dar. Diese neueren Untersuchungen zeigen auf der Basis des Genexpressionsprofils von diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen die mögliche Unterteilbarkeit dieser diagnostischen Kategorie anhand zweier unterschiedlicher Phänotypen: GC-DLBCL zeigen eine molekulare Signatur, die vergleichbar mit normalen Keimzentrumszellen ist. Die andere Gruppe (ABC-DLBCL bzw. non-GC-DLBCL) entsteht aus Zellen, die die Keimzentrumsreaktion bereits durchlaufen haben. GC- und ABC-DLBCL-Patienten weisen bei einer Anthracyclin-haltigen Chemotherapie (z. B. CHOP) in retrospektiven klinischen Studien einen deutlichen Unterschied in der 5-Jahres-Überlebensrate auf (etwa 60% für GC-DLBCL und 35% für ABC-DLBCL). Somit scheint die Annahme, dass mindestens zwei Entitäten vorliegen, gerechtfertigt. In der vorliegenden Studie konnten das zytogenetische Aberrationsspektrum mittels eines Algorithmus anhand des Genexpressionsprofiles mit zwei verschiedenen Subgruppen – den GC-DLBCL und den non-GC-DLBCL - korreliert werden. Es entstand die bisher umfangreichste zytogenetische Charakterisierung dieser postulierten Phänotypen. Es konnte gezeigt werden, dass GC-DLBCL, die durch die Translokation t(14;18) charakterisiert sind, häufiger Zugewinne bei Chromosom 7 aufweisen, während non-GC-DLBCL mit dem Vorliegen einer Trisomie 3 und Zugewinnen bei 3p und 3q assoziiert sind. Zwei Modelle könnten eine Erklärung für die Assoziation genomischer Instabilitäten mit den unterschiedlichen Genexpressionsprofilen sein. Einerseits könnte eine gewisse Region für die Kodierung eines Schlüsselregulatorgenes verantwortlich sein, welches die Zellbiologie und damit die Genexpression verändert. Andererseits könnten die Subgruppen der DLBCL auf verschiedenem Wege entstehen und somit unterschiedliche Ereignisse für die verschiedenen Aberrationen verantwortlich sein. Es gilt nun, einerseits diese Mechanismen, die zu einer veränderten Genexpression beitragen, aufzudecken und andererseits ein diagnostisches Vorgehen zu etablieren, bei dem beispielsweise nach dem erfolgten Nachweis von Index-Aberrationen eine bestimmte molekulare Signatur überprüft wird. Es ist anzunehmen, dass molekulare Analysen in absehbarer Zeit vermehrt Einzug in den klinischen Alltag halten und therapeutische Entscheidungen mit beeinflussen werden. In Zukunft wird anhand der Expression von Schlüsselgenen die Zuordnung eines Falles in diagnostische Untergruppen erfolgen. Außerdem könnte durch Peptidblockade dieser Schlüsselgene eine zusätzliche Therapieoption bestehen – eine Vermutung, die weitere Studien erforderlich macht. / Diffuse large B-Cell Lymphoma consist of a biologically, genetically and clinically heterogenetic entity of lymphopid tumors which common feature are blastic transformed B-Lymphoytes with vesicular nuclei and prominent nucleoli. Only 40% of the patients show a remission after an anthrcyclin-containing chemotherapy regimen. To benefit from a precise diagnosis, a reproducible classification is mandatory. While leukemia often is assiciated with a single genetic alteration such as a translocation, B-Cell lymphoma show a complex pattern of zytogenetic aberrations. So far there has been no success in estabishing a genetic "marker" which allows a prognosis. Newer studies based on microarray technology show two different phenotypes though: GC-DLBCL consist of cells originating in the germinal centre while ABC-DLBL (or non-GC-DLBL) have already undergone the germinal centre reaction and show a significantly worse 5-year-overall survival. The former are associated with the t(14;18) translocation while the latter show more often trisomy 3 and gains of chromosome 3q and 3p. These results could help subtyping of genetically distinct DLBL and reveal genes playing a key role in tumorigenesis.

Die Juvenile Idiopathische Arthritis ist eine der häufigsten Ursachen von Gelenkbeschwerden im Kindesalter. Die Pathogenese der Erkrankung ist bisher wenig verstanden. Da sich jedoch bei einigen Subtypen der JIA Antinukleäre Antikörper (ANA) nachweisen lassen, liegt eine Beteiligung von B-Lymphozyten nahe. Mittels einer Kombination aus phänotypischer Zuordnung bestimmter B-Zell Differenzierungsstadien sowie Einzelzellsortierung, Amplifikation und Sequenzierung des rearrangierten Immunglobulingens individueller B-Zellen wurde der Frage nach klonaler Verwandschaft unterschiedlich differenzierter B-Zell Stadien und Selektion innerhalb des Gelenkes nachgegangen. / Juvenile idiopathic arthritis is one of the most common reasons for joint problems in childhood. Still the pathogenesis is rarely understood. Since antinuclear antibodies can be found in some subtypes of JIA, an involvement of b-cells can be suggested. By combining phenotypical assignment of specific b-cell subsets and single cell sorting, amplification and sequencing of the rearranged immunoglobulin-gene of individual b-cells, indication for clonal relationship of different b-cell subsets and selection in the joints was examined.

Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen. / Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient.

Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abhängig über den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt über kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molekülen ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivität einiger monoklonaler Antikörper (mAb) spezifisch für CD28 der Ratte, die alle ruhenden primären Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen können, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterstützt CD28 als kostimulatorisches Molekül nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenständiges Signalmolekül, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 könnte für die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verhältnis der Stärke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt. / Resting T cells need two signals to become fully activated: one delivered via the T cell receptor (TCR) and a second one provided by costimulatory receptors. Among the known costimulatory molecules CD28 is the most potent one. In the rat system some CD28-specific monoclonal antibodies (mAb) trigger all primary rat T cells to proliferate and produce cytokines without TCR engagement. The signalling pathways elicited by one of these mitogenic CD28-specific mAb were analyzed and compared to the signals given in classical costimulation with TCR contribution. The results suggest that direct CD28 stimulation does not mimic TCR signals but elicits distinct, CD28-specific signals. Thus, CD28 as a costimulatory molecule not only supports TCR mediated signalling but functions as a generator of mitogenic signals. This could be relevant to the type of immune reaction triggered since the relative contribution of TCR and CD28 signals to T cell activation has been shown to influence the functional differentiation of T cells towards the Th1 or Th2 subset.