Thesis (doctoral)--München, 1982.

Universiẗat, Diss., 2001--Mainz.

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Im Karpfenfisch Alburnus alburnus wurden die bisher größten überzähligen Chromosomen bei Wirbeltieren entdeckt. Dies ermöglichte eine umfangreiche zytogenetische und molekulare Studie dieser außergewöhnlichen Genomelemente. Aus Populationsstudien, die mehrere Fundorte in Deutschland einschlossen, konnten Informationen über die Verteilung der B Chromosomen in Fischen verschiedener Herkunftsorte ermittelt werden. Eine derartige Studie könnte zukünftig auch auf andere Länder ausgedehnt werden. Eine detaillierte, zytogenetische Analyse mit allen konventionellen Hellfeld- und Fluoreszenzbänderungen sowie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen mit den ribosomalen 5S, 18S/28S rDNA-Proben und der Telomerprobe (TTAGGG)n, zeigte, dass die außergewöhnlich großen B Chromosomen von A. alburnus heterochromatisch, GC-reich und spät replizierend sind. Es wurden bei Alburnus alburnus keinerlei Hinweise auf heteromorphe Geschlechtschromosomen gefunden. Die molekularen Untersuchungen basierten hauptsächlich auf AFLP-Analysen, mit denen eine B Chromosomen-spezifische Bande entdeckt und isoliert werden konnte. Nach Klonierung und Sequenzierung sowie dem Durchsuchen einer Fischspezifischen Datenbank konnte eine retrotransposable Sequenz (Gypsy/Ty3 LTRRetrotranpson) gefunden werden. Ferner konnte eine deutliche Homologie zu dem Nterminalen Teil der reversen Transkriptase von Medaka, Oryzias latipes, dokumentiert werden. Die Southern blot-Untersuchungen und der PCR-Test zeigten, dass es sich bei der entdeckten 203 bp-Sequenz um eine B Chromosomen- und Alburnus alburnus-spezifische Sequenz handelt, welche hochrepetitiv über die beiden Arme der überzähligen Chromosomen verteilt ist. Der Ursprung und die Funktion der massiven überzähligen Chromosomen blieb offen. Da es aber nach wie vor wenig Information über B Chromosomensequenzen und DNA-Organisation im Allgemeinen und besonders bei Fischen gibt (Mestriner et al., 2000), sind die Ergebnisse dieser Studie für die Aufdeckung des Ursprungs und der Evolution überzähliger Chromosomen von allgemeiner Bedeutung, da sie wohl den Hauptanteil der DNA-Zusammensetzung des größten, bisher unter den Wirbeltieren entdeckten überzähligen Chromosoms darstellen. Die Analyse meiotischer Chromosomen zeigte, dass das B Chromosom in der Diakinese als selbstpaarendes Ringchromosom vorliegt. Zusammenfassung und Ausblick 101 Mittels durchflußzytophotometrischer DNA-Messungen konnte der Beitrag des außerordentlich großen B Chromosoms zum Gesamt-DNA-Gehalt von A. alburnus bestimmt werden und Fische auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms, allerdings unter Tötung, analysiert werden. Dies kann in Zukunft durch Ausnutzung von Sequenzinformation über das B Chromosom und der damit einhergehenden Konstruktion spezifischer PCR-Primer („minimal-invasiver Flossentest“) vermieden werden. Fische aus unterschiedlichen Populationen, eventuell auch europaweit, können so schnell und zuverlässig auf das Vorhandensein des überzähligen Chromosoms hin untersucht werden, mit dem Zweck, durch künftige Verpaarung der Tiere mit 0, 1 oder 2 B Chromosomen den Vererbungs- bzw. Weitergabemechanismus der überzähligen Chromosomen auf die nächste Generation zu studieren. / In the cyprinid fish Alburnus alburnus the largest supernumerary chromosomes in vertebrates were found. This enables a detailed cytogenetic and molecular study of these extraordinary genome elements. From Population studies, including different locations in Germany, information about the distribution of the B chromosome polymorphism was gained. Such a study could in the future be extended on other European countries. A detailed cytogenetic analysis with all conventional bright field and fluorescence bandings as well as in situ hybridisation using the 5S, 18S/28S rDNA-probe and the telomere probe shows that the unusually large B chromosomes of A. alburnus are heterochromatic, rich in GC-base pairs and late replicating. No hints to heteromorphic sex chromosomes were found in A. alburnus. The molecular studies were predominately based on AFLP-analyses, with which a B chromosome-specific band was found and isolated. After cloning and sequencing as well as screening a fishspecific database a retrotransposable sequence (Gypsy/Ty3 LTR-retrotransposon) was found. Additionally, a strong homology to the N-terminal part of a reverse transcriptase of medaka, Oryzias latipes, could be documented. Southern blot analyses and a PCR-test demonstrated that the found 203 bp-sequence is B chromosome- and Alburnus alburnus-specific and distributed in a highly repetitive manner on both of the arms of the supernumeray chromosomes. The origin and function of the massive supernumerary chromosomes remains open. Since there is not much information about B chromosome sequences and DNA organisation in general and especially in fishes (Mestriner et al., 2000), the results of this study are of general interest for the detection of the origin and evolution of supernumerary chromosomes, since the results obviously present the major part of the DNA-composition of the largest supernumerary chromosomes, so far found in vertebrates. Analyses of meiotic chromosomes show that the B chromosome behaves as autopaired ring chromosome in diakineses. Using DNA-flow measurements, the contribution of the especially large B chromosome to the DNA content of A. alburnus could be determined and fishes could be analysed on the presence of the supernumerary chromosome, by sacrificing them. This could in future be circumvented by the use of sequence information about the B chromosome and the possibility of constructing special PCR-primers (minimal-invasive fin-test).

Universiẗat, Diss., 2001--Würzburg.

In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 5-Methylcytosin Immunofärbung zytogenetische Analysen an Metaphasechromosomen aus der Mitose, an Interphase-Zellen verschiedener Organe und an Meiose-Stadien der Maus (Mus musculus) zur Detektion hypermethylierter DNA durchgeführt. Zusätzlich erfolgte eine C-Bänderung an Metaphasechromosomen und Meiose-Stadien zum Nachweis von konstitutivem Heterochromatin. / In the present work, 5-methylcytosine immunostaining was used to perform cytogenetic analysis on metaphase chromosomes from mitosis, on interphase cells from various organs and on meiotic stages of the mouse (Mus musculus) to detect hypermethylated DNA. In addition, C-banding was performed on metaphase chromosomes and meiosis stages to detect constitutive heterochromatin.

The microphthalmia with linear skin defects syndrome (MLS) is an X-linked dominant disorder with male lethality. In the majority of the patients reported, the MLS syndrome is caused by segmental monosomy of the Xp22.3 region. To date, five male patients with MLS and 46,XX karyotype (“XX males”) have been described. Here we report on the first male case with MLS and an XY complement. The patient showed agenesis of the corpus callosum, histiocytoid cardiomyopathy, and lactic acidosis but no microphthalmia, and carried a mosaic subtle inversion of the short arm of the X chromosome in 15% of his peripheral blood lymphocytes, 46,Y,inv(X)(p22.13∼22.2p22.32∼22.33)[49]/46,XY[271]. By fluorescence in situ hybridization (FISH), we showed that YAC 225H10 spans the breakpoint in Xp22.3. End-sequencing and database analysis revealed a YAC insert of at least 416 kb containing the genes HCCS and AMELX, and exons 2–16 of ARHGAP6. Molecular cytogenetic data suggest that the Xp22.3 inversion breakpoint is located in intron 1 of ARHGAP6, the gene encoding the Rho GTPase activating protein 6. Future molecular studies in karyotypically normal female MLS patients to detect submicroscopic rearrangements including the ARHGAP6 gene as well as mutation screening of ARHGAP6 in patients with no obvious chromosomal rearrangements will clarify the role of this gene in MLS syndrome. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Diffuse großzellige B-Zell Lymphome stellen weltweit die größte Gruppe maligner B-Zell Non-Hodgkin-Lymphome dar und umfassen eine biologisch, genetisch und klinisch heterogene Gruppe lymphoider Tumoren, die als Hauptmerkmal große transformierte B-Lymphozyten mit vesikulären Kernen und prominenten Nukleoli aufweisen. Nur ungefähr 40% der Patienten zeigen ein Ansprechen auf eine konventionelle Chemotherapie. Um von einer präziseren Prognose profitieren zu können, ist eine reproduzierbare Klassifizierung dieser „inhomogenen Entität“ nicht nur für die Betroffenen wünschenswert. Dadurch könnten Krankheitsverläufe genauer vorhergesagt und die Therapie optimiert werden. Während akute Leukämien häufig mit einer Translokation assoziiert sind, zeigt sich bei B-Zell-Lymphomen ein weitaus komplexeres Bild an zytogenetischen Aberrationen. Diese werden einerseits mit der Etablierung des malignen Phänotyps, andererseits mit der Tumorprogression und der klonalen Evolution eines Tumors in Verbindung gebracht. Obwohl die meisten Neoplasien rekurrente und Tumor-spezifische klonale chromosomale Aberrationen aufweisen, ist es noch nicht gelungen, durch Etablieren genetischer „Marker“ eine zuverlässige Aussage über Verlauf und Ansprechen und damit über die Prognose dieser Erkrankung zu machen. Solche Aussagen sind bis dato nur auf Basis allgemeiner klinischer Parameter wie dem Allgemeinzustand der Patienten und der Höhe der Lactat-Dehydrogenase (LDH) im Serum gesichert möglich, die neben anderen Parametern im „International Prognostic Index“ zusammengefasst sind. Zytogenetische, molekulargenetische und in den letzten Jahren auch Hochdurchsatz-Untersuchungen, wie z.B. die Mikroarray-Technologie, haben bereits zu einem besseren Verständnis dieser molekularen Unterschiede geführt. Die WHO-Klassifikation stellt im Hinblick auf die Definition ‚biologischer’ Tumorgruppen einen deutlichen Fortschritt dar. Diese neueren Untersuchungen zeigen auf der Basis des Genexpressionsprofils von diffusen großzelligen B-Zell-Lymphomen die mögliche Unterteilbarkeit dieser diagnostischen Kategorie anhand zweier unterschiedlicher Phänotypen: GC-DLBCL zeigen eine molekulare Signatur, die vergleichbar mit normalen Keimzentrumszellen ist. Die andere Gruppe (ABC-DLBCL bzw. non-GC-DLBCL) entsteht aus Zellen, die die Keimzentrumsreaktion bereits durchlaufen haben. GC- und ABC-DLBCL-Patienten weisen bei einer Anthracyclin-haltigen Chemotherapie (z. B. CHOP) in retrospektiven klinischen Studien einen deutlichen Unterschied in der 5-Jahres-Überlebensrate auf (etwa 60% für GC-DLBCL und 35% für ABC-DLBCL). Somit scheint die Annahme, dass mindestens zwei Entitäten vorliegen, gerechtfertigt. In der vorliegenden Studie konnten das zytogenetische Aberrationsspektrum mittels eines Algorithmus anhand des Genexpressionsprofiles mit zwei verschiedenen Subgruppen – den GC-DLBCL und den non-GC-DLBCL - korreliert werden. Es entstand die bisher umfangreichste zytogenetische Charakterisierung dieser postulierten Phänotypen. Es konnte gezeigt werden, dass GC-DLBCL, die durch die Translokation t(14;18) charakterisiert sind, häufiger Zugewinne bei Chromosom 7 aufweisen, während non-GC-DLBCL mit dem Vorliegen einer Trisomie 3 und Zugewinnen bei 3p und 3q assoziiert sind. Zwei Modelle könnten eine Erklärung für die Assoziation genomischer Instabilitäten mit den unterschiedlichen Genexpressionsprofilen sein. Einerseits könnte eine gewisse Region für die Kodierung eines Schlüsselregulatorgenes verantwortlich sein, welches die Zellbiologie und damit die Genexpression verändert. Andererseits könnten die Subgruppen der DLBCL auf verschiedenem Wege entstehen und somit unterschiedliche Ereignisse für die verschiedenen Aberrationen verantwortlich sein. Es gilt nun, einerseits diese Mechanismen, die zu einer veränderten Genexpression beitragen, aufzudecken und andererseits ein diagnostisches Vorgehen zu etablieren, bei dem beispielsweise nach dem erfolgten Nachweis von Index-Aberrationen eine bestimmte molekulare Signatur überprüft wird. Es ist anzunehmen, dass molekulare Analysen in absehbarer Zeit vermehrt Einzug in den klinischen Alltag halten und therapeutische Entscheidungen mit beeinflussen werden. In Zukunft wird anhand der Expression von Schlüsselgenen die Zuordnung eines Falles in diagnostische Untergruppen erfolgen. Außerdem könnte durch Peptidblockade dieser Schlüsselgene eine zusätzliche Therapieoption bestehen – eine Vermutung, die weitere Studien erforderlich macht. / Diffuse large B-Cell Lymphoma consist of a biologically, genetically and clinically heterogenetic entity of lymphopid tumors which common feature are blastic transformed B-Lymphoytes with vesicular nuclei and prominent nucleoli. Only 40% of the patients show a remission after an anthrcyclin-containing chemotherapy regimen. To benefit from a precise diagnosis, a reproducible classification is mandatory. While leukemia often is assiciated with a single genetic alteration such as a translocation, B-Cell lymphoma show a complex pattern of zytogenetic aberrations. So far there has been no success in estabishing a genetic "marker" which allows a prognosis. Newer studies based on microarray technology show two different phenotypes though: GC-DLBCL consist of cells originating in the germinal centre while ABC-DLBL (or non-GC-DLBL) have already undergone the germinal centre reaction and show a significantly worse 5-year-overall survival. The former are associated with the t(14;18) translocation while the latter show more often trisomy 3 and gains of chromosome 3q and 3p. These results could help subtyping of genetically distinct DLBL and reveal genes playing a key role in tumorigenesis.

The microphthalmia with linear skin defects syndrome (MLS) is an X-linked dominant disorder with male lethality. In the majority of the patients reported, the MLS syndrome is caused by segmental monosomy of the Xp22.3 region. To date, five male patients with MLS and 46,XX karyotype (“XX males”) have been described. Here we report on the first male case with MLS and an XY complement. The patient showed agenesis of the corpus callosum, histiocytoid cardiomyopathy, and lactic acidosis but no microphthalmia, and carried a mosaic subtle inversion of the short arm of the X chromosome in 15% of his peripheral blood lymphocytes, 46,Y,inv(X)(p22.13∼22.2p22.32∼22.33)[49]/46,XY[271]. By fluorescence in situ hybridization (FISH), we showed that YAC 225H10 spans the breakpoint in Xp22.3. End-sequencing and database analysis revealed a YAC insert of at least 416 kb containing the genes HCCS and AMELX, and exons 2–16 of ARHGAP6. Molecular cytogenetic data suggest that the Xp22.3 inversion breakpoint is located in intron 1 of ARHGAP6, the gene encoding the Rho GTPase activating protein 6. Future molecular studies in karyotypically normal female MLS patients to detect submicroscopic rearrangements including the ARHGAP6 gene as well as mutation screening of ARHGAP6 in patients with no obvious chromosomal rearrangements will clarify the role of this gene in MLS syndrome. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Spectral karyotyping (SKY) is a widely used methodology to identify genetic aberrations. Multicolor fluorescence in situ hybridization using chromosome painting probes in individual colors for all metaphase chromosomes at once is combined with a unique spectral measurement and analysis system to automatically classify normal and aberrant chromosomes. Based on countless studies and investigations in many laboratories worldwide, numerous new chromosome translocations and other aberrations have been identified in clinical and tumor cytogenetics. Thus, gene identification studies have been facilitated resulting in the dissection of tumor development and progression. For example, different translocation partners of the TEL/ETV6 transcription factor that is specially required for hematopoiesis within the bone marrow were identified. Also, the correct classification of complex karyotypes of solid tumors supports the prognostication of cancer patients. Important accomplishments for patients with genetic diseases, leukemias and lymphomas, mesenchymal tumors and solid cancers are summarized and exemplified. Furthermore, studies of disease mechanisms such as centromeric DNA breakage, DNA double strand break repair, telomere shortening and radiation-induced neoplastic transformation have been accompanied by SKY analyses. Besides the hybridization of human chromosomes, mouse karyotyping has also contributed to the comprehensive characterization of mouse models of human disease and for gene therapy studies. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.