Le palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) est une espèce fruitière dioïque tropicale qui revêt une importance capitale sur le plan alimentaire, socio-économique et écologique pour les régions arides du globe. Malgré l'intérêt de disposer d'un outil moléculaire pour discriminer les plante s mâles et femelles pour les programmes d'amélioration génétique, aucun marqueur spécifique du sexe n'a été identifié et validé à ce jour. Afin de pouvoir étudier et comprendre le déterminisme sexuel du palmier dattier, nous avons entrepris la description et la caractérisation des processus cellulaires et moléculaires associés à la différenciation des organes sexuels. L'étude histologique du développement reproducteur a montré que le bourgeon floral est d'apparence bisexuelle jusqu'à l'initiation des primordia de l'androcée et du gynécée. Le premier dimorphisme sexuel observé à ce stade correspondant à un gynécée plus large dans les fleurs femelles résulterait d'une activité mitotique plus importante dans les cellules du gynécée fertile par rapport à son équivalent non fonctionnel. Les organes sexuels stériles, staminodes et pistillodes, cessent ensuite leur développement et présentent une différentiation incomplète. Des études d'hybridation in situ de l'expression du gène codant l'histone H4, marqueur de l'activité mitotique, ont montré que le blocage du développement des staminodes et des pistillodes serait dû à un arrêt des divisions cellulaires. Nos investigations de l'intégrité cellulaire par des observations en microscopie électronique à transmission et par coloration de l'ADN confirmeraient que l'avortement des organes stériles ne résulte pas d'un processus de dégradation cellulaire et nucléaire. De plus, l'étude de la méthylation de l'ADN par immunodétection des cytosines méthylées révèle que, par rapport aux organes fertiles, les pistillodes et les staminodes se distinguent par leur niveau plus élevé de méthylation. Ces résultats sont en cohérence avec la réversibilité du blocage de ces organes observés in planta ou in vitro en réponse à une induction hormonale. L'ensemble de ces données montrent que l'unisexualisation des fleurs de palmier dattier est associée à une hyperméthylation globale de l'ADN suivi d'un arrêt des divisions cellulaires dans les organes sexuels stériles. Cette étude a permis d'améliorer nos connaissances sur les mécanismes qui gouvernent la différenciation des organes sexuels et permettra d'ouvrir des perspectives pour l'identification de marqueurs moléculaires du sexe chez le palmier dattier. / The date palm (Phoenix dactylifera L.) is a dioecious tropical fruit crop plant which has vital dietary, socio-economic and ecological importance in arid regions of the world. Despite the interest of developing molecular tools to discriminate male and female plants for the benefit of biodiversity preservation and genetic improvement programs, no sex-specific markers have been identified and validated to date. To study and understand the sex determination of date palm, we undertook to characterise the cellular and molecular processes underlying sex organ differentiation in this plant.A histological study of date palm reproductive development showed that the immature flower is bisexual in appearance until the initiation of the androecium and gynoecium. The first sign of sexual dimorphism is observed at this stage, namely a wider gynoecium in female flowers resulting from greater mitotic activity in the functional gynoecium of female flowers compared to the pistillode of male ones. The sterile sex organs (pistillode and staminodes) were observed to cease their development by progressive loss of cell proliferation and ultimately displayed incomplete differentiation.Cell division patterns and the nuclear integrity of reproductive organs were investigated respectively by RNA in situ hybridization to a histone H4 gene probe and by DNA coloration combined with scanning electron microscopy. The results obtained revealed an absence of cell cycle activity and nuclear degradation in the residual sex organs. In addition, a study of DNA methylation, by immunodetection of methylated cytosines revealed that compared to the fertile reproductive organs, staminodes and pistillodes displayed relatively high levels of global DNA methylation. These results are consistent with the observed reversibility of sterile organ developmental arrest observed in planta or in vitro in response to hormonal induction. Overall, these data demonstrate that the floral unisexuality of date palm is characterized by cell cycle arrest, higher DNA methylation in sterile sexual organs and an absence of cell degeneration rather than a cell death process. This study has improved our understanding of the mechanisms that govern the differentiation of sex organs and forms a useful starting point for research on the identification of molecular markers of sex determination in date palm.Kewords: Date palm - flower - sex determination - cell cycle - DNA methylation

Chez l’embryon précoce, une vague de reprogrammation majeure survient et permet de réinitialiser les profils de méthylation d’ADN de l’ensemble du génome. Lors de cette reprogrammation, les régions différentiellement méthylées (DMRs) (i.e., gènes empreintes) doivent toutefois être protégées de la déméthylation par une action continue de DNMT1 (Méthyltransférase d’ADN 1) pour assurer le développement adéquat de l’épigénome du fœtus. Sachant que l’induction d’une perte temporaire d’expression de Dnmt1 dans un modèle de cellules souches embryonnaires de souris entraîne la perte permanente des patrons de méthylation d’ADN aux régions DMRs et DMR-like, mon projet de recherche vise à comprendre pourquoi ces régions sont incapables de retrouver leurs patrons de méthylation d’ADN initiaux. Notre hypothèse est qu’une adaptation épigénétique (i.e. réarrangement erroné de certaines modifications d’histones) survient aux régions régulatrices de l’expression des gènes (promoteurs et enhancers) et empêche directement ou indirectement le retour au paysage épigénétique initial aux régions affectées. L’objectif du projet est donc de précisément définir comment la perte temporaire de Dnmt1 remodèle le paysage épigénétique aux régions promotrices (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, méthylation d’ADN) et comment les adaptations épigénétiques sont associées avec des changements de l’expression des gènes (ex : gènes des régions DMRs et DMRs-like). / In early embryos, a major reprogramming wave occurs and permits to reset DNA methylation profiles genome-wide. During the reprogramming wave, differentially methylated regions (DMRs) (imprinted genes) must be protected from demethylation by the continuous action of DNMT1 (DNA Methyltransferase 1) to ensure the proper development of the foetal epigenome. As the induction of a temporary loss of Dnmt1 expression in a mouse embryonic stem cell model leads to permanent losses of DNA methylation at DMR and DMR-like regions, my project aims to understand why those regions are unable to re-establish their initial DNA methylation patterns. Our hypothesis is that an epigenetic adaptation (erroneous rearrangement of certain histone modifications) occurs at regulatory regions controlling gene expression (promoters and enhancers) and impede directly or indirectly the affected regions to return to their initial epigenetic landscape. The goal of this project is thus to define how the temporary loss of Dnmt1 remodels the epigenetic landscape at promoter regions (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K4me1, H3K9me3, DNA methylation) and how the epigenetic adaptations are associated with changes in gene expression (ex: genes in DMR and DMR-like regions).

Au cours du développement précoce de l'embryon, une importante vague de reprogrammation épigénétique efface et rétablit les profils de méthylation d’ADN (metADN) à travers le génome. Cependant, des régions spécifiques telles que les gènes à empreinte doivent échapper à cette vague de reprogrammation et maintenir leurs profils de metADN précis par l’activité constante de l’enzyme DNMT1 (ADN méthyltransférase 1) pour assurer le bon développement embryonnaire. En utilisant un modèle de cellules souches embryonnaires (mES) de souris avec une répression inductible de Dnmt1 (Dnmt1tet/tet), nous avons précédemment montré que la perte temporaire de Dnmt1 déclenche la perte permanente des profils de metADN sur les régions à empreinte et régions similaires, ainsi que sur d'autres régions du génome. Nous ne comprenons toujours pas pourquoi certaines séquences génomiques sont incapables de rétablir leurs profils de metADN normaux après la ré-expression de Dnmt1, et comment d'autres marques épigénétiques (e.g. les modifications des histones) sont altérées. Notre hypothèse est qu’un réarrangement erroné des marques d’histones aux régions promotrices, suivant une perte temporaire du maintien de la méthylation d’ADN par DNMT1, empêchera l’expression normale dans les cellules souches embryonnaires de souris. Pour ce faire, nous avons collecté des cellules mES Dnmt1tet/tet avant l'inactivation de Dnmt1, après l'inactivation de Dnmt1, puis après la réactivation complète de l'expression de Dnmt1. Nous avons ensuite utilisé la technique ChIP-Seq pour les marques d'histones (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3, H3K4me1), celle de RRBS pour la méthylation de l'ADN et la technique de RNA-Seq pour l'expression des gènes. En définissant une liste de 18 166 promoteurs uniques, nous les avons classés en quatre catégories (Actif, Bivalent, Déplété et Réprimé). Nous montrons que l'inactivation de Dnmt1 mène à une dérégulation drastique des marques d'histones à travers les types de promoteurs. Cependant, lors de la réactivation de Dnmt1, la plupart de ces défauts ont été corrigés. Pourtant, dans l’ensemble des catégories, nous observons des promoteurs avec des dysrégulations persistantes des marques d'histones ainsi qu'un nombre significatif de gènes avec une expression différentielle. Dans l'ensemble, nos résultats montrent qu'une absence temporaire de DNMT1 a un impact plus important sur la conservation des profils des marques d'histones et l'expression des gènes que sur le maintien des profils de metADN sur les régions promotrices, dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cela suggère que l'absence temporaire de maintien de la méthylation d’ADN déclenche une série d'événements qui conduisent à des dérégulations permanentes de marques d'histones aux promoteurs, lesquelles ne sont pas directement associés aux altérations sous-jacentes de la méthylation d’ADN dans les régions promotrices. / During early embryo development, a major epigenetic reprogramming wave erases and re-establishes DNA methylation (DNAmet) profiles across the genome. However, specific regions such as imprinting loci must escape this reprogramming wave and maintain their precise DNAmet profiles by constant DNMT1 (DNA methyltransferase 1) activity to ensure the proper development. Using a mouse embryonic stem (mES) cell model with inducible Dnmt1 repression (Dnmt1tet/tet), we previously showed that the temporary loss of Dnmt1 triggers the permanent loss of DNAmet profiles on imprinted and imprinted-like regions, as well as on other regions across the genome. We still do not understand why particular genomic sequences are unable to re-establish their normal DNAmet profiles following Dnmt1 re-expression, and how other epigenetic marks (e.g., histone modifications) are altered. Our hypothesis is that an erroneous rearrangement of histone marks on promoter regions following a temporary lack of DNAmet maintenance by DNMT1 will prevent proper gene expression in mouse embryonic stem cells. To test this, we collected mESDnmt1tet/tet cells prior to Dnmt1 inactivation, after Dnmt1 inactivation, and following complete reactivation of Dnmt1 expression. We then performed ChIP-Seq for histone marks (H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac, H3K9me3, H3K4me1), RRBS for DNA methylation and RNA-Seq for gene expression. By defining a list of 18 166 unique promoters we categorized them in four categories (Active, Bivalent, Depleted and Repressed). We show that inactivation of Dnmt1 lead to drastic dysregulation of histone marks across types of promoters. However, upon reactivation of Dnmt1, most of these defects were rescued. Still, across categories, we observe promoters with persistent histone mark dysregulations as well as a significant number of associated genes with differential expression. Overall, our results show that a temporary lack of DNMT1 has a greater impact on the conservation of histone mark profiles and gene expression than it has on the maintenance of DNAmet profiles on promoter regions in mouse embryonic stem cells. This suggests that the temporary lack of methylation maintenance triggers a series of events that leads to the permanent dysregulation of histone marks in promoter regions, which are not directly associated with underlying DNA methylation alterations in the promoter regions.

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