Einleitung Rodentibacter (R.) pneumotropicus und R. heylii sind wichtige Pneumonie-, Otitis- und Mastitiserreger in Labormäusen. Auf Grund der hohen Prävalenz und Relevanz für tierexperimentelle Studien sind gut etablierte diagnostische Methoden entscheidend. Die bisherigen Möglichkeiten der Diagnostik sind jedoch nicht zufriedenstellend. Auch die Differenzierung zu Muribacter (M.) muris, einer apathogenen Pasteurellaceae, ist nicht mit allen Methoden möglich. Die Pathogenese von Infektionen mit Rodentibacter spp. ist bis heute nicht endgültig beschrieben und auch Virulenzfaktoren sind nur in Form rekombinanter Proteine in vitro untersucht. Ziele der Untersuchung Diese Doktorarbeit verfolgte die Ziele, den direkten Erregernachweis wichtiger muriner Pasteurellaceae über MALDI-TOF MS zu etablieren und zu evaluieren und indirekte spezifische und sensitive Nachweisverfahren (ELISA) von Labormausinfektionen mit R. pneumotropicus und R. heylii im Rahmen eines Verbundprojektes zu entwickeln. Des Weiteren sollte ein neu identifiziertes Immunogen eines hochvirulenten R.-heylii-Stammes geno- und phänotypisch analysiert und charakterisiert werden. Material und Methoden In der ersten Publikation wurden Feldisolate und Referenzstämme der Spezies R. pneumotropicus, R. heylii, R. ratti und M. muris mittels 16S rRNA identifiziert und daraus Referenzspektren zur Erweiterung der MALDI-TOF MS-Datenbank erstellt. Die Evaluierung fand mittels Abgleiches mit einer etablierten Multiplex-PCR und bereits publizierter Stämme statt. Für die zweite Publikation wurden BALB/c- und C57BL/6-Mäuse mit R. heylii SF27GVG oder M. muris infiziert. Als Readout Parameter wurde ein klinischer und pathologischer Score eingesetzt. Weiterhin erfolgte eine quantitative oder semiquantitative bakteriologische Untersuchung unterschiedlicher Gewebe und Körperflüssigkeiten sowie eine serologische Untersuchung auf Serokonversion mit unterschiedlichen ELISAs. Das durch Immunoproteomics identifizierte R. heylii Immunogen A (RhiA) wurde nach in silico Analysen in trunkierter Form rekombinant exprimiert und zur Etablierung eines ELISA genutzt. Die phänotypische Charakterisierung fand mittels Western Blot, Durchflusszytometrie und Immunhistochemie statt. Hierfür wurde ein RhiA-spezifischer IgY-Antikörper eingesetzt. In der dritten Publikation wurde das Protein CARLO-1 kloniert und rekombinant exprimiert. Der neu etablierte ELISA wurde mit Hilfe von Rekonvaleszenzseren verschiedener Tierversuche evaluiert und außerdem die Konservierung des entsprechenden Gens in R. heylii und R. pneumotropicus-Stämmen analysiert. In der vierten Studie wurde das für BALB/c-Mäuse bereits etablierte R. pneumotropicus Infektionsmodell eingesetzt, um die Schutzwirkung einer Inaktivatvakzine vor einer Infektion der Lunge mit diesem Pathogen zu ermitteln. Ergebnisse Die erweiterte MALDI-TOF MS-Datenbank ermöglicht eine sichere Differenzierung zwischen R. heylii, R. pneumotropicus, R. ratti und M. muris, wie die Übereinstimmungen zu Ergebnissen der Multiplex-PCR zeigen. Im Tierversuch zeigte sich, dass R. heylii SF27GVG hoch virulent ist, obwohl dieser Stamm keines der bekannten RTX-Proteine trägt. Das identifizierte Immunogen RhiA dieses Stammes liegt oberflächenassoziiert vor, wird in vitro und in vivo exprimiert und hat strukturelle Ähnlichkeiten zu PnxIII. Es kann in infizierten Lungen assoziiert mit Bakterienrasen nachgewiesen werden und ist als RTX-Adhäsin möglicher Weise an der Biofilmproduktion beteiligt. RhiA ist hoch spezifisch für R. heylii (ELISA-Spezifität 100%). Es wird aber nur von wenigen der untersuchten Stämme gebildet. Der CARLO-1-ELISA zeigt eine Sensitivität von 93,3% und eine Spezifität von 100%. Das kodierende Gen ist in allen untersuchten R. heylii und R. pneumotropicus-Stämmen konserviert. Mit dem in einer vorausgegangenen Dissertation etablierten R. pneumotropicus Infektionsmodell konnte die protektive Wirkung einer neuen Inaktivatvakzine erfolgreich bestätigt werden. Schlussfolgerungen Nach Erweiterung der Datenbank können R. heylii, R. pneumotropicus und M. muris mittels MALDI-TOF MS differenziert werden. RhiA ist ein hochspezifisches, repetitives, Oberflächen-assoziiertes und in Lungenläsionen exprimiertes RTX-Immunogen, das von einem hochvirulenten R.-heylii-Pathotyp gebildet wird. Durch die Unterstützung von Kooperationspartnern konnte der CARLO-1-ELISA als spezifisches und sensitives indirektes Nachweisverfahren für Infektionen mit R. pneumotropicus oder R. heylii etabliert und evaluiert werden. Weiterhin wurde erstmalig gezeigt, dass sich mit dem R. pneumotropicus Infektionsmodell die protektive Wirkung einer Inaktivatvakzine aufzeigen lässt.:I. Inhaltsverzeichnis I II. Abkürzungsverzeichnis III 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Taxonomie 2 2.1.1 Pasteurellaceae 2 2.1.2 Rodentibacter spp. 5 2.1.3 Muribacter muris 5 2.2 Klinik und Virulenzfaktoren 7 2.2.1 Pasteurellaceae 7 2.2.2 Rodentibacter heylii und Rodentibacter pneumotropicus 11 2.3 Diagnostik 13 2.3.1 Pasteurellaceae 13 2.3.1.1 Monitoring 13 2.3.1.2 Direkte Diagnostik 14 2.3.1.3 Indirekte Diagnostik 20 2.3.2 Rodentibacter heylii und Rodentibacter pneumotropicus 22 2.3.3 Muribacter muris 23 3 Publikationen 25 3.1 Differentiation of Rodentibacter pneumotropicus, Rodentibacter heylii and Muribacter muris by MALDI-TOF MS 25 3.2 Identification of a large repetitive RTX immunogen in a highly virulent Rodentibacter heylii strain 31 3.3 Sensitive and immunogen-specific serological detection of Rodentibacter pneumotropicus infections in mice 43 3.4 Low-Energy Electron Irradiation Efficiently Inactivates the Gram-Negative Pathogen Rodentibacter pneumotropicus—A New Method for the Generation of Bacterial Vaccines with Increased Efficacy 57 4 Diskussion 69 5 Zusammenfassung 75 6 Summary 77 7 Literaturverzeichnis 79 8 Anhang 93 8.1 Anhang zu „Identification of a large repetitive RTX immunogen in a highly virulent Rodentibacter heylii strain” 93 8.2 Anhang zu “Sensitive and immunogen-specific serological detection of Rodentibacter pneumotropicus infections in mice“ 102 8.3 Anhang zu “Low-Energy Electron Irradiation Efficiently Inactivates the Gram-Negative Pathogen Rodentibacter pneumotropicus—A New Method for the Generation of Bacterial Vaccines with Increased Efficacy” 123 Danksagung 125