Calcium, a pivotal ion in various human signaling pathways, holds significant relevance in cancer research and treatment. Investigating the transmission of spontaneous calcium signals between cells and understanding how they are influenced by different treatments is therefore an interesting area of study. This master's thesis presents a newly developed tool designed for analyzing intracellular calcium concentration [Ca2+] fluctuations. The tool encompasses a cell segmentation model, tracking algorithms, nearest neighbor identification, mean intensity measurement, and calculations of dominant frequency of [Ca2+] oscillations and signal correlation among neighboring cells. The tool was applied to fluorescence microscopy images of Madin-Darby Canine Kidney II cells expressing GCaMP6m and either treated with the cardiac glycoside ouabain, a combination of ouabain and the gap junction blocker heptanol, or left untreated for comparison. Additionally, an exploration into the impact of connexin 43 (Cx43) transfection on [Ca2+] fluctuations was undertaken. The transfection rate for Cx43 did not reach a sufficient level, impeding a thorough analysis of its influence on [Ca2+] fluctuations. Furthermore, the investigation into dominant frequencies and signal correlation did not yield conclusive findings regarding the effects of ouabain and heptanol. Nevertheless, a foundational tool for analysis has been developed, with the potential for expansion to analyze more aspects calcium signaling and application to additional cell types and treatments. / Kalcium, en central jon i olika signalvägar hos människan, spelar en viktig roll inom cancerforskning och -behandling. Att undersöka överföringen av spontana kalciumsignaler mellan celler och förstå hur dessa påverkas av olika behandlingar är därav ett intressant studieområde. I denna masteruppsats presenteras ett nyutvecklat verktyg utformat för att analysera variationer i intracellulär kalciumkoncentration [Ca2+] . Verktyget omfattar en cellsegmenteringsmodell, spårningsalgoritmer, identifiering av närmaste grannar, medelintensitetsmätning, beräkningar av dominant frekvens för oscillationer i [Ca2+] samt korrelation i dessa variationer mellan närliggande celler. Verktyget tillämpades på fluorescensmikroskopibilder av Madin-Darby Canine Kidney II-celler som uttryckte GCaMP6m och antingen hade behandlats med hjärtglykosiden ouabain, en kombination av ouabain och gap junction-blockeraren heptanol eller lämnats obehandlade för jämförelse. Dessutom undersöktes hur variationerna i [Ca2+] påverkades om cellerna transfekterades med konnexin 43 (Cx43). Andelen celler per prov som genomgick lyckad transfektion av Cx43 nådde aldrig upp till önskade nivåer, vilket förhindrade närmare analys av påverkan på [Ca2+]. Undersökningen av dominanta frekvenser och korrelation i signaler gav inte heller några entydiga svar på hur ouabain och heptanol påverkar [Ca2+]. Likväl har ett grundläggande verktyg för analys utvecklas, som har potential att utvidgas till analys av fler aspekter av kalciumsignalering och tillämpning på fler celltyper och behandlingar.

Calcium ions are one of the most versatile signalling molecules. They are essential tothe proper functioning of various cellular processes in many different types of cells.The calcium signals have been studied in the past using ratiometric dyes like Fura-2.We showed that the genetically encoded calcium indicator GCaMP6m displays highersignal to noise ratio than Fura Red and therefore used it to study the calcium cytosolicconcentration in MDCK II cells. We use fluorescence microscopy to record and Pythonto analyse calcium signals in individual cells. Cellpose was used for automating thesegmentation. The cells were treated with ouabain, a cardiotonic steroid shown toincrease the intercellular communication between cells through gap junctions. Thecells were also transfected with connexins 43. We showed that ouabain does nothave an impact on the number of calcium peaks. We observed higher correlationsin the calcium between adjaçent transfected cells, but the results are not statisticallysignificant. We also observed clearly defined oscillations in one low confluencerecording with a period of around two minutes. / Kalciumjonen är en av de mest mångsidiga signalmolekylerna. De är nödvändiga förfunktionen av diverse cellulära processer i mångaolika typer av celler. I projektet studerades den cytosoliska kalciumkoncentrationeni MDCK II-celler. Fluorescensmikroskopi användes för att registrera, och Python föratt analysera, kalciumsignaler i enskilda celler. Cellpose användes för att automatiserasegmenteringen. Cellerna behandlades med ouabain, en kardiotonisk steroid somvisat sig öka den intercellulära kommunikationen mellan celler genom ”gap junctions”.Cellerna transfekterades också med connexin-43. Det påvisades att ouabain intehar någon inverkan på antalet kalciumtoppar. Högre korrelationer observeradesi kalcium mellan intilliggande celler som transfekterats, men resultaten är intestatistiskt relevanta. Tydligt definierade oscillationer observerades i en inspelning medlåg konfluens i en period på cirka två minuter. Slutligen visades att GCaMP6m har etthögre signal-brusförhållande än Fura Red.

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Veronika Křečková Supervisor: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Title of diploma thesis: Role of drug transporters in placental transfer of entecavir Entecavir (ETV), an analogue of guanosine, is a highly efficient anti-hepatitis B antiviral drug. It is the first-line therapy for both adults and children. Its use in pregnancy is limited due to a number of factors, including lack of data on placental pharmacokinetics. The placental transition of drugs is frequently controlled by drug transporters. ATP-binding (ABC) transporters, P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (BCRP) or multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) localized in the apical membrane of syncytiotrophoblast and pumping their substrates in the feto-maternal direction belong to most significant determinants of placental pharmacokinetics. Moreover placental transport of nucleoside-derived drugs can be affected by the activity of nucleoside transporters (NTs); equilibrative nucleoside transporters (ENTs) mediate facilitated diffussion, while the concentrative nucleoside transporters (CNTs) control active influx of their substrates. The aim of the diploma thesis was to describe the role of P-gp, BCRP, MRP2 and NTs (ENTs and...

Einleitung Der intensive Einsatz von Pflanzenschutzmitteln in der konventionellen Landwirtschaft kann zum Eintrag von Rückständen in die Nahrungskette führen. Milchliefernde Rinder nehmen Pflanzenschutzmittelrückstände mit dem Futter auf, die durch aktive Sekretion in die Milch eine Gefährdung für sensible Bevölkerungsgruppen, wie Kinder, verursachen könnten. Die in nationalen Rückstandskontrollen untersuchten Milchproben unterschreiten zwar in der Regel die gesetzlich festgelegten Höchstgrenzen (Maximum Residue Level, MRL), jedoch kann eine andauernde Belastung mit Pflanzenschutzmitteln die Entstehung chronischer Erkrankungen, wie Morbus Parkinson und Kinderleukämie, fördern. Im Rindereuter stellt der ATP-binding cassette Transporter der Subfamilie G2 (ABCG2) den wichtigsten Transportweg für Fremdstoffe in die Milch dar. Mit seinem breiten Substratspektrum ist der bovine ABCG2-Transporter (bABCG2) in der Lage, unterschiedliche Substrate in die Kuhmilch zu transportieren. Jedoch ist bislang unklar, ob auch Pflanzenschutzmittel bABCG2-vermittelt in die Milch sezerniert werden können und ob die gleichzeitige Aufnahme mehrerer Rückstände die bABCG2-Effluxaktivität beeinflusst. Ziele der Untersuchungen Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Pflanzenschutzmitteln als mögliche Substrate des bovinen Effluxtransporters. Weiterhin wurde untersucht, ob zwischen zwei Wirkstoffen synergistische oder antagonistische Effekte am bABCG2-Transporter auftreten. Material und Methoden Es wurden 14 häufig in der konventionellen Landwirtschaft eingesetzte Pflanzenschutzmittel in 0,1-, 1- und 10-facher MRL-Konzentration, in Bezug auf essbare Gewebe von Rindern, untersucht. Weiterhin wurden sechs Kombinationen aus jeweils zwei Wirkstoffen ausgewählt. Im WST-1 (Water Soluble Tetrazolium 1) Assay wurden MDCKII-bABCG2-Zellen in aufsteigender Konzentration mit den Pflanzenschutzmitteln inkubiert (72 h) und die Zellvitalität ermittelt. Nach Inkubation der MDCKII-bABCG2- und MDCKII-Mock-Zellen mit den ausgewählten Pflanzenschutzmitteln oder den Kombinationen (4 h) wurde der Hoechst 33342-Akkumulationsassay durchgeführt. Dabei führt eine Interaktion des Pflanzenschutzmittels mit dem bABCG2-Transporter zu einer intrazellulären Anreicherung des Hoechst 33342-Farbstoffes. Für die Identifikation signifikanter Unterschiede wurden jeweils mindestens zwölf Monolayer auf Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) überprüft und eine Einweg-Varianzanalyse mit Holm-Šidák post hoc Test (p ≤ 0,05) durchgeführt. Ergebnisse Nachdem eine Beeinträchtigung der Zellvitalität durch die ausgewählten Pflanzenschutzmittel in 0,1- bis 10-facher MRL-Konzentration ausgeschlossen wurde, konnte im Hoechst 33342-Assay für Chlorpyrifos-methyl und Tebuconazol ab 0,1-facher MRL-Konzentration eine signifikante Zunahme der intrazellulären Hoechst 33342-Gehalte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nachgewiesen werden. Für Diflufenican, Glyphosat, Methiocarb, Prochloraz, Rimsulfuron sowie Thiacloprid konnte in 1- und 10-facher MRL-Konzentration und für Iprodion sowie Ioxynil in 10-facher MRL-Konzentration eine signifikant erhöhte Hoechst 33342-Anreicherung detektiert werden. Darüber hinaus führte eine gleichzeitige Applikation von Methiocarb und Chlorpyrifos-methyl in 1-facher MRL-Konzentration, sowie von Glyphosat und Rimsulfuron in 10-facher MRL-Konzentration zu einer synergistischen Steigerung der Farbstoffakkumulation. Schlussfolgerung Es konnte festgestellt werden, dass das MDCKII-Zellmodell in Kombination mit dem Hoechst 33342-Assay eine valide Methode darstellt, um Wechselwirkungen einzelner und kombinierter Pflanzenschutzmittel zu detektieren. Insgesamt konnten unterhalb gesetzlich festgelegter MRL-Werte acht Pflanzenschutzmittel als potentielle bABCG2-Substrate identifiziert, sowie additive Effekte von Wirkstoffkombinationen nachgewiesen werden. Durch die Aufnahme von Pflanzenschutzmitteln mit dem Futter könnten diese aktiv in die Milch sezerniert werden und somit eine Gefahr für den Verbraucher darstellen:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Überblick über Membrantransporter 4 2.2 ABCG2-Effluxtransporter 5 2.2.1 Überblick 5 2.2.2 Struktur 6 2.2.3 ABCG2-Transportmechanismus 8 2.2.4 Spezifität der ABCG2-Substrate und Inhibitoren 9 2.2.5 Gewebeexpression 11 2.2.6 Bedeutung 12 2.2.7 Regulation der ABCG2-Transportaktivität 14 2.3 Fremdstoffsekretion der bovinen Milchdrüse 16 2.3.1 Funktionelle Anatomie 16 2.3.2 Transportmechanismen 16 2.3.3 Fremdstofftransporter 17 2.3.4 Bedeutung des ABCG2-Transporters 19 2.4 Pestizide 20 2.4.1 Überblick 20 2.4.2 Einsatz von Pflanzenschutzmitteln 21 2.4.3 Rechtliche Regelungen 21 2.4.4 MRL-Wert-Festsetzung von Pestiziden 22 2.4.5 Exposition des Verbrauchers 23 2.4.6 Gesundheitliche Risiken 24 2.4.7 Pestizide als endokrine Disruptoren 25 2.4.8 Mehrfachrückstände 26 2.4.9 Risikobewertung von Mehrfachrückständen 27 2.5 Problemstellung und Zielsetzung 29 3 Material und Methoden 30 3.1 Material 30 3.1.1 Pestizide 30 3.1.2 Chemikalien 32 3.1.3 Kit 32 3.1.4 Puffer und Lösungen 32 3.1.5 Zellkultur 33 3.1.6 Geräte 34 3.2 Methoden 35 3.2.1 Allgemeine zellbiologische Methoden 35 3.2.1.1 Kultivierung 35 3.2.1.2 Passagieren 35 3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl 35 3.2.1.4 Kryokonservierung 36 3.2.2 Bestimmung der Zellvitalität mittels WST-1 Zytotoxizitätstest 36 3.2.3 Quantitative Proteinbestimmung mittels BCA-Assay 38 3.2.4 Ermittlung von Interaktionen am bABCG2-Transporter 38 3.2.4.1 Aussaat und Vorbehandlung 39 3.2.4.2 Durchführung des Hoechst 33342-Assays 40 3.2.5 Detektion von Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 41 3.3 Statistik 42 4 Ergebnisse 43 4.1 Auswahl der Pestizide und ihrer Konzentrationen 43 4.2 Auswahl der Pestizidkombinationen 46 4.3 Einfluss der Pestizide auf die Zellvitalität 48 4.4 Interaktionen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 53 4.5 Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 56 5 Diskussion 60 5.1 Zellmodell 60 5.2 Zellvitalitätsstudien in MDCKII-bABCG2-Zellen 61 5.3 Pestizide als potentielle bABCG2-Substrate 64 5.4 Wechselwirkungen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 75 5.5 Risiken potentieller bABCG2-Substrate 79 6 Zusammenfassung 80 7 Summary 82 8 Literaturverzeichnis 84 9 Anhang 106 10 Danksagung 111

Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Beáta Repeľová Supervisor: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Title of diploma thesis: Study of effects of antiretroviral drugs on transmembrane transport of tenofovir disoproxil fumarate across MDCKII - ABCB1 cell monolayer Tenofovir disoproxil fumarate (TDF) - ester prodrug of tenofovir is considered as one of the most frequently used component of combination antiretroviral therapy. Several ways of application and good patients' tolerability is typical for this compound. TDF is a substrate of dug transporter such as P-glycoprotein (P-gp) therefore its efflux activity may limit the bioavailability after oral administration and distribution of TDF. As many of antiretroviral drugs are also substrates or inhibitors of P-gp, drug - drug interactions with TDF at the level of transmembrane transport could be expected. The aim of the diploma thesis was to describe effects of co-administered antiretroviral drugs on transfer of TDF across MDCKII cell monolayer by using bidirectional transport and concentration equilibrium setups. The results of experiments confirmed that TDF is a substrate of P-gp. High values of efflux ratio describing transmembrane transport of TDF across parental cells have been observed. This...